Snabb Lipid Droplet isolering protokoll använder en väletablerad organell isolering Kit

Forskning om lipiddroppbiologi har hämmats av svårigheter att rening. Dessutom, studera cellulära lipid flux kräver samtidig rening av flera organeller, och inga enkla protokoll var för närvarande tillgängliga. Den största fördelen med denna teknik är att göra lipiddropprening mer tillgänglig.

Vi modifierade ett kommersiellt tillgängliga kit för att samtidigt isolera lipiddroppar, endoplasmatiska retikulum och lysosomer från ett enda prov. Lever lipid droplet ansamling predisponerar feta och alkoholhaltiga patienter till progressiv leversjukdom. Detta har skiftat synen på lipiddroppar från inert förvaringsfack till dynamiska biologiskt viktiga organeller.

Till att börja med använda sterila tlysen och dissektion sax för att skära huden och muskeln lager av buken av den avlivade musen på den bakre-främre axeln, utsätta levern. Skär ligamenten som förbinder levern till tarmen. Med hjälp av forceps, dra tarmen bort från levern, mot den bakre.

Skär ligament som förbinder levern till membranet. Därefter, skär mellan levern och ryggresala bröstkorgen, flyttar från främre till bakre, tills levern är befriad. Överför levern till en kall fem centimeter petriskål med 10 milliliter kall 1x PBS, och tvätta levern två gånger på en gungande plattform i 10 milliliter kall 1x PBS i fem minuter vid fyra grader Celsius.

Efter den sista tvätten, häll av 1x PBS, och använda en storlek-10 sterila kirurgiska blad för att tärna levern i tre till fem-millimeters bitar i skålen. Tvätta sedan den tärnade levern två gånger med 10 milliliter kall 1x PBS i fem minuter vid fyra grader Celsius. Dekantera 1x PBS, och överföra tärnade leverbitar till en kall 45-milliliter Dounce homogenisator, se till att alla bitar är längst ner.

Tillsätt sju milliliter kall 1x IE buffert. Homogenisera på is genom att flytta mortelstöten upp och ner 20 gånger, se till att mortelstöten går till botten av homogenisatoren under varje stroke. Överför homogenatet till ett kallt 15-milliliter centrifugrör.

Skölj homogenisatorn med en milliliter kall 1x IE-buffert, och tillsätt den i resten av homogenatet. För att avlägsna kärnor, centrifug homogenatet i en högkapacitetscentrifug vid 1, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Se till att alla lipider som samlats upp på 15-milliliterröret återanvänds för att förhindra LD-förlust.

Se till att nukleär pellet i botten av röret är ostörd, överför lipidhaltiga post-nukleära supernatant till en färsk kall 50-milliliter centrifugera röret. Överför en 100-microliter alikvot av post-nuclear supernatant till en kall 1,7-milliliter microcentrifug röret på is för senare renhet analys. För att avlägsna mitokondrierna centrifugera det post nuclear supernatant provet i en kyld höghastighetscentrifug vid 12, 000 gånger g i 15 minuter vid fyra grader Celsius.

Se till att alla lipider som samlats upp på toppen av röret är återanvänds för att förhindra LD förlust, och sedan överföra post-mitokondriellt supernatant till en 13-milliliter ultracentrifugrör. Överför en 100-mikroliter alikvot av post-mitokondriell supernatant till en kall 1,7-milliliter microcentrifuge rör på is för senare renhet analys. Fyll ultracentrifugröret med post-mitokondriell supernatant till brädden med kall 1x IE buffert, för att förhindra att det kollapsar under ultracentrifugering.

Balansera proverna, och sedan centrifug i en ultracentrifug vid 100, 000 gånger g i 60 minuter vid fyra grader Celsius. För att ta bort LD-lagret lutar du röret i 45 graders vinkel, och aspirerar med en glaspipett. Efter överföring av pelleten till en kall 1,7-milliliter mikrocentrifugrör, samla 100 mikroliter av post-ER supernatanten under lipidskiktet för renhetsanalys.

För att pelleta någon cell skräp, centrifug i en mikrocentrifug i toppfart i fem minuter vid fyra grader Celsius. Värm sedan röret försiktigt med händerna för att hjälpa till att återanvända LD-lagret och överföra supernatanten, inklusive lipidskiktet, till ett nytt 1,7 milliliter mikrocentrifugrör. Upprepa dessa tvättsteg, värma röret två till tre gånger, tills pelleten inte längre är synlig.

Sedan, för att tvätta pellet-free LD supernatant, tillsätt 1x PBS till en slutlig volym på 1,5 milliliter, och centrifug i en mikrocentrifug i toppfart i fem minuter vid fyra grader Celsius. Använd en glaspipett för att ta bort en milliliter av 1x PBS, som ligger under lipidskiktet, utan att störa lipidskiktet. Upprepa LD tvättning fyra till fem gånger, tills 1x PBS är visuellt transparent utan grumlighet.

Använd sedan en glaspipett för att ta bort alla 1x PBS under lipidskiktet, och använd den resulterande rena LD-fraktionen för nedströmsanalys. När representativa 20x fluorescerande och brightfield LD bilder togs från både ER kit LD isolering och sackaros LD isolering metoder, avslöjade de liknande nivåer av partiklar, vilket tyder på liknande renheter med hjälp av två olika protokoll. Efter rening mättes LD triglycerid och protein nivåer med hjälp av kolorometrisk analyser, och uppgifterna normaliserades till lever vikt, visar att när utgångsmaterialet var normaliserade, LD triglycerid och protein avkastning var liknande med hjälp av ER kit och sackaros metoden.

LD-diametrar kvantifierades med hjälp av programvara för bildanalys, vilket visar att ER-satsen LD-isolering och sackaros LD-isolering gav LD:s av liknande storlekar. För att bedöma LD renhet, prover var assayed av immunoblotting, visar att LDs härrör från ER kit LD isolering och sackaros gradient protokollet båda hade lika renhet. PLIN2, en LD-markör, upptäcktes i alla prover utom ER-satsen LD-isolering PER och sackarosens PNS.

Renhetsanalys av en ER-fraktion med hjälp av immunoblots visar att de var fria från LD-markör PLIN2 men hade betydande nivåer av ER SEC61A-proteinet. Renhet av en lysosomal fraktion efter ytterligare rening av lysosomer med hjälp av lysosome anrikningssatsen bedömdes också. Discovery är för närvarande den mest användbara tillämpningen av vårt protokoll.

Vi utför lipidomics i renat organeller, och visade lipotoxiner ökas specifikt i lipiddroppar i alkoholhaltiga leversjukdom.