נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

נויטרופילים הם בין התאים הראשונים להגיע באתר של התגובה החיסונית דלקתיות, ואת תפקידיהם מנגנוני נחקרו רבות במבחנה. אנו מדגימים תקן צפיפות שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

גרנולוציטים polymorphonuclear נויטרופילים (PMN) הם leukocytes הנפוץ ביותר בבני אדם בין התאים הראשונים להגיע באתר של תגובה חיסונית דלקתית. בשל תפקיד המפתח שלהם דלקת, נויטרופילים פונקציות כגון תנועה, ייצור ציטוקינים, phagocytosis, ולחימה תאים סרטניים נלמדים בהרחבה. כדי לאפיין את פונקציות ספציפיות של נויטרופילים, שיטה נקי, מהיר, אמין הפרדתם כדוריות דם אחרים רצוי במבחנה, במיוחד מאז נויטרופילים הם קצרי חיים ויש להשתמש בהם תוך 2-4 שעות של האוסף. כאן, אנו מדגימים צפיפות תקן שיפוע ההפרדה שיטה לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות כלי התקשורת ההפרדה זמינים מסחרית כי הוא תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופילים, ו תמוגה של אריתרוציטים שיורית. תאים נשטפים אז, נספר, ועל resuspended במאגר לריכוז הרצוי. כאשר מבוצע כהלכה, שיטה זו הוכח תשואה דגימות של> 95% נויטרופילים עם הכדאיות> 95%.

Protocol

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

  1. תביאו את כל ריאגנטים לטמפרטורת החדר.
  2. איסוף 5.0 מ"ל של התקשורת נויטרופילים בידוד צינור צנטריפוגות. בזהירות שכבה 5.0 מ"ל של דם על התקשורת ההפרדה. בצע שלב זה לאט ובזהירות, ועם קצה פיפטה קרוב לפני השטח של התקשורת, כדי למנוע ערבוב הדם בכלי התקשורת.
  3. צנטריפוגה ב RCF 500 דקות 35 ב 20-25 ° C. הדם צריך להפריד החוצה 6 להקות שונות: פלזמה, מונוציטים, מדיה בידוד, נויטרופילים, מדיה בידוד יותר, תא דם אדום גלולה (איור 1). אם להקות אלה אינם ברורים, את תהליך ההפרדה לא היה נקי יהיה צורך לחזור.
  4. מוציאים בזהירות את החלק העליון שלוש שכבות (פלסמה, מונוציטים, התקשורת בידוד) באמצעות פיפטה. השלך את השכבות הללו.
  5. פיפטה בזהירות את השכבה של נויטרופילים וכל מדיה הבידוד מתחת נויטרופילים. מניחים את הפתרון לתוך צינור צנטריפוגות נקי.
  6. לדלל את הפתרון נויטרופילים עד 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +. הפוך את הצינור כמה פעמים להשעות את התאים.
  7. צנטריפוגה הפתרון נויטרופילים ב RCF 350 במשך 10 דקות. גלולה אדומה צריכים להיות נוכחים בחלק התחתון של הצינור, המכילה נויטרופילים שיורית בתאי הדם האדומים (RBCs). הסר את supernatant עם טפטפת בקפידה כך גלולה אינה מופרעת.
  8. כדי lyse RBCs שיורית, להוסיף 2 מ"ל הצפת האדום תמוגה תא אל הצינור. כדי resuspend, גלולה מערבולת את הבקבוקון על ההגדרה של 3-4. הימנע להגדיל את ההגדרה מערבולת מעל 4, שכן זה עלול לגרום נויטרופילים כדי להפעיל. זה עשוי להיות נחוץ כדי מערבולת למשך מספר שניות, או "דופק" מערבולת לפזר את גלולה.
  9. צנטריפוגה התחתית RCF 250 דקות 5. הסר את supernatant עם פיפטה. חזור על התהליך lysing אם נדרש.
  10. הוסף 500 μl HBSS ללא Ca 2 + / 2 + Mg כדי צינור אחד. שוב, אל מערבולת resuspend גלולה בהגדרה של 3-4. מדולל ל 10 מ"ל עם HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. צנטריפוגה הצינורות בבית RCF 250 דקות 5. לשאוב supernatant וזורקים.
  12. Resuspend גלולה ב 250 HBSS μl / פתרון HSA (2% HSA). תאים עשויים אז ייספרו והותאמו הריכוז הרצוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיפוע צפיפות שיטת ההפרדה משמש כדי לבודד נויטרופילים האדם מן הדם כולו באמצעות תערובת של נתרן metrizoate ו dextran 500. שיטה זו מבוססת על שיטת ההפרדה mononuclear ליקוציט ידי Boyum (1968) אשר שונה להפרדה נויטרופילים ידי פראנטה Thong (1980).

לאחר איסוף מתורם דם, כולו עשוי להיות anticoagulated עם EDTA, ציטרט או הפרין. מאז הם קצרי חיים, נויטרופילים יש להשתמש תוך 2-4 שעות של האוסף. ההליך מורכב דם על כל שכבות המדיום צפיפות שיפוע, צנטריפוגה, הפרדה של שכבת נויטרופילים, ו תמוגה של אריתרוציטים שיורית. תאים נשטפים אז, נספר, ועל resuspended לריכוז הרצוי.

אם שש להקות אינם ברורים לאחר צנטריפוגה בשלב הראשון, תהליך ההפרדה לא היה נקי יהיה צורך לחזור. עבור הפרדה נקייה, לוודא כי התקשורת בידוד לא פג או מזוהמים. ההפרדה יכול להיות גם מוצלח אם התורם דם יש לצרוך אלכוהול או תרופות ב 72 שעות לפני איסוף הדם.

כדי למנוע הפעלת נויטרופילים במהלך הליך ההפרדה, עדיף להשתמש HBSS ללא Ca2 + / Mg2 +, מאז יוני הוכחו תאים הממשלה. Resuspension של כדורי צריך גם להתבצע באיטיות, הגדרות מערבולת יש לשמור נמוכה בטווח אמצע כך לא התאים להיות מופעל.

כאשר מבוצע כהלכה, שיטה זו הוכח תשואה דגימות של> 95% נויטרופילים עם הכדאיות> 95%. טוהר ואת הכדאיות ניתן להעריך על ידי תיוג התאים עם נויטרופילים ספציפיים סמן CD66b ו trypan הדרה צבע כחול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מימון NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics