Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Oprettelse af kemisk induceret protein denne systemer med ønsket affinitet og specificitet for en given lille molekyle ligand ville have mange biologiske sensing og aktuering applikationer. Her beskriver vi en effektiv, generaliserbar metode til de Novo engineering af kemisk inducerede denne systemer via det trinvise valg af et Phage-vist kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protein denne begivenheder, der kun forekommer i nærværelse af en lille molekyle ligand muliggøre udviklingen af små-molekyle biosensorer til dissektion og manipulation af biologiske veje. I øjeblikket er kun et begrænset antal kemisk induceret denne (CID) systemer findes og ingeniør nye med den ønskede følsomhed og selektivitet for specifikke små-molekyle ligander fortsat en udfordring inden for protein teknik. Vi her beskrive en høj gennemstrømning screeningmetode, combinatoriske binders-enabled svalg af CID (kombinerer-CID), for de Novo engineering af CID-systemer, der gælder for et stort udvalg af ligands. Denne metode bruger to-trins udvælgelse af en Phage-viste kombinatoriske nanobody bibliotek for at opnå 1) "anker bindemidler", der først binder sig til en ligand af interesse og derefter 2) "dimerization bindere", der kun binder sig til anker bindemiddel-ligand komplekser. For at vælge anker bindere screenes et kombinatorisk bibliotek med mere end 109 komplementære NANOKROPPE (CdR)-randomiserede nanopartikler med et biotinyleret ligand, og hits valideres med den ikke-mærkede ligand med bio-Layer INTERFEROMETRI (bli). For at opnå denne bindere, er nanobody Library screenet med anker binder-ligand komplekser som mål for positiv screening og ubundne anker bindere for negativ screening. KOMBINERER-CID er bredt anvendelig til udvalgte CID bindere med andre immunglobulin, ikke-immunglobulin, eller beregningsmæssigt designede stilladser til at skabe biosensorer til in vitro og in vivo påvisning af narkotika, metabolitter, signalering molekyler, etc.

Introduction

CID systemer, hvor to proteiner kun dimerisere i nærværelse af et lille molekyle ligand (figur 1), tilbyder alsidige værktøjer til dissekere og manipulere metaboliske, signalering, og andre biologiske veje1. De har demonstreret potentialet i biologisk aktivering, såsom Drug-kontrollerede t-celle Activation2 og apoptose3,4, for at forbedre sikkerheden og effekten af adoptivt celleterapi. Derudover, de giver en ny metode til in vivo eller in vitro påvisning af små-molekyle mål. For eksempel kan CID proteiner være genetisk smeltet sammen med fluorescens reporter-systemer (f. eks. fluorescens resonans energioverførsel (FRET)5 og cirkulært permuterede fluorescerende proteiner)6 for Real-Time in vivo målinger eller fungere som affinitets reagenser til sandwich enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)-lignende assays.

På trods af deres brede applikationer, skabe nye CID-systemer, der kan styres af en given lille molekyle ligand har store udfordringer. Etablerede protein binder teknik metoder, herunder dyre immunisering7, in vitro udvælgelse8,9, og Computational protein design10 kan generere ligand bindende proteiner, der fungerer via binære protein-ligand interaktioner. Men, disse metoder har svært ved at skabe en ligand-induceret ternære CID kompleks. Nogle metoder skabe CID ved kemisk forbinder to ligander, der selvstændigt binder sig til de samme eller forskellige proteiner11,12,13,14,15,16 eller stole på at vælge bindemiddel proteiner såsom antistoffer rettet mod præ eksisterende lille molekyle-protein komplekser17,18, og dermed har et begrænset valg af ligander.

Vi har for nylig udviklet en combinatoriske binders-eNABLED svalg af CID (kombinerer-CID) metode til de Novo engineering af CID Systems19. Denne metode kan opnå den høje specificitet af ligand-induceret denne (f. eks. en anker-denne bindemiddel dissociation konstant, Kd (uden ligand)/Kd (med ligand) > 1.000). Den denne specificitet opnås ved hjælp af anker bindemidler med fleksible bindingssteder, der kan indføre konformationelle ændringer på ligand binding, hvilket giver et grundlag for udvælgelsen af konformationelt selektive bindemidler kun anerkender ligand-bundne anker bindemidler. Vi demonstrerede et proof-of-princip ved at skabe cannabidiol (CBD)-inducerede Heterodimere af nanokroppe, et 12 – 15 kDa funktionelt antistof fragment fra brug bestående af et universelt stillads og tre fleksible CdR loops (figur 2)20, som kan danne en bindende lomme med tilpasningsdygtige størrelser til små molekyle epitoper21,22 Især bør in vitro-udvælgelsen af et kombinatorisk protein bibliotek være omkostningseffektiv og generaliserbar for CID-teknik, fordi det samme højkvalitets bibliotek kan anvendes til forskellige ligands.

I denne protokol og video fokuserer vi på at beskrive to-trins in vitro udvælgelse og validering af anker (figur 3A) og denne bindere (figur 3B) ved at screene det kombinatoriske nanobody bibliotek med en mangfoldighed højere end 109 ved hjælp af CBD som et mål, men protokollen bør gælde for andre protein biblioteker eller små-molekyle mål. Screeningen af CID bindere tager normalt 6 – 10 uger (figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. biblioteksbygning

  1. Brug et syntetisk kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek med en mangfoldighed på ~ 1.23 – 7.14 x 109, som tidligere beskrevet19. Mens denne protokol ikke omfatter Biblioteks konstruktion, kan den anvendes på andre kombinatoriske binder biblioteker.

2. biotinylering af ligand-mål eller ligand

  1. Biotinylat den valgte ligand, for eksempel, CBD og tetrahydrocannabinol (THC)19, via forskellige kemiske syntese strategier, afhængigt af de egnede biotinylation steder af et mål.

3. screening af anker binder

  1. Begyndelse af udvælgelse
    1. Begynd hver runde af udvælgelsen ved at inokulere en enkelt TG1-celle koloni, frisk dyrket i 6 mL 2YT ved 37 °C og 250 omdrejninger pr. minut (rpm) til en 600 nm (OD600) absorbans af ~ 0,5. Cellerne på isen inkubates til brug i trin 3.5.1.
  2. Negativt udvalg med biotin-bundne streptavidin perler
    1. Forbered "negative markering perler" ved at vaske 300 μL streptavidin-belagte magnetiske perler ved hjælp af en magnetisk adskillelse rack, 3x med 0,05% fosfat-bufferet saltvand med Tween buffer (PBST, 1 x PBS med 0,05% Vol/Vol Tween 20%) og 2x med 1 x PBS.
    2. Resuspendér perlerne med 1 mL 1% Casein i 1 x PBS (pH = 7,4), og mæt perlerne ved at tilføje 5x den rapporterede bindings kapacitet ved hjælp af biotin. Inkubér ved stuetemperatur (RT) på en rotator i 1 time.
    3. Vask perlerne 5x ved hjælp af 0,05% PBST og 3x med 1 x PBS, for i alt otte skyller.
    4. Tilsæt ~ 1013 fagtypning-partikler i 1% Casein/1% BSA i 1 x PBS (pH = 7,4) og Inkuber ved rt på en rotator i 1 time.
    5. Efter inkubation opsamles supernatanten, der skal anvendes i trin 3.3.6.
  3. Positivt udvalg med biotinylerede ligand-bundne streptavidin perler
    1. Forbered "positive Selection perler" ved hjælp af 1/2 mængden af perlerne, der anvendes til "negative udvælgelse perler" efter trin 3.2.1.
    2. Resuspendér perlerne med 1 mL 1% Casein i 1 × PBS, pH 7,4 og mæt perlerne ved at tilføje 5x den fulde bindings kapacitet beregnet på grundlag af manualen ved hjælp af det biotinylerede ligand valg. Inkubér på RT på en rotator i 1 time.
    3. Vask perlerne 5x ved hjælp af 0,05% PBST og 3x med 1 x PBS, for i alt otte skyller.
    4. Perler med 1 mL 1% Casein/1% BSA i 1 x PBS (pH = 7,4) og Inkubér ved RT på en rotator i 1 time for at forhindre uspecifik binding mellem fager og streptavidin-belagte magnetiske perler.
    5. Vask de streptavidin-belagte magnetiske perler 3x med 0,05% PBST og én gang ved hjælp af 1 x PBS, for i alt fire skyller.
    6. Resuspension af de streptavidin-belagte magnetiske perler ved hjælp af ubundne fager taget fra trin 3.2.5 og Inkubér ved RT på en rotator i 1 time.
    7. Ekstrahere supernatanten uden at forstyrre de magnetiske perler. Gem de ubundne fager som input, der skal bruges i trin 3.5.1.
    8. Vask perlerne 10x ved hjælp af 0,05% PBST og 5x ved hjælp af 1 x PBS. I mellem hver tre skyller overføre dem til et nyt rør for at undgå fager ikke specifikt bundet til rørvæggene.
  4. Eluering af Phage-viste nanokroppe
    1. Kompetitivt eluere bundne fager ved at tilsætte 450 μL af det ikke-biotinylerede ligandved hjælp af en koncentration i mikrometer området (f. eks. 10 – 50 μM) og inkuberer ved rt på en rotator i 30 min. Den valgte ligand-koncentration for den konkurrencemæssige eluering af bundne fager afhænger af ønsket KD af "anker binder". Ligand-koncentrationerne kan være relativt høje i indledende udvælgelsesrunder og derefter reduceret i senere runder.
    2. Saml supernatanten og Gem de eluede fager som output, der skal bruges i trin 3.5.2.
  5. Input/output-titreringer og-infektion
    1. Ved input titrering forberedes 10x serielle fortyndinger i 1 x PBS op til 109gange med indgangs-fagtypning fra trin 3.3.7. Brug de 107– 109 serielle fortyndinger til at gøre infektioner ved at overføre 10 μl input fagtypning fra hver fortynding til 70 μl TG1 celler (OD600 af ~ 0,5). Inkuber ved 37 °C i 45 min., plade de inficerede TG1 celler på 3 90 mm 2YT-agar retter indeholdende 100 μg/mL ampicillin og 2% (WT/vol) glucose, og Inkuber natten over ved 37 °C. Fra natpladerne kan fagtypning-input beregnes på følgende måde:
      Equation 1
    2. For output infektion og titrering, Overfør de eluede fager fra trin 3.4.2 til 3 mL af TG1 celler (OD600 af ~ 0,5). Der inkubates i et vandbad ved 37 °C i 45 min. Derefter forberedes 10x serielle fortyndinger i 2YT op til 103gange, plade hver fortynding på 90 mm 2yt-agar retter, og inkuberes natten over ved 37 °c. Fra overnight plader, kan fagtypning output beregnes som følger:
      Equation 1
    3. De resterende inficerede TG1 celler opdeles på 3 150 mm 2YT-agar-plader indeholdende 100 μg/mL ampicillin og 2% (WT/vol) glucose. Inkuber pladerne natten over ved 37 °C.
  6. Bibliotek forstærkning og nyttiggørelse for yderligere runder af udvælgelse
    1. Tilsæt 3 mL 2YT pr. plade, skrabe med en steril celle skraber og Saml alle celler i et 50 mL konisk rør. Bland de indsamlede celler med steril glycerol (20% WT/vol endelig koncentration). Mål OD600 af blandingen og gøre 3 – 5 Stock Aliquots. Opbevares ved-80 °C ved langtidsopbevaring.
    2. For fagtypning Rescue fortyndes den phagemid-holdige TG1 bakterielle blanding ved hjælp af 25 ml 2yt-medier suppleret med 2% glucose og 100 μg/ml ampicillin til en OD600 af ~ 0,1. Dyrknings celler ved 37 °C og 250 rpm til en OD600 af ~ 0,5.
    3. Superinficere cellerne ved at tilføje CM13 Helper fagtypning ved 5 x 109 PFU/ml og inkubere ved 37 °c og 250 rpm for 45 min. CM13 Helper fagtypning leverer nødvendige fagtypning coat proteiner til samling af komplette fagtypning partikler.
    4. Centrifuger kulturen ved 8.000 x g i 10 minutter for at fjerne glukose. Resuspendér cellerne med 50 mL 2YT-medier suppleret med 100 μg/mL ampicillin og 50 μg/mL kanamycin og Inkuber ved 25 °C og 250 rpm natten over.
    5. Cellerne centrifugeres fra overnight kulturen ved 9.000 x g, 4 °c i 30 min. Overfør supernatanten til et nyt rør og udfældning af fager i supernatanten ved hjælp af 1/5 volumen pind/NaCl opløsning (20% WT/vol polyethylenglycol-6.000 og 2,5 M NaCl). Bland forsigtigt og læg på is i 1 time.
    6. Der opsamles fagtypning partikler ved centrifugering med 12.000 x g ved 4 °c i 30 min. resuspension af pellets med 1 ml 1 x PBS, og Overfør suspensionen til et mikrocentrifuge glas. Centrifugeglasset centrifugeres ved 20.000 x g og 4 °c i 10 minutter for at fjerne rest bakterier.
    7. Supernatanten overføres til et nyt mikrocentrifuge glas uden at forstyrre den bakterielle pellet. Brug en 1:100 fortynding til at måle absorptionen ved 269 nm og 320 nm. Det samlede antal fager kan beregnes ved hjælp af følgende formel23:
      Equation 3
    8. Opbevar fagtypning-biblioteket ved 4 °c til kort tids brug eller med 25% glycerol ved-80 °c til langtidsopbevaring.
    9. Gentag markerings runder (trin 3.1 – 3.6) for 3 – 6 runder, eller indtil den ønskede berigelse er observeret (Se afsnittet resultater). Plade og plukke enkelt kloner (afsnit 4) for at karakterisere deres affinitet og specificitet til ligand (afsnit 5 – 7).

4. isolation af enkelt klon

  1. For at isolere individuelle kloner fra en beriget sublibrær, forberede 10x serielle fortyndinger af Phage-inficerede TG1 celler (trin 3.5.2). Plade serielle fortyndinger på 90 mm 2YT-agar-retter indeholdende 100 μg/mL ampicillin og 2% (WT/vol) glucose og Inkuber ved 37 °C natten over.
  2. Fra overnight plader, plukke enkelt kolonier til 250 μL af 2YT medier suppleret med 100 μg/mL ampicillin per brønd i sterile dybe-brønd plader og vokse ved 37 °C natten over.
  3. Fra overnight kulturer, inokulere 10 μL til 500 μL friske 2YT medier suppleret med 100 μg/mL ampicillin.
  4. Vokse celler til en OD600 af ~ 0,5, tilsæt CM13 Helper fagtypning ved 5 x 109 PFU/ml og inkubere ved 37 °c og 250 rpm for 45 min.
  5. Tilsæt 500 μL 2YT-medier suppleret med 100 μg/mL ampicillin og 50 μg/mL kanamycin. Inkuber ved 25 °C og 250 rpm natten over.
  6. Centrifuger dybtliggende plader fra overnight kulturer ved 3.000 x g i 10 min. Saml supernatanten indeholdende fagtypning partiklerne uden at forstyrre celle pellet.
  7. Phage-partikler kan anvendes til ELISA til at bestemme specificiteten af de udvalgte kloner til ligand. Biotin eller en strukturel ligner af målet kan bruges som en negativ kontrol.

5. anker binder validering af ELISA

  1. Frakke 96 brønd ELISA plader ved hjælp af 100 μL af 5 μg/mL streptavidin i belægning buffer (100 mM carbonatbuffer, pH = 8,6) ved 4 °C natten over.
  2. ELISA-pladerne vaskes 3x med 0,05% PBST og tilsættes 100 μL 1 μM biotinyleret mål til målbrøndene. Tilsæt 100 μl af 1 μM biotin eller mål ligner til kontrol brøndene. Inkuber ved RT i 1 time.
  3. Vask plader 5x med 0,05% PBST og Bloker uspecifik binding ved at tilføje 300 μL 1% Casein i 1 x PBS. Inkuber ved RT i 1 time.
  4. ELISA-pladerne vaskes 3x med 0,05%-PBST og tilsættes den rensede fagtypning-supernatant. Inkuber i 1 time ved RT.
  5. ELISA pladerne vaskes 10x med 0,05% PBST og tilsættes 100 μL peberrod-peroxidase (HRP)-M13 Major coat-protein-antistof (1:10000 fortynding med 1 x PBS med 1% kasein). Inkuber ved RT i 1 time.
  6. ELISA-pladerne vaskes 3x med 0,05% PBST og tilsættes 100 μL tetramethylbenzidin (TMB) substrat. Inkuber i 10 min., eller indtil der observeres en synlig farveændring. Stop reaktionen ved at tilsætte 100 μL af 1 M HCl. Læs pladen ved 450 Nm på et spektrofotometer.
  7. For protein ekspression og rensning, vælge de kloner, der viser høj affinitet og specificitet for målet (Se diskussion).

6. protein ekspression, rensning og biotinylering

  1. Som tidligere rapporteret19, subklon udvalgte kloner fra afsnit 5 og udtrykke som C-Terminal AVI-mærkede og hans-mærkede nanokroppe.
  2. Udtrykke udvalgte nanolegemer i periplasmaet af E. coli WK6 celler (typisk i 1 L kultur), frigivelse af osmotisk chok, og rense ved hjælp af en nikkel-NTA kolonne (Se tabel over materialer).
  3. Ombytnings buffer med en afsaltningkolonne (1 x PBS med 5% glycerol; Se tabel over materialer).
  4. Biotinylatnanokroppe ved hjælp af et kommercielt Kit (Se tabel over materialer) til videre anvendelse.

7. anker bindemiddel karakterisering af BLI

  1. Analysér bindings affiniteten og kinetikken for udvalgte anker bindere ved at immobilisere 200 nM biotinylerede anker bindere på streptavidin-biosensorer (Se tabel over materialer) med bindende analyse buffer (1 x PBS (pH = 7,4), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA, 3% methanol).
  2. Beregn dissociations konstanter (KD) for anker binder-ligand-interaktioner ved Steady-State-analyse ved hjælp af dataanalyse software (Se tabel over materialer). De opnåede KD -værdier spænder typisk fra enkelt-til tocifret micromolar.

8. dimerization projektmappe screening

Bemærk: biopanning screening af "dimerization bindemidler" svarer til den af anker bindere, bortset fra to kritiske trin: 1) Dimerization bindere vælges ved hjælp af en udvalgt biotinyleret anker binder og anker binder-ligand kompleks for den negative og positive valg. 2) under elueringstrinnet anvendes 100 mM triethylamin til at belyse positivt udvalgte fager, der kun var bundet til anker binder--ligand-målkomplekset. 100 mm trimethylamin opløsning (pH = 11,5) bruges til at elueres positive kloner ved at forstyrre protein interaktioner.

  1. Begyndelse af udvælgelse
    1. Begynd hver runde af udvælgelsen ved at inokulere en enkelt TG1 celle koloni, frisk dyrket på et minimalt medie, i 6 mL 2YT ved 37 °C og 250 rpm til en OD600 af ~ 0,5. Incubate celler på is.
  2. Fjernelse af negativt udvalgte nanokroppe
    1. Forbered "subtraktions røret" ved hjælp af 400 μL streptavidin-belagte magnetiske perler og følg trin 3,2. Men i stedet for at mættet med biotin tilsættes 5x den beregnede fulde bindings kapacitet ved hjælp af det valgte biotinylerede anker binder og gemmer de ubundne fager, der skal anvendes i trin 8.3.3.
  3. Udvælgelse af positivt udvalgte nanokroppe
    1. Forbered "indfangning af røret" ved at bruge 1/2 mængden af streptavidin-belagte magnetiske perler, der anvendes til "subtraktions røret" og efter trin 3.3.2 til 3.3.3. I stedet for at mættet med biotinyleret ligand tilsættes fem gange den beregnede fulde bindings kapacitet ved hjælp af det valgte biotinylerede anker binder.
    2. At danne anker binder-ligand kompleks for den positive denne binder udvælgelse, tilføje en høj nok koncentration af ikke-biotinylated ligand. Dette vil gøre det muligt for de fleste streptavidin-bundne anker binder at danne det ligand-bundne kompleks.
    3. Følg trin 3.3.3 til 3.3.8 ved hjælp af de ubundne fager taget fra "subtraktions røret".
  4. Eluering af positivt udvalgte nanokroppe
    1. Elute de fager bundet til anker bindemiddel-ligand kompleks ved at tilføje 450 μL af 100 mM triethylamin, og inkuberer på RT på en rotator i 10 min.
    2. Saml de konkurrencedygtige elueret fager og følg trin 3.4.1 til 3.4.2.
  5. Yderligere runder af denne projektmappe udvælgelse
    1. Følg trin 3,5 og 3,6 for at forstærke og gendanne biblioteket for at udføre yderligere valgrunder. Gentag runder af udvælgelse for 3 – 6 runder eller indtil den ønskede berigelse er observeret. Plade og plukke enkelt kloner (Se afsnit 4) for at karakterisere deres affinitet og specificitet til målet.

9. dimerization bindemiddel karakterisering af ELISA

  1. Følg trinene i afsnit 4 for at isolere individuelle kloner til karakterisering via ELISA.
  2. For at teste affiniteten af denne binder kandidater til anker binder-ligand kompleks, frakke Elisa målpladen ved hjælp af 100 μl af 100 nm biotinyleret anker binder. Efter inkubation i 1 time tilsættes 1 μM af ligand-målet for at danne anker Binderen-ligand-komplekset.
  3. Kontrolpladen skal være belagt med biotinyleret anker binder alene for at screene kloner, der også kan binde sig til den frie anker binder. Tilsæt 100 μL 100 nM biotinyleret anker binder og Inkuber ved RT i 1 time.
  4. Følg afsnit 5.3 – 5.7.

10. dimerization bindemiddel karakterisering af BLI

  1. Den bindende affinitet og kinetik af denne bindere til anker binder--ligand-komplekset kan analyseres ved at immobilisere biotinylerede denne bindere på streptavidin (SA) biosensorer med bindende analyse buffer og derefter analyseret med 1 μM anker binder præ-ækvibreret med serielle fortyndinger af ligand. Den kD, kon, og koff af interaktioner kan beregnes ved hjælp af vores rapporterede metode19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi beskriver to-trins in vitro udvælgelse og validering af anker og denne bindere ved at screene det kombinatoriske nanobody bibliotek med en mangfoldighed højere end 109 ved hjælp af CBD som et mål. Vurdering af tilsætning af fagtypning biopanning under de efterfølgende runder af udvælgelse for både anker og denne bindemidler er vigtig. Typiske berigelse resultater efter 4 – 6 runder af udvælgelse som vist i figur 5 er en god indikation af, at der er en høj grad af potentielle hits i sublibraries, så yderligere runder af udvælgelse kan ikke være nødvendigt.

ELISA med enkelt klon er egnet til at analysere den relative bindingsaffinitet og selektivitet af anker og denne bindere. Figur 6a er et repræsentativt valgresultat for anker binder efter seks runder af biopanning. Kloner, der udviser høj (f. eks. #87) eller lav (f. eks. #27) ligand selektivitet, kan sammenlignes. Høj selektivitet kloner bør vælges som anker binder kandidater. På samme måde viser figur 6B den denne projektmappe valgresultater efter fire runder af biopanning. Vi observerede typisk kloner, der dannede en heterodimer med den immobiliserede anker binder kun med ligand (fx, #49) eller uden (f. eks #80). Førstnævnte, der viser denne specificitet, bør vælges til yderligere validering.

Anker binder ELISA er afhængig af brugen af det biotinylerede mål. Derfor er vi nødt til at bruge BLI til yderligere at bekræfte bindingen til det ikke-mærkede mål. BLI tillader også karakterisering af bindende kinetik. Repræsentative BLI-resultater af anker-og dimeriseringbindere er vist i henholdsvis figur 7A og 7b. De venstre paneler viser ligand koncentrationsafhængig binding, hvilket tyder på, at de er egnede til at konstruere et CID-system. De rigtige paneler viser de negative kontroller. Den beregnede KD af anker og denne binder interaktioner i nærværelse af ligand typisk varierede fra tocifret nanomolær til tocifret micromolar. De kan variere afhængigt af ligand og det kombinatoriske bibliotek af valg.

Analytisk størrelse-udelukkelses kromatografi (SEC) blev udført for at bekræfte heterodimerdannelsen mellem anker og denne bindere. En denne peak blev observeret, når anker og denne bindere og CBD blev blandet (figur 8A, rød linje). I modsætning hertil blev der ikke påvist nogen denne Peak i fraværet af CBD (figur 8A, blå linje), eller når hver bindemiddel blev indlæst til kolonnen alene (figur 8B). Den kemiske binding blev brugt til at stabilisere CID komplekser, og tvær tilknyttede nanokroppe har lidt forøgede størrelser svarende til tidligere elueret toppe.

Figure 1
Figur 1: mekanisme af kemisk induceret protein dimerization. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: skematisk af genereringen af et syntetisk nanobody kombinatorisk bibliotek. Biblioteket er konstrueret ved hjælp af en universel nanobody stillads og indarbejde designede fordelinger af aminosyrer til hver randomiseringsposition i tre komplementaritet-bestemmelse regioner (CDRs) ved en Trinucleotid mutagenese (TRIM) teknologi 24. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: rutediagram over (A) anker og (B) denne projektmappe screening. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: tidslinje for kombinerer-CID. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: tilsætning af fagtypning titre efter hver runde af biopanning for valget af anker binder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: repræsentative ELISA-resultater, der viser positive (+) og negative (*) kloner. A) ELISA-resultater af anker bindemiddel fra 96 tilfældigt plukkede kloner efter seks udvælgelsesrunder. (B) dimerisering bindemiddel ELISA resultater af 96 tilfældigt plukket kloner efter fire runder af udvælgelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: ankre og denne bindemiddel kinetisk analyse af bli. (A) analyse af anker Binderen med ikke-mærket CBD (venstre) og THC (højre). Biotinyleret anker binder blev immobiliseret på Super Streptavidin (SSA) biosensorer titreret med forskellige koncentrationer af CBD. Målte data for CBD binding (røde kurver) var globalt monteret (grå linjer). B) venstre, bli-analyse af en SA biosensor-immobiliseret denne binder bindende til anker binder, som er præligevægt med forskellige koncentrationer af CBD. Højre, blev anker binder koncentrationen titreret og bundet til den immobiliserede denne binder i fravær af CBD. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: SEC-analyse af heterodimeriseringen mellem anker og denne bindere. A) denne og anker bindere (5 μM hver) ved tilstedeværelse eller fravær af CBD var tværbundet af 100 μM bis-N-succinimidyl-(pentaethylenglycol) ester i 30 min ved rt før analysen. Elueringsvolumener af protein standarder er markeret med trekanter. B) ikke-tværbundet anker og dimeriseringbindere (30 μM hver) blev injiceret separat. Kromatogrammer i A og B er vist i forskellige Y-skalaer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er afgørende at vælge de korrekte koncentrationer af input fagtypning biblioteker til forskellige runder af biopanning. Vi startede typisk fra et input bibliotek af ~ 1012-1013 fagtypning partikler med en mangfoldighed > 109, så ~ 100-1000 eksemplarer af hver fagtypning klon, der skal præsenteres i pull-down assay. Hvis fagtypning koncentrationen i en bindende analyse er for høj eller lav, vil sandsynligheden for ikke-specifik binding eller tab af positive kloner stige. Det anker eller denne binder valg normalt består af tre til seks runder af biopanning, og output fagtypning tæller normalt starter fra ~ 104 og stiger til ~ 108– 109. Det er egnet til at plukke enkelt kloner til ELISA validering efter at have observeret en sådan berigelse. Yderligere runder af biopanning kan mindske chancerne for at identificere passende lav-overflod positive kloner.

Det er vigtigt at oprette passende negative kontroller og valg for at øge succesen af valgene. For eksempel vil brugen af strukturelle analoner af ligand mål lette udvælgelsen af ligand specificitet. I vores arbejde, en meget lignende analog, THC, blev brugt som en kontrol for CBD i ELISA og bli validering af anker og denne bindere19. Hvis anker bindere har en relativ lav ligand-bindingsaffinitet, kan både frie og ligand-bundne anker bindere præsenteres som mål i det positive valg. Det er derfor vigtigt grundigt at fjerne bindemidler, der binder sig til frie anker bindere under det negative valg. Dette kan opnås ved at udføre flere runder af subtraktionen med frie anker bindere.

En begrænsning af vores protokol er, at Target molekyler skal være biotinylated for anker binder udvælgelse og kun én eller et par anker bindemidler kan bruges til denne udvælgelse. Anvendelsen af biotinylerede mål kan berige bindemidler, der delvist binder sig til Binderiet mellem biotin og mål. Det er derfor vigtigt at validere hits ved hjælp af umærkede mål ved BLI eller andre teknikker. At vælge en enkelt eller et par anker bindere til denne binder valg kan mindske chancen for at identificere CID-systemer med passende følsomhed og specificitet. Den multiplexing kapacitet af udvælgelsen afventer således yderligere forbedring ved kobling til andre teknikker-for eksempel enkelt-molekyl-interaktion sekvensering (SMI-SEQ), som muliggør en "Library-by-Library" protein-protein interaktion screening25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Et foreløbigt patent i forbindelse med dette arbejde er blevet indgivet af University of Washington.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af University of Washington Innovation Award (til L.G.), et tilskud fra de amerikanske National Institutes of Health (1R35GM128918 til L.G.), og en Startup fond af University of Washington (til L.G.). H.J. blev støttet af en Washington Research Foundation bachelor Fellowship. K.W. blev støttet af et bachelor stipendium fra University of Washington Institute for protein design.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359, (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350, (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105, (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365, (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129, (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29, (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19, (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501, (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262, (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382, (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383, (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20, (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17, (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14, (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37, (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141, (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20, (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430, (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. The Single-Stranded DNA Phages. 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515, (7528), 554-557 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics