Комбинированное использование хвоста вен ы метастазы анализы и в режиме реального времени в Vivo Imaging для количественной диагностики рака молочной железы метастатическая колонизация и бремя в легких

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Описанный подход сочетает в себе экспериментальные метастазирование хвостовой вены с in vivo живой изображения животных, чтобы в режиме реального времени мониторинга образования метастазов рака молочной железы и роста в дополнение к количественной метастазировать число и размер в легких.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. J. Vis. Exp. (154), e60687, doi:10.3791/60687 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Метастаз является основной причиной смерти, связанной с раком, и существуют ограниченные терапевтические возможности для пациентов с метастатическими заболеваниями. Выявление и тестирование новых терапевтических целей, которые будут способствовать разработке более эффективных методов лечения метастатических заболеваний, требует доклинических моделей in vivo. Демонстрация здесь является сингенной мыши модели для оценки рака молочной железы метастатической колонизации и последующего роста. Метастатические раковые клетки стерливо трансумцируются с вирусными переносчиками, кодирующие светлячок люциферазы и белки SGreen. Кандидат генов затем стабилизированы в люциферазе / SGreen-выражение раковых клеток, а затем клетки вводятся в мышей через боковую вену хвоста, чтобы ассировать метастатическую колонизацию и рост. Устройство in vivo для визуализации используется для измерения биолюминесценции или флуоресценции опухолевых клеток у живых животных для количественной оценки изменений метастатического бремени с течением времени. Выражение флуоресцентного белка позволяет количественно определить количество и размер метастазов в легких в конце эксперимента без необходимости секционирования или гистологического окрашивания. Этот подход предлагает относительно быстрый и простой способ проверить роль генов-кандидатов в метастатической колонизации и роста, и предоставляет гораздо больше информации, чем традиционные анализы метастазов хвостовых вен. Используя этот подход, мы показываем, что одновременное снижение ассоциированного белка Yes (YAP) и транскрипционного коактиватора с связывающим мотивом PD ' (ТАЗ) в раковых клетках молочной железы приводит к снижению метастатического бремени в легких и что это снижение нагрузки является результатом значительно йогтерированной метастатизации и снижения роста метастазов.

Introduction

Рак остается второй ведущей причиной смерти во всем мире1 и метастаз является причиной большинства из этих смертей2,3. Однако ограниченное понимание молекулярных механизмов, регулирующих метастатическую колонизацию и последующий рост, препятствует разработке эффективных методов лечения метастатических заболеваний. Идентификация новых терапевтических целей требует анализа, чтобы проверить, как возмущенное выражение или функция гена кандидата влияет на формирование метастаз и рост метастаза. В то время как автохтонусные модели мыши имеют свои преимущества, они отнимают много времени и дорого генерировать, что делает их более подходящими для целевой проверки, а не целевого обнаружения. Системы модели трансплантации, в которых ген кандидата возмущен в раковых клетках in vitro, а затем воздействие на метастатический потенциал оцениваются in vivo, являются менее дорогостоящими и более высокой пропускной способностью, чем автохтоновые модели. Кроме того, вирусные векторы для стабильной доставки РНК, CRISPR/CAS9 и трансгенов широко доступны, что делает его относительно легко возмущать практически любой ген или гены, представляющие интерес в раковых клеток линий. Этот подход также может быть использован для оценки роли генов-кандидатов в метастатической колонизации и росте раковых клеток человека путем пересадки клеток на ослабленных иммунитетом или гуманизированных мышей.

Два типа анализов, используемых для проверки образования метастазов пересаженные раковые клетки in vivo являются спонтанными метастазами анализы и экспериментальные метастазовые анализы. При спонтанных метастазах анализы4,5, раковые клетки вводятся в мышей, позволило сформировать первичную опухоль, а затем спонтанное образование метастазов и последующего роста анализируются. Сила этой модели заключается в том, что клетки должны завершить все этапы метастатического процесса, чтобы сформировать метастатические опухоли. Тем не менее, многие линии раковых клеток не метастазируют эффективно в спонтанных моделях метастаз, и любые манипуляции клеток, которые влияют на первичный рост опухоли может смутить результаты метастазировать анализ. Экспериментальные метастазные анализы, в которых раковые клетки вводятся непосредственно в обращение, используются, чтобы избежать этих ловушек. Общие экспериментальные метастазовые анализы включают инъекции хвостовойвены 6,7,8 (и продемонстрировали здесь), интракардиальная инъекция9,и портальная инъекциявены 10.

Цель протокола, представленного здесь, заключается в том, чтобы обеспечить экспериментальный метастазный ассса in vivo, который позволяет исследователю отслеживать образование метастазов и рост в режиме реального времени, а также количественно определить количество метастазов и размер ы в легких одной и той же мыши. Для достижения этой цели, традиционные экспериментальные метастазовые хвостовые вены анализы6,7,8 сочетаются с живой изображения животных, используя in vivo изображений устройства9,11,12,13,14. Опухолевые клетки, устойчиво выражающие как люциферазу, так и флуоресцентный белок, вводятся мышам через боковую хвостовую вену, а затем устройство in vivo imaging используется для измерения изменений метастатического бремени в легких с течением времени(рисунок 1). Тем не менее, устройство in vivo live animal image не может различать или измерять размер отдельных метастазов. Таким образом, в конце эксперимента, флуоресцентный стереомикроскоп используется для подсчета числа и измерения размера флуоресцентных метастаз в легких без необходимости секционирования и гистологии или иммуногистохимии (Рисунок 1). Этот протокол может быть использован для проверки того, как изменение экспрессии или функции гена кандидата влияет на формирование метастазирования и рост. Потенциальные терапевтические соединения, такие как небольшие молекулы или функции блокирующие антитела также могут быть проверены.

Чтобы продемонстрировать этот подход, мы впервые выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором основной фактор репликации, репликации белка A3 (RPA3) сбит в метастатических клеток рака молочной железы мыши. Мы показываем, что мыши, вводимые клетками RPA3, имеют значительно меньше метастатического бремени в каждый момент времени по сравнению с мышами, вводимыми контрольными клетками. Анализ метастазов, содержащих легкие, показывает, что это снижение метастатического бремени является результатом значительного снижения метастатического колонизации и нарушения роста метастазов, которые образуются. Чтобы еще больше продемонстрировать этот метод, мы проверили ли одновременно сбить Да связанных белка (YAP) и транскрипционного со-активатора с PD - связывающий мотив (ТАЗ) ухудшает метастатическую колонизацию или последующий рост. YAP и ТАЗ являются двумя связанными транскрипционными со-активаторами, которые являются критическими эффекторами вниз по течению Пути Гиппо. Мы15,16 и другие причастны YAP и ТАЗ в метастазирование (рассмотрено в17,18,19), предполагая, что эти белки являются хорошими терапевтическими целями. Последовательно, мы обнаружили, что мыши, введенные с YAP / TA ' нокдаун клетки значительно снизили метастатическое бремя. Анализ легких показал, что клетки яп/ТАЗ образуют гораздо меньше метастазов и что метастазовые метастаза, которые действительно образуются, были меньше. Эти эксперименты демонстрируют, как экспериментальные метастазные анализы позволяют исследователю быстро и недорого проверить роль гена-кандидата в формировании метастазов и росте. Они также показывают, как комбинированное использование живой визуализации животных и флуоресцентная количественная оценка метастазов в целых легких позволяет исследователю лучше понять шаги во время метастатичной колонизации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол предусматривает использование мышей и биоопасных материалов и требует одобрения соответствующих институциональных комитетов по безопасности. Все описанные работы in vivo здесь одобрены Олбани медицинский колледж институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обзора протокола см.

1. Упаковка всех необходимых ретровирусов и лентивирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол использует лецивирные или ретровирусные векторы, чтобы заглушить фермент люциферазы и флуоресцентный белок, а также манипулировать экспрессией гена-кандидата. Эти вирусы упакованы в HEK-293FT клеток, как описано ниже.

  1. День 1: Плита HEK-293FT клетки на 6-ну хорошо пластин в 2 мл полного роста средств (10% FBS в DMEM с 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамамин), так что они 40-60% сливов на второй день. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за ночь.
  2. День 2: Для каждого вирусного вектора, который будет упакован, трансфектировать 40-60% сольется хорошо HEK-293FT клеток с ретровирусным или лентивирусным вектором и соответствующими векторами, кодирующими вирусную шерсть и упаковочные белки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует VSVG как белок пальто, psPAX2 для лентивирусной упаковки, и кляп-пол для ретровирусной упаковки (см. Дополнительную таблицу 1 для списка переносчиков).
  3. Сделать смесь совместного трансфекции для каждого хорошо следующим образом:
    1. Смешайте 4 зллип липидного раствора для трансфекций (см. Таблицу Материалов)и 96 л трансфекционного буфера и инкубируйте в течение 5 минут.
    2. Добавьте 1 мкг вирусного вектора, 0,5 мкг переносителя белка пальто (VSVG) и 0,5 мкг вектора белка упаковки (psPAX2 или gag-pol) и инкубировать в течение 20 минут.
    3. Аккуратно добавьте смесь со-трансфекции от шага 1.3.2 до клеток HEK-293FT, покрытых шагом 1.1, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за одну ночь.
  4. День 3: Удалите трансфекционные носители из каждого колодца и аккуратно добавьте 2 мл полного роста носителя к каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение примерно 24 часов.
  5. День 4: Соберите вирусный супернатант из каждого колодца с помощью 3 мл шприца и процедите через фильтр 0,45 мкм в микроцентрифугную трубку 2 мл.
  6. Необязательно: Если сбор второй партии вируса желательно, аккуратно добавьте 2 мл полного роста носителя к каждой скважине и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение приблизительно 24 часов.
  7. День 5 (необязательно): Соберите второй раунд вирусного супернатанта, как в шаге 1.5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлено путем замораживания вирусного супернатанта.

2. Поколение раковых клеток, устойчиво выражающих люциферазу и флуоресцентный белок

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает, как сначала заболонь 4T1 клетки с светлячковой люциферазы и флуоресцентного белка (SGreen) с использованием двух векторов с уникальными генами отбора. Затем3-й вирусный вектор используется для манипулирования экспрессией гена-кандидата. Однако вирусные векторы, которые одновременно обеспечивают флуоресцентный белок и генетические манипуляции, также могут быть использованы в качестве альтернативы (как в репрезентативных экспериментах ниже). Другие раковые клетки могут быть использованы, но номера клеток должны быть оптимизированы для шагов 2.1 и 2.7.1.

  1. Плита 4T1 клетки на 1,5 х 105 клеток / хорошо в 12-хорошо пластины в полном росте средств (10% FBS в DMEM с 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамин) и инкубировать при 37 кС, 5% CO2 ночь.
  2. Заразить 4T1 клетки с вирусной супернатант генерируется в шаге 1 следующим образом.
    1. Аспирировать рост средств массовой информации из клеток и добавить 500 л люциферазы вирусного супернатанта и 500 л флуоресцентного белка вирусного супернатанта одновременно заразить клетки как люциферазы и флуоресцентные протеин вирусных супернатантов.
    2. Добавьте 1 л из 8 мг/мл бромистого гексадимертрина (см. Таблицу Материалов).
    3. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% до 75-90% сплава (обычно 24-48 часов).
  3. Трипсинизуйте 4T1 клетки с 500 зл и трипсина в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в 6-сантиметровое блюдо в 4 мл подбора носителей (полный рост носителя, содержащего соответствующие антибиотики), тем самым закачивая трипсин. Плита 6 см блюдо неинфицированных контрольных клеток в том же средств отбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующая концентрация антибиотиков должна быть определена заранее путем тестирования нескольких доз. Кроме того, флуоресцентная сортировка клеток также может быть использована для выбора флуоресцентно маркированных клеток вместо выбора препарата.
  4. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в подборе носителей и разделить клетки, когда это необходимо, пока все неинфицированные контрольные клетки не умертвятся (зависит от гена отбора и клеточной линии).
  5. Подтвердите, что инфицированные 4T1 клетки выражают флуоресцентный белок SGreen с помощью зеленого возбуждения (450-490 нм)/выброс (500-550 нм) фильтра, установленного на перевернутом флуоресцентном микроскопе при 50-100-x увеличении.
  6. Подтвердите, что инфицированные 4T1 клетки выражают люциферазу, используя коммерчески доступный набор активности люциферазы следующим образом.
    1. Используйте минимальный объем 1x пассивный буфер лиза для лиза люциферазы-выражения 4T1 клеток и контролировать 4T1 клетки, которые не выражают люциферазу, мягко тряски в течение 30 минут.
    2. Добавьте 20 зЛ клеточного лисата в белоднюю 96-пуговую пластину, а затем 50 ЗЛ реагента прослеживого вещества из набора активности люциферазы.
    3. Используйте считыватель пластин для измерения люминесценции из клеток на всех длинах волн в спектре с помощью настройки люминесценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания вниз застойно-трансудированных клеток.
  7. Манипулируйте экспрессией гена кандидата следующим образом:
    1. Плита 6 х 105 помечены 4T1 клетки от шага 2,6 на 60 мм блюдо в 4 мл полного роста средств массовой информации и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 ночь.
    2. Аспирировать рост средств массовой информации от каждой скважины и добавить 2 мл полного роста средств, содержащих 4 л 8 мг/мл гексадиметрина бромида.
    3. Добавьте 2 мл вирусного супернатанта со шага 1 в клетки, покрытые шагом 2.7.2, и инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 за одну ночь.
    4. Трипсинизуйте 4T1 клетки с 500 зл и трипсина в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в 10 см блюдо в 10 мл средств отбора (полный рост средств массовой информации, содержащие соответствующие антибиотики), тем самым затушевывая трипсин. Плита некоторых неинфицированных контроля помечены 4T1 клеток в том же средств отбора.
    5. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в подборе носителей и разделить клетки, когда это необходимо, пока все неинфицированные клетки мертвы.
    6. Подтвердите, что экспрессия гена кандидата изменяется с помощью стандартного подхода, такого как западная подательная20 или qPCR21.
    7. Ассаи люминесценции и флуоресценции, как в шагах 2.5-2.6, чтобы определить, насколько похожи они находятся в контроле и нокдаун клетки, так как это может измениться (см. Обсуждение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания вниз застойно-трансудированных клеток.

3. Оптимизация экспериментального дизайна in vivo

  1. Оптимизируйте соответствующее количество клеток и продолжительность эксперимента для желаемого метастатического бремени следующим образом.
    1. Расширьте флуоресцентные и биолюминесцентные 4T1 клетки со ступени 2.6 в носителях полного роста, чтобы лишние клетки были доступны в нужный день инъекции.
    2. Подготовьте клетки для инъекций хвостовой вены, как описано в шаге 4.2. Чтобы определить оптимальное число клеток для инъекций, повторно приостановить клетки в нескольких различных концентрациях в 100 зл и 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем тестировать диапазон номеров/мышей от 25 000 до 500 000.
    3. Держите клеточные подвески на льду до инъекций.
    4. Впрысните каждое разбавление 4T1 клеток со ступени 3.1.2 в 3-4 мышей через боковую хвостовую вену, описанную в шаге 4.3 (см. ниже).
    5. Верните мышь в клетку и монитор в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. Мыши должны быть проверены на наличие признаков боли или бедствия 3x еженедельно.
    6. Мониторинг мышей для образования метастазов и роста в течение 3-6 недель (клеточная линия и мышь деформации зависит) с помощью in vivo живого устройства изображения животных (см. шаги 5 и 6).
      1. Эвтаназия мышей 3-6 недель после инъекции хвостовой вены в соответствии со стандартными институциональными руководящими принципами.
      2. Подготовьте легкие и оцените размер метастазиса и количество, описанные в шаге 7.
      3. Выберите подходящий промежуток времени для роста метастаза для желаемого метастатического бремени (см. обсуждение).

4. Инъекция хвостовой вены помеченных раковых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 4.2.4 был оптимизирован для 4T1 клеток, растущих в сингенных мышах BALB/c. Если используются другие линии раковых клеток и штаммы мыши, количество вводимых клеток и длина ассса сначала должны быть оптимизированы.

  1. Расширьте 4T1 клеточные линии, генерируемые в шаге 2 на двух 15 см блюд в полном росте средств массовой информации, так что избыточные клетки доступны в день инъекции.
  2. Подготовьте клетки для инъекции хвостовой вены следующим образом:
    1. Аспирировать средства массовой информации и промыть пластины клеток с 1x PBS.
    2. Трипсинизуйте клетки 5 мл трипсина на 15 см пластины в течение 2-5 минут (клетки должны свободно смыть дно колодца). Перенесите все клетки в коническую трубку. Вымойте оставшиеся клетки из ткани культуры блюдо с достаточно полным иском роста, чтобы утолить трипсин и добавить мыть в той же конической трубки.
    3. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячейки, чтобы определить общее число ячеек.
    4. Центрифуги клетки на 122 х г в течение 3 минут, аспирируется супернатант, и resuspend клетки в 1x PBS при нужной концентрации. Здесь, 2,5 х 104 клетки вводятся в каждую мышь в 100 л PBS, так что повторноя клетки на 2,5 х 105 клеток / мл. Держите клеточные подвески на льду до инъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: важно ограничить время между трипсинизацию клеток и инъекцией хвостовой вены примерно 1 часом.
  3. Впрысните 4T1 клетки от шага 4.2.5 в мышей через боковую вену хвоста следующим образом:
    1. Работая в капюшоне на животном объекте, осторожно, но тщательно смешать клетки, инвертируя трубку или с помощью шприца 1 мл, чтобы убедиться, что они равномерно повторно. Всегда убедитесь, что ячейки переосвязны перед загрузкой шприца.
    2. Загрузите 1 мл Шприца Luer-lock с клеточной подвеской и изгоняют излишки пузырьков воздуха. Поместите 1/2 дюйма, 30-калиберной иглы на шприц с скотом и изгнать пузырьки воздуха.
    3. Аккуратно поместите мышь в удерживающим средством грызунов.
    4. Боковые хвостовые вены должны быть видны и расширены. Если нет, осторожно щепотку основания хвоста и окунуть хвост в теплую воду из-под крана, чтобы утилизно вены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диляция вен также может быть достигнута путем размещения клетки мыши под нагревательной лампой и / или на верхней части грелки.
    5. Используйте алкоголь протрите, чтобы очистить хвост. Вставьте иглу в хвостовую вену, сковеди вверх и введите 100 злиц клеточной суспензии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла вставляется должным образом в вену, она должна легко скользить немного вперед и назад, и не должно быть сопротивления, когда поршень толкается. Успешные инъекции также должны привести к "флеш", в котором синий цвет вены становится белым в течение нескольких секунд после инъекции.
  4. Медленно удалите иглу и с помощью стерильной марли, применить давление на место инъекции, чтобы остановить любое кровотечение.
  5. Верните мышь в клетку и контролировать в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. Мыши должны быть проверены на наличие признаков боли или бедствия 3x еженедельно.
  6. Мониторинг мышей для образования метастазов и роста в течение 3-6 недель (клеточная линия и мышь деформации зависит) с помощью in vivo живого устройства изображения животных (см. шаги 5 и 6).

5. Мониторинг метастатического бремени с помощью флуоресценции с помощью устройства визуализации живого изображения животных in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Не изображение животного для флуоресценции с активным люминесцентным сигналом.

  1. Если только визуализация биолюминесценции, перейдите к шагу 6.
  2. Включите устройство in vivo live animal imaging.
  3. Настройка in vivo живой системы визуализации животных в соответствии с руководящими принципами производителя, чтобы доставить между 1,5% и 2% изолюран в анестезии камеры и камеры изображения.
  4. Анестезируйте мышей с флуоресцентно помеченными метастазами со 4-го шага, поместив их в анестезионную камеру и доставляя 1,5-2,5% изофлуран.
  5. Откройте программное обеспечение для изображений (см. Таблицу Материалов)и войти.
  6. Нажмите кнопку Инициализация и ждать, пока машина инициализируется.
  7. Измените Поле зрения на D.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поле View C также может быть использовано, если требуется более близкий вид мыши, но это ограничивает количество мышей, которые могут быть изображены одновременно.
  8. После того, как программное обеспечение показало, что камера достигла соответствующей температуры, нажмите кнопку Imaging Wizard, выберите Fluorescence, а затем выберите соответствующую пару фильтров из выпадающего меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фторофор используется не вариант, выберите вход EX / EM и типа возбуждения и выбросов требуется.
  9. Поместите мышь в камеру, как описано в шаге 3.2.4.
  10. Нажмите Приобрести Последовательность.
  11. После получения изображения верните мышь в клетку и проследите в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное выздоровление.
  12. Повторите шаг 5.2 и шаги 5.7-5.9 с по крайней мере одной мышью, которая не содержит метастаз. ПРИМЕЧАНИЕ: Эта мышь будет использоваться для количественной оценки и вычитания фонового сигнала во время анализа (шаг 8).
  13. Изображение 2-3 раза в неделю в течение всего эксперимента.

6. Мониторинг метастатического бремени с помощью биолюминесценции с помощью устройства визуализации живого изображения животных in vivo

  1. Включите устройство in vivo live animal imaging и установите программу следующим образом.
    1. Откройте программное обеспечение для изображений (см. Таблицу Материалов)и войти. Нажмите кнопку Инициализация и ждать, пока машина инициализируется. Измените Поле зрения на D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поле view C может быть использовано для более близкого представления к изображению полного тела мыши; однако, это ограничивает количество мышей, которые могут быть изображены сразу.
    2. Для использования в первый раз, отодевайте настройки экспозиции следующим образом: нажмите «Оторите» Предпочтения Приобретение (приобретение) Автоматическая экспозиция и изменить максимальное время экспозиции от по умолчанию 60 секунд до 300 секунд и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не изменяйте никаких других параметров во вкладке автоматической экспозиции.
  2. Настройка системы анестезии в соответствии с руководящими принципами производителя, чтобы доставить от 1,5% до 2% изолюран в анестезии камеры и камеры изображения.
  3. Убедитесь, что камера достигла соответствующей температуры, прежде чем приступить к шагу 6.4.
  4. Обезболивающее метастазно-содержащее метастазирование мышей со 4-го шага, поместив их в анестезионную камеру и доставляя 1,5-2,5% изолюран.
  5. Подготовка мышей для биолюминесценции изображения следующим образом.
    1. Загрузите 1 мл шприца с D-люциферином (30 мг/мл в D-PBS), а затем добавьте 1'2 дюйма 30-калийной иглы шприц и изгнать пузырьки воздуха.
    2. Измерьте и запишите массу анестезируевской мыши.
    3. Сдержать мышь, щипать потертости шеи с помощью большого пальца и указательных пальцев и схватив хвост между мизинец палец и основание руки. Переворачивать мышь под углом 45 градусов, с головой, направленной вниз.
    4. Вставьте иглу, сковадину вверх, в левую сторону мыши интраперитонеального (IP) пространства. Подтвердите вход в пространство IP, отодвивая небольшой объем. Не должно быть цвета в основании иглы при оттягивании в пространстве IP.
    5. Вводят соответствующий объем D-люциферина в дозе 150 мг/кг.
    6. Сразу же после D-люциферина администрации, начать таймер и поместить мышь плашмя на спину в устройстве визуализации с носом в нос конуса и убедитесь, что 1,5-2,5% изофлуран вводится. Поместите разделители между каждой мышью при визуализации нескольких мышей. Убедитесь, что мыши расположены как можно более плоские (т.е. не склоняются в одну сторону).
    7. Нажмите Luminescent и фотографии коробки, а затем нажмите Приобрести в панели управления приобретением.
  6. Непрерывно приобретать биолюминесцентные изображения до тех пор, пока пик сигнала достигается и использовать изображение с пиковым биолюминесцентным сигналом для анализа.
  7. После получения изображения верните мышь в клетку и проследите в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное выздоровление.
  8. Изображение 2-3 раза в неделю в течение всего эксперимента.

7. Количества и размер метастаз

ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени метастазами разрешено расти должна быть определена для каждой линии клеток и мыши штамма, и будет зависеть от количества клеток вводили.

  1. Эвтаназия мышей в соответствии со стандартными институциональными руководящими принципами.
  2. Изолировать и удалить легкие из каждой мыши и промыть в 1x PBS, чтобы удалить избыток крови.
  3. Аккуратно разделите легкие на доли.
  4. Приобретайте изображения метастазов sGreen в доле в 10x в ярком поле и флуоресценции с помощью флуоресцентного стереоскопа с широкодиапазонным фильтром GFP (возбуждение 470/40x).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте одинаковое увеличение и яркость для всех образцов. Используемое увеличение может варьироваться в зависимости от размера, количества и яркости метастаз, а также поля зрения для используемого микроскопа.
  5. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки размера и количества метастазизмов изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для анализа изображений зависит от программного обеспечения и может быть оптимизирован с опухолями от step3. Кроме того, подсчитайте количество метастаз в каждом легком вручную с помощью флуоресцентного стереоскопа. Протокол может быть приостановлен здесь и шаг 8 может быть сделано в любой момент после того, как все изображения in vivo были собраны.

8. Обработка и анализ данных с изображений, полученных с помощью устройства визуализации живых животных in vivo

