Neutrofila Isolering Protokoll

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Neutrofila granulocyter är bland de första cellerna att anlända på platsen av inflammatoriska immunsvar, och deras funktioner och mekanismer har studerats utförligt in vitro. Vi visar en standard täthet gradient metod och separering att isolera humana neutrofiler från helblod med hjälp av kommersiellt tillgängliga separation medier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofila polymorfonukleära granulocyter (PMN) är de mest förekommande leukocyter hos människor och bland de första cellerna att anlända på platsen av inflammatoriska immunsvar. På grund av sin nyckelroll i inflammation, är neutrofila funktioner såsom förflyttning, cytokinproduktionen, fagocytos och tumörcellens bekämpa studerats. För att karakterisera specifika funktioner av neutrofiler, är en ren, snabb och tillförlitlig metod att skilja dem från andra blodkroppar önskvärd för in vitro-studier, särskilt eftersom neutrofiler är kortlivade och bör användas inom 2-4 timmar efter provtagning. Här visar vi en standard täthet gradient metod och separering att isolera humana neutrofiler från helblod med hjälp av kommersiellt tillgängliga separation media som är en blandning av natrium metrizoate och Dextran 500. Proceduren består av lager på lager helblod över densitetsgradient medium, centrifugering, separering av neutrofila lager, och lys av kvarvarande erytrocyter. Cellerna tvättas, räknas, och suspenderade i buffert till önskad koncentration. När de utförs på rätt sätt, har denna metod visat sig ge prov på> 95% neutrofiler med> 95% livskraft.

Protocol

Neutrofila Isolering Protokoll

  1. Låt alla reagenser till rumstemperatur.
  2. Samla 5,0 ml av neutrofila isolering media i centrifugrör. Försiktigt lager 5,0 ml blod över separationen media. Utför detta steg långsamt och försiktigt, och med pipettspetsen nära ytan av media för att undvika att blanda blod och media.
  3. Centrifugera vid 500 RCF för 35 minuter vid 20-25 ° C. Blodet bör skilja ut i sex olika band: plasma, monocyter, media isolering, neutrofiler, fler medier isolering, och röda blodkroppar pellet (Figur 1). Om dessa band är inte klart var separationsprocessen rena inte, och kommer att behöva upprepas.
  4. Ta försiktigt bort de tre översta skikt (plasma, monocyter och media isolering) med en pipett. Kassera dessa lager.
  5. Försiktigt pipett lagret av neutrofiler och alla isoleringen media under neutrofiler. Placera lösningen i en ren centrifugrör.
  6. Späd neutrofila lösningen till 10 ml med HBSS utan Ca 2 + / Mg 2 +. Vänd röret några gånger för att avbryta cellerna.
  7. Centrifugera neutrofila lösningen vid 350 RCF i 10 minuter. En röd pellets bör vara närvarande i botten av röret, som innehåller neutrofiler och kvarvarande röda blodkroppar (RBC). Avlägsna supernatanten med en pipett försiktigt så att pellets inte störs.
  8. För att Lyse kvarvarande röda blodkropparna, tillsätt 2 ml Red Buffert cellslys till röret. För att suspendera pelleten, virveln flaskan med inställningen 3-4. Undvik att öka virveln inställning över 4, eftersom detta kan orsaka att neutrofiler för att aktivera. Det kan vara nödvändigt att virvel i flera sekunder, eller "puls" virveln att lös pelleten.
  9. Centrifugera röret vid 250 RCF för 5 min. Avlägsna supernatanten med pipett. Upprepa lyserings processen om det behövs.
  10. Tillsätt 500 l HBSS utan Ca 2 + / Mg 2 + till varje rör. Återigen, vortex för att suspendera pelleten med inställningen 3-4. Späd till 10 ml med HBSS utan Ca 2 + / Mg 2 +.
  11. Centrifugera rören vid 250 RCF för 5 min. Aspirera supernatanten och kassera.
  12. Återsuspendera pelleten i 250 l HBSS / HSA Lösning (2% HSA). Celler kan sedan räknas och justeras till önskad koncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den densitetsgradient separation metod används för att isolera humana neutrofiler från helblod med en blandning av natrium metrizoate och Dextran 500. Denna metod är baserad på mononukleära leukocyter separation metod Boyum (1968) som var modifierade för neutrofila separation av Ferrante och Thong (1980).

Efter samling från en donator kan helblod ges antikoagulantia med EDTA, citrat eller heparin. Eftersom de är kortlivade, bör neutrofiler användas inom 2-4 timmar efter provtagning. Proceduren består av lager på lager helblod över densitetsgradient medium, centrifugering, separering av neutrofila lager, och lys av kvarvarande erytrocyter. Cellerna tvättas, räknad och återsuspenderade till önskad koncentration.

Om de sex banden inte är särskiljbara efter den första centrifugeringen steget var separationsprocessen inte ren och kommer att behöva upprepas. För rena separation, se till att isoleringen media inte har löpt ut eller förorenat. Separation kan också misslyckas om blodgivare har druckit alkohol eller mediciner i 72 timmar före provtagningen.

För att förhindra neutrofil aktivering under separationen förfarandet, är det bäst att använda HBSS utan Ca2 + / Mg 2 +, eftersom joner har visat sig prime celler. Resuspension av pellets bör också utföras långsamt och vortexa inställningar bör hållas i den aktiverade låga till mid-range, så att celler inte blir.

När de utförs på rätt sätt, har denna metod visat sig ge prov på> 95% neutrofiler med> 95% livskraft. Renhet och hållbarhet kan bedömas genom märkning cellerna med neutrofil-specifik markör CD66b och trypan blått färgämne utslagning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Finansiering från NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics