Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

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Biochemistry

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.

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Kim, H., Xue, X. Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining. J. Vis. Exp. (160), e60682, doi:10.3791/60682 (2020).

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Abstract

O estresse oxidativo é um evento importante em condições fisiológicas e patológicas. Neste estudo, demonstramos como quantificar o estresse oxidativo medindo a coloração total de espécies reativas de oxigênio (ROS) usando 2',7'-diclorodihiorescetina diacetato (DCFH-DA) manchando em linhas de células cancerígenas colorretais como exemplo. Este protocolo descreve etapas detalhadas, incluindo a preparação da solução DCFH-DA, a incubação de células com solução DCFH-DA e a medição da intensidade normalizada. A coloração DCFH-DA é uma maneira simples e econômica de detectar ROS nas células. Pode ser usado para medir a geração de ROS após tratamento químico ou modificações genéticas. Portanto, é útil para determinar o estresse oxidativo celular sobre o estresse ambiental, fornecendo pistas para estudos mecanicistas.

Introduction

Três grandes espécies de oxigênio reativo (ROS) produzidas pelo metabolismo celular que são de significado fisiológico são ânion de superóxido, radical hidroxis e peróxido de hidrogênio1. Em baixas concentrações, participam de processos fisiológicos celulares, mas em altas concentrações têm efeitos adversos nas vias de sinalização celular1. Nosso corpo desenvolveu sistemas antioxidantes, que são eficazes contra ros excessivos. No entanto, o estresse oxidativo pode ocorrer quando a ROS sobrecarrega a capacidade desintoxicante do nosso corpo, o que contribui para muitas condições patológicas, incluindo inflamação, câncer e doença neurodegenerativa2,,3,4. O objetivo deste método é determinar o ros celular total em células aderentes usando a coloração de diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). A lógica é que a oxidação de DCFH-DA a 2'-7'dichlororeoresceína (DCF) tem sido usada extensivamente para detecção total de ROS, incluindo radicais hidroxil (•OH) e dióxido de nitrogênio (•NO2). Mecanicamente, DCFH-DA é tomado por células onde esterase celular cleaves fora dos grupos de acetil, resultando em DCFH. A oxidação de DCFH por ROS converte a molécula em DCF, que emite fluorescência verde em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm. Comparado com a detecção de fluorescência com citometria de fluxo e outros métodos alternativos5, as vantagens deste método usando um microscópio de fluorescência e um leitor de placas são que produz imagens fluorescentes claramente visíveis, e é fácil de executar, eficiente e econômico. Este método tem sido amplamente utilizado para detectar ROS celular para estudar várias condições6,,7,8. Este protocolo é usado para detectar ros total em células aderentes. O uso deste método para detectar ROS em células de suspensão pode precisar de algumas modificações.

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Protocol

1. Semeadura celular

  1. Semente 2 x 105 HCT116 células cancerígenas colorretal por poço em uma placa de 24 poços e manter as células no meio águia modificada (DMEM) modificado de Dulbecco durante a noite a 37 °C.
  2. Substitua o meio de cultura por ou sem sulfato ferroso de 100 μM (FS) ou 10 μM doxorubicina (DOX) contendo médio e incubado por 24 h.

2. Preparação da solução DCFH-DA

  1. Dissolva 4,85 mg de DCFH-DA em 1 mL de sulfóxido de dimetila (DMSO) para fazer uma solução de estoque de 10 mM.
  2. Diluir a solução de estoque com DMEM pré-aquecido em uma solução de trabalho de 10 μM logo antes de adicioná-la aos poços.
  3. Vórtice a solução de trabalho para 10 s.

3. Coloração DCFH-DA

  1. Remova a droga que contém meio e lave uma vez com DMEM.
  2. Adicione 500 μL da solução de trabalho DCFH-DA em cada poço e incubar a 37 °C por 30 min.
  3. Remova a solução de trabalho DCFH-DA. Lave uma vez com DMEM e 2x com soro fisiológico tamponado de fosfato de 1x (PBS).
  4. Adicione 500 μL de 1x PBS a cada poço.

4. Aquisição de imagens e medição de intensidade

  1. Pegue imagens fluorescentes representativas para cada poço usando o canal de proteína fluorescente verde (GFP) em um microscópio de fluorescência.
  2. Depois de tirar imagens, remova o PBS e adicione 200 μL de buffer de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) a cada poço.
  3. Incubar no gelo por 5 minutos, depois coletar lysate celular em tubos de 1,5 mL.
  4. Centrifugar a 21.130 x g por 10 min a 4 °C.
  5. Transfira 100 μL do supernante para uma placa de poço 96 preta e meça a intensidade da fluorescência usando uma fluorescência de um leitor de microplaca em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 530 nm.
  6. Transfira 1 μL do supernante para uma placa clara de 96 poços contendo 100 μL de solução de ensaio de proteína 1x para medir a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford9.
  7. Normalizar intensidades de fluorescência com concentrações proteicas.

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Representative Results

As células cancerígenas colorretais HCT116 foram tratadas com 100 μM FS ou 10 μM DOX para induzir o estresse oxidativo7. Como mostrado na Figura 1,a fluorescência verde foi dramaticamente aumentada tanto por FS quanto pelo DOX, como esperado. Para quantificar a mudança de intensidade relativa, as células foram lístidas após a realização de imagens e normalizadas com concentrações proteicas. A intensidade de fluorescência quantificada foi significativamente aumentada por FS ou DOX em células HCT116.

Figure 1
Figura 1: O tratamento de ferro aumenta a ROS em células cancerígenas colorretais. Imagens fluorescentes representativas tiradas por um microscópio de fluorescência e quantificação de intensidade por um leitor de microplaca de fluorescência para 2',7'-dichlorodihydrofluorescetina diacetato (DCFH-DA) colorindo em HCT116 células após tratamento de controle não tratado (Ctrl), (A) 100 μM sulfato ferroso (FS) ou (B) 10 μM tratamento doxorubicina (DOX) para 24 h. Barra de escala = 400 μm. * = p < 0,05; = p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O protocolo experimental descrito aqui é facilmente reproduzível para medir ros total celular. As etapas críticas incluem tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, minimizar a perturbação do estado celular e a extensa lavagem de PBS logo antes de tirar imagens. Para a preparação da solução de trabalho DCFH-DA, a solução de estoque deve ser adicionada em DMEM pré-aquecido logo antes de adicionar na placa de poço 24. A razão é que soluções antigas que geram fluorescência de fundo elevado ou exposição à luz levarão ao fotobleaching. A maioria dos estudos usa 1x PBS ou 1x Solução de sal balanceada (HBSS) da Hanks para diluir o DCFH-DA e usá-lo como tampão de reação10. No entanto, ao usar HCT116 e RKO, a diluição da solução de estoque DCFH-DA com PBS e DMEM livre de soro bovino fetal gerou alto sinal de fundo mesmo em células não tratadas. Isso pode ser devido à perturbação do estado celular. Além disso, a solução de trabalho DCFH-DA deve ser adicionada lentamente ao longo da parede do poço. A perturbação do estado celular gerará um sinal de alta fluorescência em comparação com a área próxima não perturbada. Também é fundamental lavar pelo menos duas vezes com PBS antes de tirar imagens para reduzir a auto-fluorescência do fenol contendo DMEM. DMEM sem fenol pode ser uma escolha melhor, mas mostramos aqui que a lavagem do PBS foi suficiente para minimizar a auto-fluorescência. Como mostrado na Figura 1, mesmo em grupos de controle não tratados dois lotes diferentes de experimentos poderiam resultar em diferentes imagens representativas. Para controlar as variações experimentais, recomendamos o tratamento de células com solução de trabalho DCFH-DA diluída (como no protocolo) em vez de adicionar solução de estoque diretamente nas células. Além disso, as imagens devem ser tiradas em campos com densidades celulares semelhantes e o mesmo tempo de exposição. Finalmente, é importante realizar experimentos em todos os grupos de comparação ao mesmo tempo.

Devido à significância da ROS, também foi desenvolvida a detecção específica de ROS, além da detecção total de ROS. Por exemplo, a produção celular de superóxido pode ser detectada por dihidroedicium, que após a oxidação resulta em hidroxilação na posição 2 para formar 2-hidroxiendidídio. À medida que 2-hidroxietídio se intercala no DNA celular, pode-se observar fluorescência vermelha com comprimentos de onda de excitação e emissão de 535 nm e 635 nm, respectivamente. O superóxido mitocondrial pode ser visualizado com o reagente MitoSOX, um derivado cationic de dihidroedicium que entra em células vivas e visa especificamente mitocôndrias. O produto de oxidação de Mitosox que gera fluorescência vermelha pode intercalar-se em DNA mitocondrial. A sonda de peróxido de nafílimida fluorescente quimoselétrica foi desenvolvida para detecção de H2O2 11. Além disso, também foi relatada a detecção de radicais hidroxis usando espectrofotometria de fluorescência12.

Em resumo, aqui descrevemos um protocolo simples e otimizado para detectar ros total celular usando coloração DCFH-DA econômica.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (K01DK114390), um Research Scholar Grant da American Cancer Society (RSG-18-050-01-NEC), um Projeto Piloto de Pesquisa Grant do Programa de Assinatura de Saúde Ambiental da Universidade do Novo México e Superfund (P42 ES025589), um Prêmio piloto de recursos compartilhados e um prêmio de projeto piloto de suporte ao programa de pesquisa do Centro de Câncer Abrangente unm (P30CA118100) , e um novo prêmio de pesquisador do Fundo dedicado à pesquisa em saúde da Faculdade de Medicina da Universidade do Novo México.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate Cayman Chemical, Ann Arbor, MI 20656
Doxorubicin hydrochloride TCI America, Portland, OR D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning, Corning, NY 45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate VWR, Radnor, PA 97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher Scientific Waltham, MA AMAFD1000 or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution Bio-Rad, Hercules, CA 5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devices, Radnor, PA 89429-532 or any other fluorescence microplate reader

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References

  1. Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5, (1), 9-19 (2012).
  2. Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24, (4), 325-340 (2015).
  3. Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
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  9. Kruger, N. J. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. Humana Press. Totowa, NJ. 17-24 (2009).
  10. Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67, (2), 56-60 (2013).
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