  1. Откройте все файлы изображений для каждой мыши в программном обеспечении изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изображение с пиковым биолюминесцентным сигналом для анализа
  2. Убедитесь, что единицы находятся в Radiance для биолюминесцентных данных и эффективности для флуоресцентных данных, нажав на стрелку в левом верхнем верхнем отоке изображения и изменив ее на соответствующую единицу.
  3. Используйте изображение с последней точки времени для создания региона интереса (ROI) следующим образом.
    1. Нажмите ROI Tools в окне палитры инструментов. Вставьте одну рентабельность инвестиций, нажав на стрелку и выбрав 1.
    2. Нажмите на границу рентабельности инвестиций и переместите ее через грудь мыши. Отрегулируйте размер рентабельности инвестиций таким образом, чтобы она покрывала грудь мыши и не исключала сигнал.
  4. Нажмите измерить ROIs и скопировать или введите сырой номер в лист Excel.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для биолюминесцентных данных выберите общий поток (фотоны в секунду), который является суммой всего сияния в рентабельности инвестиций. Поскольку метастаза не обязательно растут равномерно, общий поток предпочтительнее среднего сияния, поскольку он измеряет сумму метастатического бремени. Аналогичным образом, для флуоресцентных данных вместо средней эффективности следует использовать % общей эффективности (свет выбросов (фотон/второй)/возбуждательный свет (фотоны/секунда)..
  5. Нажмите в файле изображения, чтобы скопировать рентабельность инвестиций, используемых в шаге 8.3, и вставить ее в каждый файл изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При количественной оценке флуоресцентных изображений, количественно той же области на мыши, которая была изображена без метастаз. Используйте этот сигнал в качестве фонового сигнала и вычесть его из каждого флуоресцентного метастазя, содержащего изображение мыши приобрел.
  6. Перемещение вставки ROIs над той же областью, выбранной в шаге 8.3.4 для каждого изображения и повторите шаг 8.4.
  7. Участок и анализ необработанных данных следующим образом (см. Дополнительную таблицу 2).
    1. Сделайте преобразованиежурнала 10 необработанных данных для каждой мыши с помощью указанной формулы(Дополнительная таблица 2)и участок, как на рисунке 2D и рисунок 4F. Преобразование журнала10 линейно линейно кривой роста, которая имеет тенденцию быть геометрической и сводит к минимуму гетероскедастичность.
    2. Используя линейную регрессию, вычислите наклон установленной линии в журнал10 преобразованных данных для каждой мыши, начертанных в шаге 8.7.1(Дополнительная таблица 2). Обратитесь к формуле в дополнительной таблице 2, чтобы соответствовать линии и рассчитать наклон в один шаг.
    3. Участок численные значения склонов, как на рисунке 2E и Рисунок 4G. Для определения статистической значимости используйте T-test или one-way ANOVA (более 2 групп).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать вышеподход, мы выполнили доказательство концептуального эксперимента, в котором критический фактор репликации, RPA3 был сбит в метастатической линии клеток карциномы мыши (4T122). В то время как протокол описывает маркировку клеток как люциферазы и флуоресцентные белки до генетических манипуляций, мы использовали модифицированный подход, потому что векторы РНК также доставить SGreen (Рисунок 2A). Во-первых, 4T1 клетки были застеждены с лентивирусной конструкции кодирования светлячковой люциферазы и гигромицин сопротивление (pHAGE-Luciferase-IRES-Hygro). После выбора гигромицина, luciferase асссе был выполнен для подтверждения стабильной экспрессии светлячка luciferase (Рисунок 2A). Далее, 4T1-Luciferase клетки были застойно трансцированных с ретровирусными вектором, которые выражают sGreen и либо контроль miR30 основе shRNA, или miR30 основе shRNA ранее показано эффективно целевой мыши RPA316,23,24. Клетки затем вводили в мышей через боковую хвостовую вену и in vivo биолюминесцентный сигнал измерялся два раза в неделю для мониторинга метастатического бремени(рисунок 2B,C). Твёрлетный сигнал10 для каждой мыши был построен как метастатическое бремя с течением времени(рисунок 2D)и были определены склоны каждого участка(рисунок 2E). Эти данные показывают, что скорость изменения метастатического бремени значительно снижается с RPA3 нокдаун по сравнению с контрольными ячейками. Хотя различия поразительны, эти данные сами по себе не позволяют нам определить, является ли уменьшенное метастатическое бремя результатом менее метастазных или из-за замедления роста метастаз. Таким образом, метастаза с маркировкой SGreen в легких также были проанализированы в конце эксперимента. Мыши, введенные клетками RPA3, почти не имели метастазов в легких, в то время как у контрольных мышей было многочисленнgp больших метастазов(рисунок 3). Кроме того, метастаза, которые действительно образуются из rpA3 нокдаун клетки были явно меньше, чем контроль 4T1 метастаза(Рисунок 3A). В соответствии с нашими ручными подсчетами(рисунок 3B), программное обеспечение для анализа изображений насчитало значительно меньше метастазов в мышах RPA3 нокдауна(рисунок 3C). Кроме того, общая метастатическая нагрузка в легких (сумма областей каждого метастаза в миллиметрах) также была резко снижена на RPA3 нокдаун(рисунок 3D). Наконец, размер отдельных метастазов, которые образуются в RPA3 нокдаун мышей, как правило, гораздо меньше, чем в контроль ных мышей (Рисунок 3E). В дополнение к большим метастазам в контрольных мышей, мы наблюдали многочисленные небольшие метастазы, а также, но не может определить, если это опухолевые клетки, которые посеяли легкие и не растут, или если они опухолевые клетки пролить от одного из больших метастазов, которые повторно семеналегкие легкие в новом месте (Рисунок 3E). В совокупности эти данные показывают, что RPA3 необходим для образования метастазизов ячейками 4T1. Эти выводы были ожидаемы, потому что наша предыдущая работа показала, что RPA3 сбить клетки значительно снизили способность к формированию метастазов в легких после инъекции хвостовойвены 16. Тем не менее, этот эксперимент демонстрирует, как использование живой изображения животных и флуоресцентная количества метастазов и размер может быть использован, чтобы определить, если изменения в метастатическом бремени связаны с различиями в метастатической колонизации или роста.

Чтобы продемонстрировать, как этот подход может быть использован для ответа на более биологически актуальный вопрос, мы спросили, необходимы ли YAP и ТАЗ для метастатической колонизации и последующего роста в этой сингенной модели рака молочной железы. Выражение и активность YAP или ТАЗ увеличиваются во многих видах рака по сравнению с нормальной ткани, и это прогнозирование плохой исход пациента25,26,27,28,29. Кроме того, несколько исследований были вовлечены YAP, ТАЗ, или TEADs, критические YAP / ТАЗ-обязательных партнеров, в метастазах15,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44,45,46,47,48,49,50,51,52. Учитывая эти данные, мы использовали наш подход для проверки, необходимы ли для формирования и роста метастазов YAP и ТАЗ. Для этого мы используем ретровирусный вектор, выражающий тандем miR30 на основе shRNA, нацеленный как на YAP, так и на ТАЗ. Как показано на рисунке, этот тандем shRNA эффективно снижает экспрессию и транскрипцию белка YAP и ТАЗ в 4T1 клетках(Рисунок 4A,B). 4T1-Luciferase клетки были stably transduced с zsGreen-выражая версией этого тандема YAP/TA' shRNA вектор или контроль miR30 основе shRNA (Рисунок 4C), а затем проверяли хвоственных инъекций вены в сингенных BALB/c мышей. Как показано на рисунке 4, скорость, с которой метастатическое бремя увеличилось было значительно быстрее у мышей, вводили с контрольными клетками по сравнению с мышами, введенными с яп/ ТАЗ нокдаун клетки (Рисунок 4D-F). Значительно меньше метастазов, образуются у мышей, введенных с яп. Мало того, что многие другие метастазы образуются в контроль ных мышей, но они, как правило, больше (Рисунок 5E). Последовательно, метастатическое бремя в легких (общая зона метастазов в мм) также резко сократилась на YAP / ТАЗ нокдаун(Рисунок 5D). Важно отметить, что, когда метастаза большие и близко друг к другу, программное обеспечение может быть не в состоянии дифференцировать различные метастаза. Это было в случае нескольких метастазов в контроль мышей (мышь 3 и мышь 7). Таким образом, важно проверить выход программного обеспечения для анализа изображений, чтобы убедиться, что он точно измеряет площадь отдельных опухолей. Именно поэтому важно оптимизировать количество впрыскиваемых клеток и продолжительность эксперимента. В совокупности эти данные показывают, что YAP и ТАЗ необходимы для поддержания темпов, с которыми метастатическое бремя увеличивается в сингенной модели мурина метастатического рака молочной железы, и что это связано с неспособностью метастазов формировать и уменьшить рост немногих метастазов, которые сформировались.

Figure 1
Рисунок 1: Схема протокола. Все необходимые вирусы сначала упакованы в клетки HEK-293FT. Нужные клетки для исследования затем одновременно инфицированы люциферазы и флуоресцентные вирусы, которые каждый выразить уникальный ген отбора млекопитающих наркотиков. Инфицированные клетки затем расширяются в соответствующих носителях, содержащих оба препарата, чтобы выбрать для стерлимо трансдуцированных клеток, выражающих как люциферазу, так и флуоресцентный белок. Выражение обеих меток подтверждается, как описано в протоколе. Помеченные клетки затем трансоксидируются третьим вирусом, содержащим генетические манипуляции (miR30 shRNA) и третьим уникальным геном отбора лекарств. После отбора с третьим препаратом, клетки вводят сява в мышей через боковую хвостовую вену. Метастатическая нагрузка контролируется у мышей на протяжении всего эксперимента с помощью системы визуализации живых животных in vivo. В конце эксперимента мышей усыпляется, а изображения целых легких делаются с помощью флуоресцентного рассекающего микроскопа, а затем используются для измерения количества и размера метастазов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Luciferase основе in vivo живой изображения животных показывает, что RPA3 нокдаун снижает метастатическое бремя рака молочной железы. (A) Схема, показывающая, как клетки были созданы для этого исследования in vivo. 4T1 клетки были стерли транскорпоранство с лентивирусной кодирования люциферазы и гигромицин сопротивление. Инфицированные клетки были выбраны с 600 мкг/мл гигромицина В в течение одной недели, а затем активность люциферазы была измерена в родительских или 4T1-люциферазы клеток с помощью luciferase репортер комплект и пластины читателя (n - 1 эксперимент с репликацией скважин усредненных). 4T1-Luciferase клетки были затем инфицированы ретровирусом, которые доставляют sGreen и miR30 shRNAs ориентации либо mCherry (контроль) или mRPA3. Выбор пуромицина (2,5 мкг/мл) в течение 3 дней использовался для выбора для стабильной интеграции вируса. (B-E) 4T1-люциферазы клетки усто и контроля (sh-mCherry) или mRPA3 (sh-mRPA3-431) shRNAs были введены в мышей и изображения для биолюминесценции на указанные дни, как описано в протоколе. (B и C) Биолюминесцентные изображения для репрезентативной мыши каждой группы в указанный день после инъекции (D) Участок журнала10 преобразованлю сигнала люциферазы измеряется для каждой мыши в ходе эксперимента. (E) Рассеянный участок со средним (твердая линия) для склонов каждой мыши в D (n No 6 для ш-контроля и 8 для ш-mRPA3-431). Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; ПР 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Количественная оценка флуоресцентных метастазов показывает, что RPA3 нокдаун предотвращает метастатическую колонизацию и последующий рост раковых клеток молочной железы. (A) Флуоресцентные (слева) и яркие (справа) изображения представительных долей из каждой мыши, впрыснутые на рисунке 2 через 21 день после инъекции. Звездочки (яп. ) указали зеленые автофлуоресцентные бронхи. (C-E) Программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблица материалов)использовалось для идентификации и измерения объектов с использованием порога интенсивности от 25 до 100 и порога размера 0,01 мм2 до бесконечности. (B и C) Рассеянный участок со средним (твердый бар) от общего количества метастаз в легких каждой мыши при подсчете (B) по программному обеспечению анализа изображений (C). (D) Общая площадь (мм) легких, которая была измерена с помощью программного обеспечения анализа изображений построен как метастатическое бремя со средним, указанным твердой бар. (E) Размер каждого метастаза построен для каждой мыши. Контроль мышей показаны синие точки и mRPA3 нокдаун мышей красными точками. Обратите внимание, что панель масштаба разделена на 1 мм, чтобы было легче визуализировать размер и количество небольших метастаз (n No 6 sh-контроль, 8 sh-mRPA3-431). Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; стр. 0,06; Р 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: ЯП/ ТаЗ нокдаун снижает метастатическое бремя рака молочной железы. (A и B) 4T1 клетки, устойчиво выражающие miR30 основе контроля (mCherry) или тандем YAP / ТаЗ shRNAs (sh-mYAP1/mTA6) были проанализированы западного анализа поблучки (A) или транс заражены YAP / ТАЗ-TEAD luciferase репортер астративные конструкции и ассес для YAP / ТАЗ-TEAD транскрипционной деятельности, как описано ранее15,16 (B) (n No 5 для контроля и 4 для YAP1/TA6). (C) Схема, показывающая, как клетки были созданы для исследования in vivo. 4T1-Luciferase клетки были инфицированы ретровирусами, которые поставляют sGreen и либо miR30 shRNA ориентации mCherry (контроль) или тандем miR30 shRNAs ориентации как mYAP и mTA. Инфицированные клетки были выбраны в Пуромицин (2,5 мкг/мл) в течение 3 дней. 4T1-люциферазы клетки устоичительно выражая sGreen и контроль (sh-mCherry) или YAP/TA '(sh-mYAP1/mTA1) shRNAs затем были введены в мышей и изображения для биолюминесценции на вводили дней. (D и E) Биолюминесцентные изображения для репрезентативной мыши каждой группы в указанный день после инъекции. (F) Участок журнала10 преобразованный сигнал люциферазы измеряется для каждой мыши в ходе эксперимента. (G) Рассеянный участок со средним (твердый бар) для склонов каждой мыши в F (n No 7 для ш-контроля и 8 для ш-mRPA3-431). Среднее указывается сплошной линией. Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; стр. 0,06; Вопрос, р 0,01; ***. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: YAP и ТАЗ необходимы для метастатических раковых клеток молочной железы для колонизации легких. (A) Флуоресцентные (слева) и яркие (справа) изображения представительных долей из каждой мыши, впрыснутые на рисунке 4 21 дней после инъекции. (C-E) Изображения были обработаны с помощью программного обеспечения для анализа изображений, как описано на рисунке 3. (B и C) Рассеянный участок со средним (твердый бар) от общего количества метастаз в легких каждой мыши при подсчете вручную (B) или программного обеспечения для анализа изображений (C). (D) Общая площадь всех метастазах (мм) была измерена с помощью программного обеспечения для анализа изображений и построена как метастатическое бремя со средним (твердая планка). (E) Размер каждого метастаза построен для каждой мыши. Контроль мышей показаны синие точки и ш-mYAP1/mTA6 нокдаун мышей красными точками. Обратите внимание, что панель масштаба разделена на 1 мм, чтобы лучше визуализировать размер и количество небольших метастазов (n no 7 sh-контроль, 8 ш-mYA1/mTA6). Среднее указывается сплошной линией. Статистическая значимость была проверена с помощью теста студента т; . 0,05, п.п., 0,01 евро; **. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Таблица векторов. Перечислены все используемые векторы и описаны новые векторы. Стандартные методы молекулярной биологии были использованы для клонирования новых векторов и последовательностей для недавно описанных 97-мер shRNA включены. Цитаты относятся к: «1»53, No 2 »16, No354Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Пример обработки и анализа данных изображений изображений живых животных in vivo. Таблица, демонстрирующая, как необработанные данные из изображений живых животных in vivo преобразуются для анализа, как описано в шагах 6.7 и 6.8. Необработанные данные, полученные из изображения живых животных in vivo, трансформировались с помощью преобразования журнала10. Скорость изменения метастатического груза рассчитывается для каждой мыши путем расчета наклона, генерируемого преобразованными данными журнала10. Примеры включают анализ люциферазы с рисунка 2. Столбцы закодированы цветом, чтобы указать, какие данные использовались для генерации значения каждого наклона, а формулы встраиваются в электронную таблицу. Двойное нажатие на скважину покажет формулу, используемую для обработки данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги метода
Очень важно оптимизировать количество впрыскиваемых клеток (шаг 3) для данной клеточной линии и деформации мыши, поскольку это может значительно повлиять на количество метастаз, которые образуются, и продолжительность эксперимента. Если слишком много клеток вводят или метастаза растут слишком долго, метастаза может быть трудно подсчитать, что делает последствия генетических манипуляций трудно оценить. Однако, если слишком мало клеток вводят, мало или нет метастаз может образовываться. Таким образом, предварительный эксперимент должен быть сделан с использованием различных чисел клеток, чтобы определить оптимальное число и продолжительность времени, что метастаза расти. Для обеспечения последовательного количества метастаз в группе, важно вводить одинаковое количество жизнеспособных клеток в каждую мышь. Так как клетки могут оседать как в трубке, так и в шприцах, клетки следует аккуратно переоставить перед загрузкой шприца, а суспензии клеток не следует оставлять в шприче слишком долго (шаг 4.3.2). Жизнеспособность клеток уменьшается, чем дольше клетки находятся в суспензии, поэтому количество времени между трипсинизацией и инъекцией клеток должно быть не более одного часа (шаг 4.2.5). Воздушные пузыри и большие скопления клеток не должны быть введены, поскольку они могут вызвать эмболии, которые убивают мышь. Кроме того, рисование клеток через иглу может стрижка их, так что шприц должен быть загружен без иглы. Чтобы подтвердить, что относительно равное количество клеток было введено, in vivo живые изображения животных могут быть приняты вскоре после инъекции(Рисунок 2B, Рисунок 4D).

Точная и последовательная количественная количественная оценка биолюминесцентного сигнала важна и зависит от клеток, принимающих и усваивающих D-люциферин. Это может зависеть от многих переменных, включая, доза D-люциферина, сроки инъекции, температура тела мыши, как анестезируется мышь при введении, и как мышь позиционируется в анестезии камеры до изображения. Поэтому очень важно, чтобы эти шаги были последовательными для всех мышей и сеансов визуализации. Мы использовали грелку для поддержания последовательной температуры тела мыши в то время как в анестезии камеры. Так как сигнал должен проникать в ткани как для биолюминесцентного, так и для флуоресцентного обнаружения, также важно поддерживать положение мыши в соответствии с каждым изображением (квартира на спине лучше всего подходит для визуализации легких). Количественная оценка флуоресцентных изображений из in vivo живого изображения животных всегда должна быть сделана с использованием эффективности % единиц, поскольку это позволяет для соответствующего сравнения между изображениями. Аналогичным образом, при количественной оценке биолюминесцентных изображений всегда следует использовать общий поток (фотоны/секунды). Для анализа метастатического груза преобразование журнала10 преобразует кривую роста (до достижения максимального сигнала) в линейный участок, необходимый для анализа наклона.

Модификации и устранение неполадок метода
В представленном протоколе популяция клеток сначала устойчиво трансцируется с флуоресцентным белком и люциферазой, затем эта популяция трансцируется либо с помощью контрольного вектора, либо с вектором, нацеленным на ген интереса. Это гарантирует, что обе популяции клеток имеют одинаковые флуоресцентные белки и экспрессии люциферазы. Однако в качестве альтернативы можно использовать вирусные векторы, которые одновременно поставляют два из этих компонентов. Действительно, в репрезентативных экспериментах мы использовали zsGreen, выражая ретровирусные векторы, чтобы выразить шРНК в 4T1-люциферазы клеток. Рекомендуется, чтобы экспрессия люциферазы и флуоресцентного белка были проанализированы во всех группах клеток после изменения гена интереса. Различные уровни экспрессии между группами могут осложнить интерпретацию данных, поэтому лучше всего, если различные группы имеют одинаковое выражение как флуоресцентного белка, так и люциферазы. Кроме того, эритроциты могут быть аутофлуоресцентными и могут затруднить визуализацию флуоресцентных метастаз в легких. Если это так, красные кровяные тельца могут быть очищены от легких PBS перфузии во время эвтаназии, чтобы уменьшить аутофлуоресцентный фон (соответствующие методы эвтаназии и руководящие принципы должны соблюдаться). Хотя различия между контролем и нокдаун групп в наших репрезентативных экспериментов являются драматическими, присущие мыши к мыши изменчивость, которая часто существует в in vivo метастазы анализы очевидна в контроль ных мышей (Рисунок 3B и Рисунок 5B). Когда эта изменчивость высока, это может затруднить определение величины эффекта нокдауна. Альтернативный подход, который может быть использован для уменьшения этой изменчивости является обозначение контрольных клеток и нокдаун клеток с различными флуоресцентными белками и различными ферментами люциферазы, а затем смешать две популяции в равных количествах и вводить смесь. Например, контрольные клетки, устойчиво выражающие томатную и ренильную люциферазу, могут быть смешаны с клетками нокдауна, выражающими «Зеленые» и светлячковые люциферазы. In vivo живые устройства изображения животных могут отличить ренилла люциферазы от светлячка люциферазы, и помидоры от SGreen, так что либо флуоресценция или люминесценция могут быть использованы для независимой количественной оценки каждой популяции клеток. Действительно, двойное luciferase изображения 4T1 клеток, растущих в качестве первичных опухолей у живых животных было продемонстрировано с помощью In vivo живого устройства изображения животных4. Однако важно отметить, что в флуоресцентном сигнале может быть совпадение, поэтому в этот подход следует включить спектральный шаг несмешивания (см. руководящие принципы производителей). Кроме того, ренилла luciferase и светлячок luciferase должны быть изображены отдельно с адекватной задержкой времени, что позволяет первый сигнал люциферазы больше не быть обнаруживаемым до изображения второй. Использование различных фторофоров по-прежнему позволяет количество и размер метастазов в легких, которые будут количественно16. Для тестирования метастатической колонизации и роста в других органах, кроме легких, этот протокол можно модифицировать и использовать для инъекций внутрикардии и порттернойвен9,10.

Ограничения метода
Использование устройства визуализации живого изображения животных in vivo для приобретения метастатического бремени в реальном времени в сочетании с флуоресцентно маркированными раковыми клетками обеспечивает мощный метод для ассирования метастатической колонизации и последующего роста; однако этот подход ограничен. Некоторые гены могут потребоваться для врожденного пролиферации клеток, а не конкретные роли в метастазах. In vitro пролиферации клеток анализы могут быть сделаны до эксперимента in vivo, чтобы определить, если ген нарушает рост в пробирке. При визуализации живого животного биолюминесцентный или флуоресцентный сигнал от метастазов должен быть достаточно сильным, чтобы пройти через ткани. Кроме того, оптические свойства (т.е. поглощение и рассеяние) ткани также влияют на обнаружение55. Источник возбуждения света должен быть в состоянии пройти через ткани, чтобы возбудить флуоресцентно помечены раковые клетки и биолюминесценции имеет больший динамический диапазон, чем флуоресценция. Таким образом, хотя флуоресценция может быть использована для живой визуализации животных, биолюминесценция является предпочтительным для обнаружения сигнала во внутренних органах. Кроме того, некоторые иммунокомпетентные штаммы мыши могут отклонять клетки, выражающие флуоресцентные белки. Действительно, мы обнаружили, что клетки, выражающие помидоры, GFP, или mCherry были отклонены или вниз регулируется фторфора при выращивании в BALB / c мышей (данные не показано и15). Тем не менее, как показано здесь(Рисунок 3 и Рисунок 5) и ранее15,16, sGreen помечены клетки обнаруживаются в этих мышей. В тех случаях, когда выражение флуоресцентного белка становится необнаруживаемым, еще один способ количественной оценки относительной метастатической колонизации заключается в использовании qPCR для количественной оценки либо флуоресцентного гена или другого гена в интегрированном вирусном векторе15. Хотя устройство визуализации живого изображения животных in vivo позволяет обнаруживать изменения в метастатическом бремени, оно не позволяет определить, связаны ли эти изменения с измененным размером или количеством метастазов. Он также не предоставляет пространственную информацию о местонахождении метастаз. Кроме того, сила сигнала может зависеть от того, насколько глубоко в ткани это.

Значение метода и потенциальных будущих приложений
Существует множество способов изменения этого подхода, чтобы получить больше или разносторонней информации. Разнообразие линий раковых клеток, включая линии раковых клеток человека или пациента, полученных ксенотрансплантатов могут быть использованы в этом исследовании. Другие модели мыши также могут быть использованы, в том числе трансгенных или нокаут мышей, предназначенных для проверки того, как ориентации белков, сделанных стромальных клеток влияет на метастатическую колонизацию и рост инъекционных раковых клеток. Если есть несколько генов-кандидатов, которые должны быть проверены, этот подход может быть мультиплексирован, потому что in vivo живые устройства изображения животных могут обнаружить и различать широкий спектр флюорофоров. Это позволит сократить количество необходимых мышей и увеличить число целей, которые могут быть проверены. In vivo live animal image также может быть объединена с рентгеновским или CT9 изображения, чтобы обеспечить гораздо больше пространственной информации о местонахождении метастазов. Наконец, этот подход может быть изменен, чтобы рассказать более конкретные шаги в метастатическом каскаде колонизации. Например, шаги, связанные с посевом опухолевых клеток (внутрисосудистое выживание, экстравазация и после экстравазации выживания) можно отличить путем количественной оценки количества опухолевых клеток в легких в несколько точек времени в течение первых 3 дней после инъекции (например, сделано здесь16). В этом случае, легкие также могут быть окрашены сосудистыми маркерами и изображением ex vivo, чтобы определить процент раковых клеток, которые экстравированы в каждый момент56,57.

Таким образом, использование в режиме реального времени in vivo живого изображения животных флуоресцентных и люминесцентных раковых клеток после инъекции хвостовой вены позволяет более подробно анализ того, как кандидат гена или генов влияет на метастатическую колонизацию и последующий рост. Этот подход быстрее и дешевле, чем автохтонусные модели мыши и позволяет избежать некоторых предостережений самопроизвольных моделей метастаз. Использование флуоресценции и люминесценции в качестве средства обнаружения и количественной оценки метастазов дает исследователям независимые считывание, которые повышают уверенность в результатах и обеспечивают гибкость в экспериментальной конструкции. Использование флуоресценции для количественной оценки размера и количества метастазов позволяет избежать необходимости длительных и потенциально дорогостоящих гистологических обработки и анализа, а также позволяет дополнительно использовать целые ткани. Протокол может быть использован с рядом различных методов для манипулирования экспрессией или функцией гена кандидата, таких как РНК, трансгенное выражение, или CRISPR/ Cas-опосредованного редактирования, а также может быть использован для тестирования малых молекул, функции блокирования антител, или других потенциальных терапевтических соединений. Как уже упоминалось выше, несколько простых изменений могут быть внесены для повышения эффективности анализ и предоставить дополнительную информацию. Этот подход является идеальным способом для выявления и тестирования прометастаческих генов, которые имеют терапевтический потенциал для лечения рака.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Эмили Нортон за помощь в борьбе с вирусными инфекциями и критическое чтение рукописи. Мы также благодарим Райана Канаи за помощь в получении изображений легких и Кейт Э. Таббесинг за помощь в анализе изображений зеленых метастазов в легких. Мы благодарим сотрудников научно-исследовательского центра по животноводству за поддержку и помощь в подготовке этого видео. Эта работа была поддержана Сьюзен Г. Komen Карьера Катализатор Грант, который присудил JML (#CCR17477184).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% SDS-PAGE Gel For western blot
2.5% Trypsin Gibco 15090-046 Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate Corning 3922 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks) Taconic BALB-F For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular VWR Ameresco 97061-416 For western blot
Cell lysis buffer Cell Signaling For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm Celltreat 40-229749-CS For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit Promega E1960 For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline Himedia TS1006 For PBS
EDTA VWR 97061-406 Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin VWR 97068-085 Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager Fujifilm For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb Cell Signaling 2118 For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate Thermo Scientific 31460 For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT Invitrogen R70007 Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose GE Healthcare life sciences SH30243.01 Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade VWR Ameresco 97064-810 For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA Molecular devices For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 For western blot
Isoflurane For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device) PerkinElmer CLS136340 For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters) Leica Microsystems Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine Gibco 25030-081 Component of complete growth media
Lipofectamine 3000 Life technologies L3000008 For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program) PerkinElmer Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1 Karmanos Cancer Institute Aslakson, CJ et al.,1992 Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0 Fujifilm Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer) Gibco 31985-062 For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit Thermo Scientific 23225 For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32957 Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Scientific A32953 Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 45-H9268 For infection
Puromycin Sigma-Aldrich 45-P7255 For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer For western blot
TAZ (V3886) Antibody Cell Signaling 4883 For western blot
TBST buffer For western blot
TC20 automated cell counter Bio-Rad For counting cells
Vectors See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope VWR 89404-464 For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt PerkinElmer 122799 Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection) Roche 6365787001 For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb Cell Signaling 14074 For western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15, (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294, (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109, (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10, (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28, (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114, (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52, (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41, (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10, (8), 0135119 (2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6, (11), 27529 (2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30, (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36, (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36, (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134, (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34, (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33, (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1, (21), 89647 (2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8, (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496, (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36, (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35, (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34, (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9, (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26, (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19, (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6, (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19, (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129, (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8, (1), 310 (2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35, (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13, (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70, (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10, (4), 41210 (2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76, (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20, (5), 576-590 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics