Test dla Przyczepność i Invasion Agar w S. cerevisiae

Published 11/08/2006
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Opisujemy to test na przyczepność drożdży i inwazji agar jako miara zróżnicowania inwazyjne i pseudohyphal. Ten prosty test może być wykorzystane do oceny inwazyjnym fenotypem różnych mutantów, jak również wpływu na środowisko pamięci i szlaków sygnałowych różnicowania drożdży.

Cite this Article

Copy Citation

Guldal, C. G., Broach, J. Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (1), e64, doi:10.3791/64 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Drożdże są na naturalnych biofilmu, gdzie wielu mikroorganizmów kolonizacji powierzchni. W sztucznych warunkach, takich jak powierzchnie obiekty stworzone przez człowieka, biofilmu może zmniejszyć wydajności przemysłu, zniszczyć struktury i zagrażają ludzkiemu życiu. 03/01 Z drugiej strony, wykorzystanie mocy biofilmu może pomóc czyste środowisko oraz zrównoważony energii. 08/04 Możliwość S. cerevisiae do kolonizacji powierzchni i uczestniczą w złożonych biofilm był zazwyczaj ignorowane aż do ponownego odkrycia programów zróżnicowanie wywołane przez różne szlaki sygnałowe i wskazówki dla środowiska w tym organizmie. 9, 10 nadal zainteresowanie wykorzystaniem S. cerevisiae jako organizm modelowy do zrozumienia interakcji i zbieżności ścieżek sygnałowych, takich jak Ras-PKA, Kss1 MAPK i Hog1 osmolarności ścieżek, szybko umieścić S. cerevisiae w zbiegu biofilmu biologii i badaniach transdukcji sygnału. 20/11 W tym celu różnicowania komórek drożdży w długie, klej, nici pseudohyphal stał się wygodny odczyt do aktywacji szlaków transdukcji sygnału na różne zmiany w środowisku. Jednak filamentacji jest złożonym kolekcji fenotypów, co sprawia, oznaczanie to tak, jakby był prosty fenotyp mylące. W ciągu ostatniej dekady, kilka testów udało się przyjąć od bakteryjnego biofilmu badań do badań drożdże, takie jak testy formacji MAT do pomiaru rozprzestrzeniania kolonii w miękkim agarze i barwienia fioletem krystalicznym ilościowego pomiaru powierzchni komórek przestrzegania. 12, 21 Jednak nie było pewne zamieszanie w testach opracowanych do jakościowo ocenić kleju i inwazyjne fenotypy drożdży w agar. Poniżej przedstawiamy proste i niezawodne metody oceny kleju i inwazyjne jakości szczepy drożdży z łatwym do zrozumienia kroki w celu odizolowania oceny przyczepności z oceny inwazji. Nasze metody, przyjęte z poprzednich badań, 10, 16 dotyczy komórek rosnących w ciekłych i poszycia na różnicy odżywczych warunków dla wzrostu dużych punktów, które następnie zmyć wodą w celu oceny przyczepności i pocierać komórek całkowicie z powierzchni agaru ocenić inwazję agar. Eliminujemy potrzebę smug komórek na agar, co wpływa na inwazję komórek w agar. Ogólnie rzecz biorąc, zauważyliśmy, że haploidalnych szczepów, które atakują agar zawsze kleju, ale nie wszystkie szczepy kleju można najechać agarze. Nasze podejście może być stosowany w połączeniu z innymi testy dokładnie przeanalizujemy kroki różnicowania i wymagania transdukcji sygnału drożdży, różnicowanie, wykrywania kworum, a tworzenie biofilmu.

Protocol

  1. Umieść 200ul kultur rosnących odsetek od syntetycznych mediów płytkach z wymaganych warunków głodu (SC z 2% glukozy w porównaniu z SC z 0,2% glukozy, na przykład) Jeżeli gęstość kultur różnią się zbytnio od siebie, zmienić liczbę komórek na kulturę 200ul więc każda kropla jest w przybliżeniu taką samą ilość komórek.
  2. Upewnij się, że do prowadzenia ewidencji, które spadku na płytach, które jest kultura.
  3. Przechowywać uchylone wieko płyty i pozostawić albo w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 30 ° C, aż krople są suche.
  4. Płyty Seal z parafilmie i folią (opcjonalne) i pozostawić w temperaturze 30 ° C przez 3-7 dni.
  5. Dokument wzrost komórek na płytkach (przez skanowanie, biorąc obrazu cyfrowego, itp.)
  6. Przemyć komórki z powierzchni agaru z wodą pod wysokim ciśnieniem (najlepiej wody DI) przez około minutę dbanie o agar nie do zniesienia i zmiany orientacji.
  7. Pozbyć się nadmiaru wody, wybierając płyty na ręczniki papierowe i pozostawiając je otwarte do wyschnięcia.
  8. Gdy płyty są suche przyczepność dokument na każdej płytce (przez skanowanie lub robienie cyfrowych zdjęć)
  9. Z palec w rękawiczce, delikatnie zetrzeć komórki tworzą na powierzchni agaru pod bieżącą wodą przez około minutę.
  10. Wysuszyć płytki jak wcześniej.
  11. Jeśli korzystasz z zakresu prosektorium, usunąć igłę przed umieszczeniem płyty na platformę mikroskopem.
  12. Inwazja dokumentu w powiększeniu 10x lub 40x. Upewnij się, że koncentrują się na środkowej części każdego okręgu, do krawędzi będą zbyt zatłoczone, aby zobaczyć poszczególne morfologii komórek. Krawędzie mogą wskazywać poziom nitkowatych wzrostu i może być udokumentowane w przyszłości. Skanowanie lub biorąc cyfrowy obraz całego tabliczka może być również pomocne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Drożdże wyświetlania różnych rodzajów zróżnicowania w zależności od składników odżywczych dostępności i warunków środowiskowych, w tym formowanie sporów w warunkach głodu i stresu, filamentacji w różnych substancji odżywczych podkreśla i flokulacji. Różne drożdży, w tym S. cerevisiae i C. albicans, można znaleźć również w biofilm utworzony przez zestaw różnorodnych mikroorganizmów. Choć istnieje pewna korelacja z filamentacji i zachowania inwazyjne, nie jest jasne, jak dokładnie filamentacji może spowodować inwazję i kolonizację powierzchni i tkanek. Drożdże z pewnością można znaleźć zarówno wegetatywnego i nitkowate formy w biofilmu w przyrodzie, jak również miejsca, w których zagrożenie dla zdrowia ludzi, takich jak cewniki i zakażonych narządów człowieka. 13/10 W celu zrozumienia ścieżek sygnałowych wykorzystywane przez drożdże do zakażenia zwierząt i do udziału w biofilmów szkodliwe i pożyteczne, musimy opracować dostępne i wiarygodne testy. Tutaj mamy opracowany test, przyjęty od już istniejących przyczepność i testy inwazji dostępna dla drożdży, które pozwalają określić jakościowo klej i inwazyjne fenotypy szczepów drożdży i mutantów w różnych warunkach. Test przedstawiony tutaj eliminuje wymóg smug komórek drożdży na agar, gdzie sama akcja smug na powierzchni agaru zmian inwazyjnych i adhezyjne drożdży. Obrazowania cyfrowego zwłaszcza komórek inwazji przez mikroskop pozwala na pół-ilościowej oceny stopnia inwazji i przyczepność. Takie wykrywanie komórek inwazyjnych i klej jest bezpłatne jednolitego agar komórek testu inwazji opracowany przez laboratorium Sprague 9 i mogą być dostosowane do eksperymentów oczywiście czasu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Chcielibyśmy podziękować Lisa Schneper i Katrin Duevel ich wgląd w rozwój tego testu.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Moticam 350 Camera Motic discontinued (new model: Moticam 352) A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
  2. Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
  3. Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
  4. Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
  5. Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
  6. Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
  7. Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. van, Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
  8. Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
  9. Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
  10. Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
  11. Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
  12. Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers' yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
  13. Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
  14. Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
  15. Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
  16. Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
  17. Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
  18. Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
  19. Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
  20. Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
  21. Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats