頭蓋窓を介して新皮質の血流の2光子イメージングのための方法

Biology

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Summary

皮質血流のダイナミクスは、2光子顕微鏡による齧歯類の尾静脈に注射イメージング蛍光デキストランの色素によってin vivoで研究することができます。このビデオでは、どのようにガラスで覆われた頭蓋窓の準備を通じて、マウスの新皮質における画像の血流動態に表示されます。

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Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678, doi:10.3791/678 (2008).

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Abstract

生きているげっ歯類の無傷の脳内イメージを脳血管系を(大血管から毛細血管まで)と、レコードの血流の力学への能力は強力な手法です。頭蓋窓を通して、生体内での2光子顕微鏡を使用して、それは、静脈内に注射画像蛍光色素に可能です。これは、画像皮質血管系を、また、血流の測定値を得るために1つが許可されます。この技術は当初、David K​​leinfeldとヴィンフリートデンクによって開発されました。方法は、神経変性疾患で、脳の腫瘍に、または正常な脳生理学では、脳虚血中または後に血流のダイナミクスを研究するために使用することができます。例えば、それはどのように脳卒中の原因の血流の方向の変化と梗塞とその周辺の赤血球速度または磁束の変化を研究するために使用されています。ここでは、尾静脈に注入する蛍光染料を使用して生きているマウスの新皮質での画像の血流動態を2光子顕微鏡を使用する方法を示します。

Protocol

蛍光デキストランの色素の尾静脈に注射

  1. イメージ脳血管系への順序で、動物が蛍光色素を静脈内注射する必要があります。デキストランの部分は、脳血液関門を通過し、血管外に漏れるの染料を防止するため我々は、デキストランコンジュゲート色素を使用してください。
  2. マウスは、(誘導4%、注入時の1.5から2パーセント)イソフルランで麻酔する。
  3. 尾は70%アルコールで消毒されています。
  4. 26ゲージの針で、生理食塩水に溶解したローダミンデキストランの5%v / v溶液の75〜100μlを尾のシャフトの途中、尾静脈を介して注入される。
  5. 染料は、約2時間でローダミン染料を使用している場合はピンクオンになります尿に排泄されるまで、動物は、尾静脈注射後すぐに画像化されることがあります。

二光子顕微鏡を用いて血流のイメージング(画像化船の数に応じて継続時間の合計、セッションごとに30〜60分間、)

  1. 蛍光デキストラン色素の注入に続いて、マウスが(誘導のための4%、イメージングのための1から1.5パーセント)イソフルランで麻酔です。
  2. マウスは、しっかりと動物を暖かく保つために熱安定化加熱パッドが含まれている顕微鏡のステージにチタン棒を、使用して接続されます。いくつかの眼軟膏は、目の潤いを保つために適用されます。
  3. 頭蓋窓のカバーガラスを70%アルコールで洗浄される。
  4. ウィンドウは、焦点面に平行に配置し、4X目的で視野の中央に置かれます。
  5. デジタルカメラで脳表面の血管の写真を撮影するのが最善です。この写真は、日ごとに繰り返し画像形成された領域を検索するには、次のイメージングセッションで基準の画像として使用されます。
  6. 4X目的は、ステージを移動することなく、水浸40倍目標に置き換えられます。ビューのフィールドのデジタル画像が再び取得されます。ステージマニピュレータの座標がゼロに設定されています。
  7. 我々は、画像取得ソフトウェアとしてscanimageを使用してください。これは、カレルヴォ(Pologrutoら、2003)の研究室でトムPologrutoとベルナルドサバティーニことで、MATLABで書かれています。レーザー、パワーメータ、フォトマルチプライヤチューブ、アンプ、など:私たちは、次のすべての他の機器の電源をオンに
  8. 撮像する適当なウィンドウの領域を簡単に最適な領域を見つけるために、低倍率でスキャンされます。一度これらは、画像が撮影さまでした地域の低倍率のスタックを同定し、そのXY座標は、アノテートされます。
  9. 小血管や毛細血管の血流動態を記録するために我々は、関心の血管の少なくとも40ミクロ​​ンに沿ってラインスキャンを使用してください。これらのシングル"スイープ"持続的な一秒を少しレーザーの可能​​な限り消費電力とスキャンの座標と角度がダウン書かれているとして使用して行われます。
  10. イメージングセッションが終了すると、動物はそれが麻酔から回復できる暖かい部屋に移動されます。

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Discussion

皮質血流のダイナミクスは、二光子顕微鏡による齧歯類の尾静脈に注射イメージング蛍光デキストランの色素によってin vivoで研究することができます。このビデオでは、どのようにガラスで覆われた頭蓋窓の準備を通じて、マウスの新皮質における画像の血流動態にするための方法を示した。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fluorescein isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich FD500S mol wt 500,000
Rhodamine B isothio-cyanate-dextran Reagent Sigma-Aldrich R9379 mol wt ~70,000

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References

  1. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
  2. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
  3. Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).

Comments

1 Comment

  1. Hi Carlos

    What is the thickness of the coverslip?thanks!

    Reply
    Posted by: Niloufar K.
    January 18, 2016 - 12:04 PM

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