Хроматин Иммунопреципитация из человеческих эмбриональных стволовых клеток

Biology
 

Summary

Дифференциация ESC совпадает с камерного типа специфические изменения в структуре и составе хроматина. Обнаружение этих изменений дает ценную информацию о механизмах, которые определяют stemcellness и дифференцировки клеток. Хроматин иммунопреципитации (чип) представляет собой ценный метод препарировать молекулярные механизмы, лежащие дифференциации стволовых клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bertani, S., Kan, A., Sauer, F. Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (17), e780, doi:10.3791/780 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Функциональную и структурную сложность несметное число клеток в многоклеточных организмах возникает небольшое количество стволовых клеток. Стволовые клетки характеризуются двумя основными свойствами: самообновлению и multipotency, который позволяет стволовых клеток дифференцироваться в практически любой тип клеток 1. Клеточного стволовых дифференцированных клеток характеризуется потерей multipotency, структурные и морфологические изменения и иерархической активности транскрипционных факторов и сигнальных молекул, чья деятельность устанавливать и поддерживать камерного типа определенных закономерностей экспрессии генов. На молекулярном уровне, клеточной дифференцировки включает динамические изменения структуры и состава хроматина и выявление тех, динамические изменения могут предоставить ценную информацию о функциональных особенностях стволовых клеток и процесса дифференцировки клеток 2,3. Хроматин спрессованный ДНК-белкового комплекса, который образуется при клетками пакет хромосомной ДНК с белками, в основном, гистоны 4. Stemcellness и дифференцировки клеток коррелирует с наличием специфических массивов регуляторных белков, таких как эпигенетические факторы, гистоновых вариантов, и транскрипционных факторов 2,3,5.


Хроматин иммунопреципитации (чип) дает ценный метод для мониторинга присутствия РНК, белков и белковых модификаций хроматина 6,7. Сравнение хроматина из разных типов клеток может выяснить динамические изменения в белок-хроматина ассоциаций, которые происходят во время дифференцировки клеток.

Хроматин иммунопреципитации включает в себя очистку в естественных условиях сшитого хроматина. Изолированных хроматина сводится к более мелкие фрагменты от ферментативного пищеварения или механической силы. Хроматин фрагменты выделяются с использованием специфических антител к целевой белки или белков и ДНК модификаций. Осажденного ДНК или РНК, очищается и используется в качестве шаблона для ПЦР или ДНК-микрочипов основан анализов. Предпосылки для успешного ChIP высокие антитела качества желаемого антигена и доступности хроматина из-под контроля клеток, которые не выражают молекулой-мишенью. Чип может коррелировать присутствии белков, белков и РНК модификаций, а РНК с конкретной ДНК-мишени, и в зависимости от выбора outread инструмент, обнаруживает связь молекул-мишеней в определенных генов-мишеней, или в контексте всего генома. Сравнение распределения белков в хроматина дифференциации клетки могут выяснить динамические изменения хроматина состава, которые совпадают с прогрессией ячеек по клеточной линии.

Protocol

Размораживание ЭС клетки (не получившие отражения в видео)

ЭС клетки замораживаются в среде, содержащей 10% ДМСО. С ДМСО может индуцировать дифференцировку ЭС клеток, это может быть возможным, чтобы растопить клетки в конце дня и таким образом изменить среду утром следующего дня, чтобы минимизировать эффект остаточного ДМСО.

  1. Пальто 6-и культуре ткани пластины с 0,1% желатина в течение 15 мин и аспирации немедленно, прежде чем пластина ячеек.
  2. Оттепель ЭС клетки (примерно 5 × 10 6 клеток, эквивалентные одному сливной 6-а) в 37 ° С водяной бане и разводят в 10 мл нагретого среда ячейки ES.
  3. Гранул клетки, крутя в течение 10 минут при 1000 оборотов в минуту в настольный клинической центрифуге.
  4. Аспирируйте от среднего и мягко ресуспендирования клеток в 10 мл 37 ° C нагретого среды.
  5. Передача клеточной суспензии для 6-луночного планшета и расти при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 инкубатора.
  6. Изменение среды на следующий день, чтобы удалить отмершие клетки и остаточных ДМСО.

Прохождение и расширение культуры ЭСК

ЭС клетки обычно пассируют каждые 2 / 3 дня, и среда изменяется в разные дни. Таким образом, ЭС клетки требуют ежедневного внимания. По нашему опыту, фидерных независимой ЭС клетки быстро растут и быстро подкисляют среду, превращая его желтым цветом. Разрешение клетки для подкисления среды (не изменяя СМИ каждый день или по пассирования клетки на слишком низком разведении) вызовет клеток к кризису, вызывая превышение дифференцировки и гибели клеток, после чего их тотипотентность не может быть гарантирована. Покрытие клетки при слишком низкой плотности, недостаточной дисперсией клеток во время прохода, или неровных покрытий может вызвать подобные проблемы, а клетки образуют крупные скопления, не достигнув слияния и клеток внутри этих сгустков будет дифференцироваться или умереть. Зародышевой линии передачи значительно снижается в клетках, которые были плохо обращались, даже если они кажутся здоровыми во время инъекции.

  1. Для сливной 6-луночный планшет клеток аспирата среды от и промыть 2-3 мл 37 ° C нагретого PBS, пипетки его подальше от клетки.
  2. Обложка клеток с 1 мл 1 × раствора трипсина в течение 3-4 минут или до клетки равномерно распределены на мелкие сгустки.
  3. Добавьте 1 мл среды для инактивации трипсина.
  4. Сбор трипсином клетки и клетки пластины (как правило, 2 / 5 от а) до свежей желатинизированный 6-луночный планшет.

Замораживание ЭС клетки

  1. Trypsinize сливной 6-луночного планшета (примерно 1 × 10 7 клеток), как описано выше.
  2. Сбор трипсином клетки в 9 мл среды и гранул в течение 5 минут при 1000 оборотах в минуту.
  3. Аспирируйте от средних и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежеприготовленного замерзания среды. Алиготе 0,5 мл клетки на две cryotubes.
  4. Замораживание флаконах при температуре -80 ° С в течение ночи и трансфер в жидком азоте в течение длительного хранения.

ChIP-на-чипе ПОРЯДОК

Иммунопреципитация

  1. Формальдегид сшивания клетки (для приготовления суспензии клеток)
    1. Используйте 5 х 10 7 - 1 х 10 8 клеток для каждого иммунопреципитации.
    2. Добавьте свежие Формальдегид к суспензии клеток в концентрации 1%.
    3. Насиживает клетки раствор формальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре.
    4. Добавить 1 / 10 объема в 1,25 М глицин, чтобы утолить формальдегида.
    5. Промойте клетки в два раза по 10 мл 1x PBS.
    6. Бассейн клеток в 50 мл конические пробирки и вращаются на 700 г в течение 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 1,5 мл лизирующего буфера. Передача клеток в 1,5 трубки микроцентрифужную мл.
  2. Flash-заморозить три раза клеток в жидком азоте и использование тканей мясорубку сломать клетки. Как только клетки сшиты, они могут храниться замороженными при -80 ° C до бесконечности.

Подготовка магнитных шариков (Шаги все проводили при 4 ° С)

  1. Добавить 50 мкл Dynal бисером до 1,5 мл низкой микропробирку хранения. Настройка 1 тюбик из бисера в иммунопреципитации. Добавить 1 мл Блок решение.
  2. Сбор бисером использованием Dynal ПДК. Место труб в магнитной стойке. Разрешить бисером собрать на стороне трубки. Это должно занять около 15 с Обратить стойку в два раза, чтобы помочь собрать бусы. Удалить супернатант с пипетки.
  3. Добавьте 1 мл раствора Блок и осторожно ресуспендируют бисером в удалении магнитной полосой от стойки и инвертирующего стойку, с трубами все еще на месте - или в 10-20 раз, или пока бусины равномерно ресуспендирования. Сбор бисером, как выше (шаг 2). Удалить супернатант с пипетки.
  4. Вымойте бусины 1,5 Решение Блок мл, как в шаге 3, еще один раз.
  5. Ресуспендируют бисером в 750 мкл раствора Блок и добавить 10 мкг антител. Инкубируйте при 4 ° С в течение минимум 6 часов, или на ночь, на ротатора.
  6. Вымойте бисером три тРедакторы IME в 1 Решение Блок мл, как описано в шаге 3.

Сотовые ультразвуком

  1. Удалить замороженных гранул клетку от -80 ° C и передачи клеткам трубы для обработки ультразвуком. В настоящее время мы предпочитаем использовать нижнюю часть стандартного polupropylene, 15 мл коническую трубку для обработки ультразвуком. Режем трубки на две части по 5 мл марки и выбросить верхнюю половину. Трубы могут быть покрыты парафильмом или с трубкой крышки при настройке.
  2. Использование стойки микроцентрифужную трубку, позиция трубку так sonicator зонд находится примерно 0,5-1,0 см выше нижней части трубы. Позаботьтесь о том, датчик по центру и не контактирует стороны трубки. (Probe позиционирования может повлиять ли решение пены или не во время обработки ультразвуком. Как правило, пенящиеся указывает, что ультразвуком ДНК будет плохо стриженый.)
  3. Разрушать ультразвуком подвески 6 раз в течение 20 секунд Образцы следует хранить в ледяной бане в течение ультразвуком. Для уменьшения пенообразования, первоначально установлен выходной мощности до 0 и увеличения вручную, чтобы окончательный власть во время первого взрыва. (Если есть значительное вспенивание, все пузыри могут быть удалены путем центрифугирования при 20000 г следуют нежный ресуспендирования из любого материала, не оставив пену пузырей.)
  4. Спиновые в 20000 г в течение 10 мин при 4 ° С до гранул мусора и уборки супернатант в 1,5 мл трубки.
  5. Сохранить 50 мкл Клеточный лизат из каждого образца в качестве входных данных ДНК. Хранить при -20 ° C. По крайней мере, один вход ДНК аликвоты должны быть в партии разрушать ультразвуком лизат. Обратите внимание, что эффект воздействия ультразвуком и итогового распределения размеров фрагментов могут быть проверены только после сшивки разворота и очистки ДНК.

Хроматин иммунопреципитации

  1. Добавить хроматин-эквивалентную сумму 5 х 10 7 - 1 х 10 8 клеток от клетки ультразвуком, шаг 4 до 50 мкл антител / магнитный шарик смесь из Подготовка магнитных шариков, Шаг 6 с конечного объема 1 мл (Это может быть можно регулировать с Лизис буфера, если когда-нибудь). Инкубируйте ночь на поворотное устройство при 4 ° C.

Мыть

  1. Сбор бисером использованием Dynal ПДК. Место труб в стойке. Разрешить бисером собрать на стороне трубки. Это должно занять около 20 секунд Обратить стойку в два раза, чтобы помочь собрать все шарики. Удалить супернатант с пипетки, изменение советы между образцами.
  2. Добавить 1 мл лизирующего буфера в каждую пробирку и осторожно ресуспендируют бисером. Это может быть сделано путем удаления магнитной полосой от стойки и инвертирующего стойку, с трубками-прежнему на месте - в 10-20 раз, или пока бусины равномерно ресуспендировали. Сбор бисером. Удалить супернатант пипетки. Повторите это мыть еще 5 раз, меняя советы от стирок.
  3. Вымойте бисером 6 раз в 1 мл буфера IP1, как описано в шаге 2.
  4. Вымойте бисером 6 раз в 1 мл буфера IP2, как описано в шаге 2.
  5. Вымойте бисером 6 раз в 1 мл 8,0 TE буфера, как описано в шаге 2.
  6. Спиновые на 960 г в течение 3 мин при 4 ° С и удалить остатки буфера ТЕ.

Элюирование

  1. Добавить 210 мкл буфера элюции и элюировать материал из бисера путем инкубации труб в 65 ° С на водяной бане 15 мин. Vortex кратко каждые 2 мин. Это инкубации может быть продлен до тех пор, как 30 минут, которые могут помочь улучшить восстановление элюата.
  2. Спином вниз бус на 16 000 г на 1 мин при комнатной температуре.
  3. Удалить 200 мкл надосадочной жидкости и перехода на новые трубы. Материал может быть заморожены при температуре -20 ° С и сохраняется в течение ночи.

Crosslink разворота

  1. Обратный сшивания иммунопреципитации ДНК из Элюирование, Шаг 3 путем инкубации при температуре 65 ° С в течение минимум 6 ч и не более 15 ч (более длительное время разворота сшивания обычно приводит к увеличению шума в анализе микрочипов). Это инкубации может быть сделано в духовке так, чтобы трубка нагревается равномерно и там меньше конденсации образуется.
  2. Оттепель 50 мкл ДНК вход защищены после обработки ультразвуком (шаг 13), добавить 150 мкл (3 тома) буфера элюирования и перемешать. Обратный сшивания этот вход ДНК путем инкубации при температуре 65 ° С, как в Crosslink разворота, стадия 1. С этого момента каждый трубку иммунопреципитации или ввода ДНК считается отдельной трубе или образец для последующих этапов обработки.

Очистка ДНК

  1. Добавить 8 мкл 10 мг мл-1 RNaseA (0,2 мг мл-1 конечная концентрация), перемешать путем обращения трубку несколько раз и инкубировать при 37 ° С в течение 2 ч.
  2. Добавьте 4 мкл 20 мг-1 мл протеиназы К (0,2 мкг мл-1 конечная концентрация) и перемешать путем обращения трубку несколько раз и инкубировать при 55 ° С в течение 2 ч.
  3. Добавить 400 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (P: C: IA), вихревые и отдельных фаз с 2 мл тяжелая труба Phaselock (следуйте инструкциям Эппендорф).
  4. Если P: C: И. А. Решение старых или при низких значениях рН, будет градadation ДНК, вызывая шум в микрочипов анализа и потеря обнаружения действительных целей.
  5. Передача водного слоя к новой трубки центрифуги содержащей 16 мкл 5М NaCl (200 мМ) конечная концентрация) и 1,5 мкл 20 мкл μ-1 гликогена (30 мкг общего количества).
  6. Добавить 800 мкл этанола. Инкубировать в течение ночи при температуре -20 ° С или 30 мин при температуре -80 ° C.
  7. Спиновые в 20000 г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения ДНК. Вымойте гранул путем добавления 500 мкл 80% этанола, вортексе для ресуспендирования гранул и спиннинг снова в 20000 г в течение 5 мин при 4 ° C.
  8. Удалите все оставшиеся 80% этанола. Спиновые труб кратко собирать любую оставшуюся жидкость и удалить жидкость с pipetteman, избегая гранул. Давайте труб воздух сухой, пока гранулы только сухой: гранулы должны по-прежнему сохраняют влажную внешний вид. Ресуспендируют каждая гранула в 70 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0.
  9. Пересушивания этих гранул может сделать их трудно ресуспендируют, или способными ввести в хлопьев и удаляйте со стороны трубки.
  10. Дополнительно: Скидка 15 мкл иммунопреципитации образец для будущего использования. Этот материал может использоваться для выполнения конкретных генов ПЦР подтверждение микрочипов результаты.
  11. Количественная концентрации УФ-поглощения (260 нм).

Примечание: следующие шаги, включая подготовку библиотеки и усиление использовать модифицированную GenomePLex WGA комплект с 10X Mix Amp от Sigma без дНТФ:

Библиотека подготовки

Наличие в комплекте GenomePLex WGA с 10X Mix Amp от Sigma

  1. Добавить 2 мкл 1X буфера Подготовка библиотеки до 10 мкл образца ДНК из Очистка ДНК, шаг 11 в ПЦР-пробирку.
  2. Добавить 1 мкл Решение стабилизации библиотеки.
  3. Vortex тщательно, консолидировать центрифугированием, и место в термоциклер при 95 ° С в течение 2 минут.
  4. Охладите образцы на льду, консолидации путем центрифугирования с помощью центрифугирования, а затем вернуться на лед.
  5. Добавить 1 мкл ферментного препарата библиотека, вихревые тщательно, а затем центрифуги кратко.
  6. Место образца в термоциклер и инкубировать следующим образом:
    • 16 ° С в течение 20 минут
    • 24 ° С в течение 20 минут
    • 37 ° C в течение 20 минут
    • 75 ° C в течение 5 минут
    • 4 ° C держать
  7. Удалить образцы термоциклер и центрифуги кратко. Пробы могут быть усилены сразу или хранить при температуре 20 ° С в течение трех дней.

Усиление

Наличие в комплекте GenomePLex WGA с 10X Mix Amp от Sigma

  1. Mix Master готовится путем добавления следующих реагентов к 15 мкл реакции Шаг 3, ниже:
    • 7,5 мкл 10X Mix Amp (без дНТФ)
    • 5,0 мкл полимеразы ДНК WGA
    • 3,0 мкл 10 мМ дНТФ (каждый) акции (конечная концентрация 0,4 мм)
    • Принесите окончательный объем реакционной смеси до 75 мкл с нуклеазы без воды
  2. Vortex тщательно. Центрифуга кратко, и начать термоциклирования.
    • Первоначальные Денатурация 95 ° С в течение 3 минут
    • Выполните 14 циклов следующим образом:
    • Денатурировать 94 ° С в течение 15 секунд
    • Отжиг / Удлинить 65 ° C в течение 5 минут
    После завершения езда на велосипеде, поддерживать реакции при 4 ° С и хранить при -20 ° С до готовности для анализа или очистки.
  3. Purify ДНК с очистки ПЦР ® Kit от Quiagen в соответствии с инструкциями изготовителя и количественно концентрации УФ-поглощения (260 нм).
  4. Выполните еще ​​раз цикл усиления из библиотеки Подготовка Шаг 1 до усиления, шаг 2, со следующими изменениями.

    • Что касается количества необходимых ДНК из Шаг 3, выше, инициировать процесс фрагментации: Если концентрация ДНК составляет около 200-300 мкг / мл, используйте 2,5 мкл образца и корректировать с водой для конечного объема 10 мкл.
    Если концентрация ДНК составляет около 50-60 мкг / мл, используйте 5 мкл образца и корректировать с водой для конечного объема 10 мкл.


    • В этот второй процесс усиления, дНТФ с dTTPs для мастер-микс обмен на сочетание в том числе 10 мМ дАТФ, 10 мМ дГТФ, 10 мМ дЦТФ и 8 мм dTTP и 2 мМ dUTP в той же концентрации, что предыдущий микс.

  5. Мера ДНК с использованием UV-VIS спектрофотометр (260 нм). Как правило, больше, чем 9 мкг амплифицированной ДНК получен из каждой реакции.

    NB: маркировка ДНК цели осуществляется с GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix в соответствии с инструкциями производителя, как описано ниже:

Фрагмент усиливается цели

  1. Фрагмент образцов с использованием соответствующей таблице ниже, в зависимости от того, что тип массива цель будет гибриднымized в.

    Таблица 1. Фрагментация Смесь для одного массива
    Том Компонентный / Сумма в 1 Rxn
    Двухцепочечной ДНК 7,5 мкг
    10X кДНК Фрагментация 4,8 мкл
    UDG, 10 ед / мкл 1,5 мкл
    APE 1, 100 ед / мкл 2,25 мкл
    Нуклеазы без воды до 48 мкл
    Доступный в GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix

    Таблица 2. Фрагментация Смесь для мульти-массив наборов
    Том Компонентный / Сумма в 1 Rxn
    Двухцепочечной ДНК 9 мкг
    10X кДНК Фрагментация 4,8 мкл
    UDG, 10 ед / мкл 1,5 мкл
    APE 1, 100 ед / мкл 2,25 мкл
    Нуклеазы без воды до 48
    Доступный в GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix
  2. Настройка фрагментации смеси в соответствии с таблицами или выше. Флик-микс и спином вниз трубы.
  3. Инкубируйте реакции по адресу:
    • 37 ° С в течение 1 ч.
    • 93 ° С в течение 2 мин.
    • 4 ° С в течение не менее 2 минут.
  4. Флик-микс, замедления вращения трубы, и передачи 45 мкл образца на новые трубы.
  5. Удалите 2 мкл каждого образца для гель-сдвиг анализа.

Этикетка фрагментирован двухцепочечной ДНК

  1. Подготовка двухцепочечной ДНК маркировки Mix, как описано в таблице ниже:

    Таблица 3. Состав двухцепочечной ДНК Mix маркировки
    Том Компонентный / Сумма в 1 Rxn
    5X TdT буфера 12 мкл
    TdT 2 мкл
    ДНК маркировки реагента, 5 мМ 1 мкл
    Общий объем 15 мкл
    Доступный в GeneChip ® WT двухцепочечной ДНК Терминал маркировки Kit от Affymetrix
  2. Добавить 15 мкл двухцепочечной Mix маркировки ДНК образцов ДНК, Флик-микс, и спина их вниз.
  3. Инкубируйте реакции по адресу:
    • 37 ° С в течение 60 мин.
    • 70 ° С в течение 10 мин.
    • 4 ° С в течение 2 мин.
  4. Удалите 2 мкл каждого образца для гель-сдвиг анализа.

Гель-сдвиг анализ

  1. Подготовка 4% агарозном геле.
  2. Инкубируйте образцы из фрагментов усиливается цели, шаг 5 и этикетка фрагментирован двухцепочечной ДНК, шаг 4 при 65 ° С в течение 2 мин.
  3. Добавьте 10 мкл стрептавидином (1 мг / мл), и инкубировать образцов при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Выполнить образцы Шаг 3 на 4% агарозном геле (гель-анализа сдвиг, шаг 1) и проверить сдвиг миграции маркировки продукции.

Гибридизации массива и массива стиральных

Исполняет Геномная центр Калифорнийского университета Риверсайд.

Массив анализ

Исполняет численный анализ.

BUFFER композиции:

Блок Решение: PBS + 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА).

Лизис буфера: 50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5
140 мМ NaCl
1 мМ ЭДТА
1% Тритон Х-100
0,1% SDS
1mM PMSF
Конечное значение рН 7,5

IP1: Лизис буфера + 500 мМ NaCl

IP2: 10 мМ Трис-HCl
250 мМ LiCl
1 мМ ЭДТА
0,5% NP-40
0,5% натрия Dioxycholat
Конечное значение рН 8,0

TE: 10 мМ Трис, рН 7,4
1 мМ ЭДТА

Конечное значение рН 8,0
Элюции буфера: TE буфера + 1% SDS.

Discussion

Хроматин иммунопреципитации (чип) предлагает ценную технику для вскрытия хроматина основе процессов при клеточной дифференцировки. Предпосылки для успеха этого метода хорошие антитела и доступности хроматина из-под контроля клеток или тканей, которые не имеют антиген интереса. Объединив чип с ДНК-микрочипов технологии, огромные объемы информации могут быть получены. Проверка ChIP результатов зависит от наличия подходящих тест-системы, которая может связать динамические ассоциации белков, белковых модификаций и / или РНК, связанные с исполнением биологических процессов во время развития клеток.

Acknowledgements

Представлены Работа выполнена при поддержке гранта (RS1-00477-1) из Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) для FS

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Poteinase-K Reagent Roche Group #EO0491
RNase-A Reagent Fermentas #EN0531
formaldehyde 37% Reagent EMD Millipore FX040-13
Chloroform Reagent EMD Millipore 3150
Ethanol Reagent Goldshield
phenol:chloroform:isoamyl alcohol Reagent Invitrogen 15593-031
SA, fraction V Reagent EMD Millipore 2930
Dubecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190
HEPES Reagent EMD Millipore 5330
Sodium Chloride Reagent Fisher Scientific S271-10
EDTA Reagent EMD Millipore 4050
Triton X-100 Reagent EMD Millipore 9410
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent JT Baker 4095-02
Lithium chloride Reagent EMD Millipore 5910
Tris-HCl Reagent EMD Millipore 9230
NP-40 Reagent Calbiochem 492015
Deoxycholic acid, sodium salt Reagent Fisher Scientific BP349-100
Ammonium acetate Reagent Applichem 631-61-8
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
dynalbeads, protein A Reagent Invitrogen 100.02D
dynalbeads, protein G Reagent Invitrogen 100.04D
1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme Other Phenix Research Products MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2.0 ml Reagent Eppendorf 955154037

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Boyer, L. A., et al. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature. 441, 349-353 (2006).
  3. Lee, T. I., et al. Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell. 125, 301-313 (2006).
  4. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
  5. Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).
  6. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).
  7. Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax. Science. 311, 1118-1123 (2006).

Comments

5 Comments

  1. how to prepare ChIp-DNA sample for sequencing?( single-End; solexa)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 30, 2008 - 9:17 AM
  2. Hi
    Thanks for the protocol. Do you have any protocol for less than 10,000 cells?
    Ramji

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2008 - 7:27 PM
  3. hi, search in Nature protocols as microChIP. This protocol was made for up to minimun of 100 cells or more. This is great protocol best wishes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 21, 2009 - 8:56 PM
  4. what is a good positive control antibody to show that the procedure works?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 3:47 PM
  5. It is a very general question, but you can use histone antibodies as positive controls.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 18, 2010 - 5:01 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics