人間の脳組織のためのクロマチンアッセイ

Biology

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Summary

最近まで、人間の脳での発現の研究​​は、RNAやタンパク質の定量化に限られていた。このホワイトペーパーで説明されているクロマチン免疫沈降の技術と、それは死後脳における遺伝子発現のヒストンメチル化と他のエピジェネティックな調節因子をマッピングすることが可能となります。

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Matevossian, A., Akbarian, S. A Chromatin Assay for Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (13), e717, doi:10.3791/717 (2008).

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Abstract

このような統合失調症、双極性疾患や自閉症などの慢性神経精神疾患は、遺伝子発現と他の分子病理学のエピジェネティックな変化を引き起こす可能性がある遺伝的要因と環境要因の組み合わせに起因すると考えられています。伝統的に、しかし、死後脳での発現の研究​​は、mRNAやタンパク質の定量化に限られていた。そのような自己消化時間や組織の健全性のばらつきなどの死後脳研究で遭遇する制限はまたより高次のクロマチン構造のいずれかの研究に影響を与える可能性があります。しかし、DNAを含むゲノムDNAのヌクレオソームの組織:結合コアヒストンは - 主に様々な脳の銀行が提供する代表的なサンプルで保存されるように見えます。そのため、死後脳で定義されたゲノムの遺伝子座でのメチル化パターンとコアヒストンの他の共有結合修飾を研究することが可能です。ここで、我々は凍結(固定なし)人間の脳の標本用に簡略化したネイティブクロマチン免疫沈降(NChIP)プロトコルを提示する。脳ホモジネートのミクロコッカスヌクレアーゼの消化から始まる、NChIPは、3日以内に完了することができる定量PCRが続きます。ここで紹介する方法は、通常と病気のヒトの脳における遺伝子発現のエピジェネティックな機構を解明するために有用なはずです。

Protocol

手順:

1回日

1。バッファをDouncingと冷凍事後灰白質組織の50から500 mgをホモジナイズする。

!注意 - ヒト組織は、厳格な安全条件の下で慎重に取り扱う必要があります。それは、BSL - 2以上の安全基準で処理する必要があります。

  1. 以前に解剖、検死-80〜脳° C、バッファをDouncingの5倍脳容積でそれらをダウンス、および2.0 mLのマイクロ遠心チューブに行われます。マッチしたサンプルと対照のペアが同時に処理されます。

2。ミクロコッカスヌクレアーゼ(MN)消化

  1. 氷の上に配置する前にピペッティングして、ソリューション内のサンプルと混合するミクロコッカスヌクレアーゼの5U/mLを追加。
    *重要なステップ- MNが偶数の4で行動する能力を持っているので、すぐにこの手順を実行することが重要℃である
  2. 37℃で7分間サンプルをインキュベート℃に
  3. 7分のインキュベーションの後、MNaseの活動を停止するには10mMの濃度に0.5M EDTAを加える。

3。 Hypotonisation

  1. 15 mLのファルコンチューブにサンプルを置きます。 0.2mmのEDTA、0.2Mベンズアミジン及び0.1Mのphenylmethanesulphonylfluorideの1 / 1000のサンプルの量(PMSF)の1 / 2000サンプルの体積の10倍のサンプルボリュームを追加します。後者の二つの化合物は、プロテアーゼ阻害剤として使用されています。
    * 重要なステップ-すべての手順の間に氷上でサンプルを維持することが重要です。
  2. それは10分ごとにボルテックスしながら、1時間サンプルをインキュベートする。
  3. 時間長いインキュベーションの終わりに、1 / 2000 3M DTTのサンプルの量、さらに別のプロテアーゼ阻害剤を追加。
  4. 渦のサンプルは、もう一度、4℃で10分間3175 RCFで遠心
    *オプションのステップ-プロテインGアガロースでPrecleansing。
    1. 上清を取り出し、新しい15 mLのファルコンチューブに入れ。
    2. プロテインGアガロースの500μLを追加します。
    3. 30分間室温で回転させます。
    4. で10分間4℃で4000rpmで遠心する
  5. 500μLを入力コントロール(のみゲノムDNAを含む)として使用されるように上清を配布し、残りはサンプルごとの1600μLを含む2つのチューブに分割されます - クロマチン免疫沈降(ChIP)サンプル用です。
  6. 入力コントロールは、さらに使用するまで-80℃CO / Nに配置されます。
  7. ChIPサンプルに - して抗体の10XFSBと4μgの1:10体積、渦のサンプルを追加し、4℃で一晩、それらを回転させる。
    !注意 - 抗体の量と希釈は、最適化が必要な場合があります。

2日目

!注意! -ヌクレオソームDNAを単離するために使用されるプロテインGアガロースを洗浄することによって第2が始まります 。アガロースビーズは非常に敏感であるので、アガロースビーズを含むソリューションをピペッティングするたびにヒントの頭を切断する必要があります。

1。 DNAにプロテインGアガロースビーズをプロービング

  1. 2 mlのマイクロチューブに245μLのプロテインG -アガロース(イナフ4チューブ用)(ループ)に1.6mlの1XFSBを追加。
  2. 2つの2 mLチューブと補充1X FSBでそれぞれ最大1.6 mLまでに解決策を区切ります。
  3. 30秒間室温で回転させると30秒間に0.1 RCFで遠心。
  4. 真空を用いて上清を取り除く。
  5. もう一度1.6mlの1X FSBを追加。 30秒間のサンプルを回転させ、その後30秒間に0.1 RCFで遠心。
  6. 再び上清を除き、および1.5 mLの1XFSBで両方のチューブを組み合わせる。
  7. 15μLサケ精子DNA(10mg/mL)を追加します。
    !注意 - このステップは、原理的には、ビーズの免疫沈降物の非特異的結合を減らす必要があります。しかし、これはまた、(人間の)DNA配列のいくつかの誤検知につながる可能性があります。
  8. 30秒間に0.1 RCFで遠心分離し、室温で30分間回転させます。
  9. 上清を取り除く。 1XFSB 200μLを加える。
  10. 各ChIPのサンプルにアガロースビーズを90μLを加える。 1時間4℃で回転させる。
  11. ネガティブコントロールとして機能し、4で回転℃で1時間に残っているアガロースビーズに1XFSB液1mLを追加。
  12. 時間の長いインキュベーション後、30秒間に0.1 RCFでサンプルとネガティブコントロールを遠心してください。上清を捨てる。

2。ビーズを洗浄

!注意! -洗浄バッファーは使用まで4℃で保管し、古いか月未満の場合にのみ使用することがありますする必要があります。

  1. ビーズにそれぞれの洗浄溶液1 mLを加え、室温で3分間回転させます。
  2. 30秒で0.1 RCFで遠心。
  3. 上清を使用して真空を捨てる。

*各洗浄液

- 低塩の洗浄バッファー

- 高塩分洗浄バッファ -塩化リチウム溶液- わずか1分、室温で回転させる!

- TE緩衝液(10mMトリス、1mMのEDTA液pH = 8)

3。溶出

*重要なステップは -それを使用する必要がある日にすべての実験のために新鮮な溶出バッファーを加えます。

  1. 各サンプルに、新たに調製した溶出緩衝液250μLを加える。
  2. 1分間に0.4 RCFで遠心分離し、RTで15分間回転させます。
  3. 2.0 mlのマイクロ遠心チューブ(ループ)で上清を保存します。
  4. 数秒間手でそれぞれのサンプルと渦に溶出バッファー250μLを加える。その後、mulitvortexer上で15分間ボルテックスサンプル。
  5. 4分間に16 RCF rpmで遠心し、同じ2.0mLのチューブ(ループ)で上清を保存する。

4。ダイジェストプロテイン

  1. 各チップのサンプルに10μlの0.5M EDTA、25μlの0.8Mのトリス- HCl、pH6.5で、10 mg / mlのプロテ​​イナーゼK(1 / 200サンプル)を追加します。
  2. 各入力の制御に、プロテイナーゼK消化(サンプルバッファーの1 / 10)及び10mg/mlプロテイナーゼK(サンプルバッファーの1 / 200)のために溶解バッファーを追加します。
  3. 少なくとも3時間、52℃での入力とChIPサンプルをインキュベートする。

5。フェノール/クロロホルム抽出

!注意 - 実験はフェノール/クロロホルムを必要とは、フードの下で実行する必要があります。フェノール/クロロホルム処理する際にニトリルの手袋を使用してください。

  1. 3時間のインキュベーションの後、我々は、各サンプルに500μlのフェノールクロロホルムを追加してください。
  2. 数秒間ボルテックスすべてのサンプルは、その後5分、13 RCFのrpmで遠心。
  3. この時点で、2つのフェーズが存在するであろうと我々はトップフェーズの内容に興味を持っています。上部相を取り出し、2 mlのマイクロチューブに入れて。
  4. 100%エタノール1.375 mLのと一緒に各サンプルに3M酢酸ナトリウムのグリコーゲンおよび50μLの2μlの混合物を追加。
  5. 激しくボルテックスし、すべてのサンプル。 ℃で一晩-80に配置します。

3日目

  1. 削除するサンプルフォーム-80 ° Cとそれらを解凍するために氷の上に置きます。
  2. 4時10分15 RCFで遠心分離℃に
  3. 慎重にチューブの底にペレットが剥がれないように上清を取り除く。
  4. 各サンプルに冷75%エタノール1 mlを追加し、次にそれらを4-6回転倒混和します。
  5. 4℃で5分間18 RCFで遠心℃、
  6. もう一度上清を除去し、ペレットを空気乾燥することができます。
  7. -80 50 4mmのトリス- HCl、PH8のμLとストアに乾燥ペレットを溶解℃でさらに使用するまで。

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Discussion

プロトコルは、これらのクロマチンのマーキングは、(ヒストン)アセチル化とリン酸化1を含む変更の他のタイプと比較して、死後のアーチファクトが発生しにくくなる可能性があるため、人間の脳のヒストンおよび/ ​​またはDNAメチル化の署名に興味がある研究者のために特に有用であるここで概要を説明2。死後脳では、モノヌクレオソームの調製の研究に適している、DNAは、少なくとも範囲で一般的に代表的な自己消化間隔(死亡および凍結/組織の格納の間の時間)と試験体で、主にコアヒストンに接続されたまま1.5日1〜数時間まで。しかし、モノヌクレオソームの調製は、特に遺伝子3の転写開始部位の周囲の配列の周りに、ヌクレオソームの位置と密度の変化に敏感である可能性があります。そのため、変更に依存しない抗ヒストン抗体を用いた対照実験を含める必要があります。また、それは(超遠心分離を含む)追加の精製ステップと組み合わせてミクロコッカスヌクレアーゼダイジェストに短いインキュベーション時間を用いて、人間の脳の抽出物からポリ-ヌクレオソームフラクションを分離することも可能です。最後に、死後脳における結合ゲノムワイドな転写因子に関する最近の研究では、単に超音波処理4を介してクロマチンを剪断。故障および/または死亡後に高次のクロマチン構造の人工的な再構成がために制御することが困難な潜在的な混乱させるなので、特に、前に超音波処理または酵素ベースの消化に固定してクロマチンの調製は、死後の研究の観点から理想的な場合があります。したがって、死後脳でのChIPアッセイでは、ヌクレオソームのコアヒストンと強固にゲノムDNAに接続された他のタンパク質を含む分子の数が限られ、有用である可能性が高い。ても考慮この警告で、このプレゼンテーションに記載されているアプローチは、通常と病気の人間の脳の神経細胞とグリアの機能を支配するクロマチン結合性のメカニズムに新たな洞察を提供する可能性があります。

我々は遺伝子定量PCR 1、5、6で遺伝子を用いて特異的プロモーターでヒストンメチル化とヒストン占有率の測定に主に正常にこのテクニックを使用している。前述したように、人間の死後脳では、DNAが大きくコアヒストンに接続されたままなので、モノヌクレオソームの調製の研究の影響を受けやすいと思われる。通常は、75人間の子供のmgまたは成人の大脳皮質(灰白質)で始まる時に一つの入力に対して50μlの合計容積の20〜30 ng /μLのの収量10〜15 - 上記に示したプロトコルを使用して期待することができますChIPの50μlの合計体積でng /μlに、少なくとも修正特定の抗ヒストン抗体を使用しているとき。入力に対する比、いわゆるCHIPは測定の単位です。反応の特異性は、曲線の分析、ゲル電気泳動、およびシーケンシングを溶融することによって監視されます。加えて、ネガティブコントロール(i)が特異的な抗体を欠く、または(ii)を含む(非特異)免疫グロブリンは、チップとインプットサンプルと並行して定量PCRによって処理されるべきであり、特定の製品につながるではありません。ゲル上で実行するときにサケ精子がブロッキング剤として使用されている場合、コントロールサンプルがスメアにつながる可能性があることに注意してください。

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Acknowledgements

この作品は、国立精神衛生研究所(5R01MH071476)からの助成金によって支えられて。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris-HCl EMD Millipore 9310
Magnesium Chloride Hexahydrate OmniPur, EMD Millipore 5980
Calcium Chloride Fisher Scientific C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 OmniPur, EMD Millipore 4055
Sodium Chloride Mallinckrodt Baker Inc. 7581-06
SDS Solution 10% (w/v) Bio-Rad 161-0416
Triton X-100 Fluka 93426
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I-3021
Sodium Deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-25G
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650-100G
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous) Sigma-Aldrich S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus Sigma-Aldrich N3755-200UN
Benzamidine Fluka 12072
Phenylmethanesulfonylfluoride Sigma-Aldrich P7626-1G
3M DTT Fluka 43815
Protein G Agarose, Fast Flow Upstate, Millipore 16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit Stratagene, Agilent Technologies 201190
Proteinase K from Engyodontium album Sigma-Aldrich P2308
Phenol:Chloroform 1:1 OmniPur, EMD Millipore 6810
Glycogen, From Mussels Sigma-Aldrich G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof) Pharmco-AAPER 111000200

Solutions:

  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
  • nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
  • Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
  • Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
  • Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
  • 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.

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References

  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters. J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.
  3. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31, 76-82 Forthcoming.
  4. Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain. Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.
  5. Huang, H. uang, Akbarian, S. GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia. PLoS ONE. 2, Forthcoming.
  6. Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain. J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.

Comments

3 Comments

  1. Dear Dr, I am selvakumar, Research scholar, Dept of Endocrinology,University of madras, chennai- India. I Need aclarification, whether is is possible in the rat brain. Send some assay, protocol in brain regions, thanking you, with regards selvakumar 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 21, 2008 - 9:25 AM
  2. Hi, What company did you purchase the tissue homogenizer from for douncing the brain tissue? Thanks, Pritika

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2009 - 10:19 PM
  3. Hi, Pritika, The tissue homogenizer is a Wheaton Science Product. We purchased from Fisher Scientific. Thank you. Yan

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2009 - 9:29 AM

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