Evoluzione molecolare del ricombinasi Tre

Biology

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Summary

Qui riportiamo la generazione di Tre ricombinasi attraverso la regia, l'evoluzione molecolare. Tre ricombinasi riconosce un pre-definito sequenza bersaglio all'interno della sequenza LTR di HIV-1 provirus, con la conseguente escissione e l'eradicazione del provirus infette da cellule umane. Mentre ancora nella sua infanzia, per la regia evoluzione molecolare consentirà la creazione di enzimi personalizzati che fungeranno da strumenti di chirurgia molecolare e medicina molecolare.

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Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

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Abstract

Qui riportiamo la generazione di Tre ricombinasi attraverso la regia, l'evoluzione molecolare. Tre ricombinasi riconosce un pre-definito sequenza bersaglio all'interno della sequenza LTR di HIV-1 provirus, con la conseguente escissione e l'eradicazione del provirus infette da cellule umane.

Abbiamo iniziato con Cre, una 38-kDa ricombinasi, che riconosce un 34-bp a doppio filamento sequenza di DNA conosciuto come loxP. Cre perché possono effettivamente eliminare sequenze genomiche, abbiamo deciso di personalizzare un ricombinasi che potrebbe togliere la sequenza tra il 5'-LTR e 3'-LTR di un sistema integrato di HIV-1 provirus. Come primo passo abbiamo individuato le sequenze all'interno dei siti LTR che erano simili a loxP e testati per l'attività di ricombinazione. Inizialmente Cre e mutagenizzate librerie Cre non è riuscito a ricombinare i siti loxLTR scelto di HIV-1 provirus. Come l'inizio di ogni processo di evoluzione molecolare diretto richiede almeno attività residua, le sequenze originali loxLTR asimmetrico sono stati suddivisi in sottogruppi e testati di nuovo per l'attività di ricombinazione. Agendo come prodotti intermedi, attività ricombinazione è stata dimostrata con i sottoinsiemi. Successivamente, le biblioteche ricombinasi erano arricchiti attraverso cicli di evoluzione ripetitive. Successivamente, arricchito le biblioteche sono state mescolate e ricombinati. La combinazione di mutazioni diverse dimostrato sinergico e ricombinasi sono stati creati, che sono stati in grado di ricombinare loxLTR1 e loxLTR2. Questo è stato dimostrato che una strategia evolutiva attraverso intermedi può avere successo. Dopo un totale di 126 cicli di evoluzione ricombinasi individuali erano funzionalmente e strutturalmente analizzati. La ricombinasi più attivi - Tre - aveva 19 cambiamenti di aminoacidi rispetto al Cre. Tre ricombinasi è stato in grado di asportare il provirus di HIV-1 dal genoma di HIV-1 le cellule infettate HeLa (vedi "HIV-1 DNA provirale escissione Utilizzando un ricombinasi Evolved", Hauber J., Heinrich-Pette-Istituto di Virologia e Immunologia Sperimentale, Amburgo, Germania). Mentre ancora nella sua infanzia, per la regia evoluzione molecolare consentirà la creazione di enzimi personalizzati che fungeranno da strumenti di "chirurgia molecolare" e medicina molecolare.

Comments

3 Comments

  1. Dr. Frank Buchholz,

    Its nice to listen to the talk. I have some queries about Tre recombinase.,
     
    1, to excise a fragment using cre or tre i guess, there should be two loxp sites if you are targeting HIV LTR region it should be very specific region rather conserved region. So what happens if the LTR regions tend to mutate ?
    ², Isn't molecular evolution a long process to create such an recombinase ?

    3, There are "zinc finger nuclease" which are custom made enzyme which make specific cuts at DNA. It has the ability to bind to any piece of DNA. So will this technique be useful  for making "Zinc Finger Recombinase", which has the ability to bind LTR region and excise the whole or part of HIV genome.

    Hoping for your comments

    Roshan Padmanabhan
    India  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 26, 2008 - 12:40 PM
  2. TRE can eradiction Lentiviral Vector from transducted cell fully? if Yes you can find different beatween Tat-Dependent and Tat-Independent LV as target for eradiction 5LTR-LTR3 from genome integrated sit? Sincerely

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2008 - 7:24 AM
  3. Hello Dr. Frank Bucholz,
    Have you sequenced the host cell genome in the wild type control vs. the HIV-1 infected vs Tre recombinase cells to
    definitively show where the HIV-1 genome is inserting, and that it is removed? Much evidence points to nonrandom insertion
    of the HIV-1 genome.
    Doug Cork
    MHRP/HJF (dcork@hivresearch.org)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 21, 2009 - 10:06 AM

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