В пробирке Дифференциация Мышь эмбриональных стволовых (MES) ячеек с использованием висячей капли Метод

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

В этом видеоролике показано, как проводить в пробирке дифференциации мышиных эмбриональных стволовых клеток эмбриоидных органов использовании висячей капли метод.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, X., Yang, P. In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method. J. Vis. Exp. (17), e825, doi:10.3791/825 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Стволовые клетки обладают замечательными возможностями для развития в различные типы клеток. Когда стволовых клетка делится, каждая новая клетка имеет потенциал, чтобы либо остаются стволовых клеток или стать другой тип клетки с более специализированные функции, этот перспективный науки является ведущим ученым исследовать возможности клеточной терапии для лечения болезней. Когда культура во взвешенном состоянии без antidifferentiation факторов, эмбриональные стволовые клетки спонтанно дифференцироваться и образуют трехмерные многоклеточные агрегаты. Эти клеточные агрегаты называются эмбриоидные тела (ИС). Висячей капли культура широко используется EB формирование индукционным методом. Округлой нижней висячей капли позволяет агрегации ЭС клеток, которые могут обеспечить МЧС клетки хорошую среду для формирования ЭТ. Число ЭС клеток aggregatied в висячей капли можно управлять, варьируя количество клеток в исходной суспензии ячейки, чтобы висеть в виде капли на крышке чашки Петри. С помощью этого метода мы можем воспроизводимо образуют однородные ЭТ из определенного количества ЭС клеток.

Protocol

  1. Желировать T75 колбу использованием 0,1% раствора желатина и инкубировать пластины в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора культуры тканей ночь один день раньше.
  2. Выньте МЧС клетки инкубировать, аспирация среда, полоскание культуры ЭСК с PBS, добавить 0,05% раствора трипсина, чтобы покрыть дно тарелки (2 ml/100mm пластины).
  3. Инкубировать при 37 ° С в течение примерно 1 минуты, пока клетки отторжения от пластины.
  4. Аккуратно растирают (пипетки вверх и вниз) трипсином клетки четыре-шесть раз, чтобы разогнать ЭС клетки с подключено пипетки Пастера. Передача рассеяны ЭС клеток в 15-мл коническую трубку центрифуги содержащие предварительно нагретого (37 ° С) МЧС среды.
  5. Сбор клетки центрифугированием. Аспирируйте супернатант, добавить 10 мл среды МЧС и пипетку вверх и вниз для формирования суспензии отдельных клеток.
  6. Передача клеточной суспензии в T75 колбу предварительно покрытых с 0,1% желатина и инкубировать при температуре 37 ° C с 5% CO 2 в течение одного часа

    * Через час фибробластов приложил к пластине, а стволовые клетки остаются в среду. Внесите до среды для сбора стволовых клеток.

  7. Спиновые клетки при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин и аспирации от среды МЧС. Затем добавить еще 10 мл среды дифференциации МЧС и ресуспендирования клеток повторяющихся пипетки, пока, кажется, прекрасно суспензии клеток.
  8. Граф клеток с дифференциацией среды использования гемоцитометра разбавить подвески стволовых клеток в концентрации от 400 до 500 клеток в 20 мкл (20ul/drop) в стерильных бассейна.
  9. Поднимите крышку, осторожно инвертировать его и поместите его на самый верх блюда, содержащие 10 мл PBS. Использование многоканальной пипетки, чтобы выстроить линию из 20 мкл капель на последнюю оказалось внутренней поверхности крышки блюдо культуры ткани.
  10. Осторожно поместите блюдо в инкубаторе в течение 2 дней. После двух дней, аккуратно перевернуть крышкой, аспирация 180 ул свежей среды, дифференциацию и положить несколько капель в колодец 96-луночного планшета привязанности сверхнизких. Затем пикап капли с пипеткой и передачи данных падает, один за одним, к 96-луночного планшета. Место тарелки в инкубаторе в покое на 3 дня.
  11. Пальто каждую лунку 48-луночного культуре ткани пластины с 300ul 0,1% желатина. После добавления желатина, инкубировать пластине в течение ночи при 37 ° С на сутки вперед до передачи EBS.
  12. На следующий день, аспирации желатин от 48-луночного планшета. Затем добавьте 300 мкл дифференциации среды в каждую лунку. Передача ЭТ из 96-луночных на 48 и желатин пластинками, покрытыми один за одним. Изменение среды на следующий день, а затем изменить среду через день, чтобы поддерживать клетки.
  13. Спонтанное cardiaomyocyte сокращения должны быть очевидны в течение 7 дней.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Недостатками метода висячей капли в следующем: жидкий объем капли ограничивается менее 50ul из-за поддержания висит капель на крышку, поверхностного натяжения, и это невозможно изменить среду для подвешивания капель. Наблюдение формирования ЭТ в виде капель непосредственно с микроскопии также очень трудно в процессе культивирования. Более того, метод висячей капли состоит из двух этапов, поэтому серия шаг висячей капли метод может быть хлопотным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
DMEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 11965-092
Fetal Bovine Serum(FBS) Reagent Hyclone SH30070.03
L-Glutamine Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Non-Essential Amino Acids Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140-050
Penicllin / Streptomycin Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
Sodium Pyruvate Reagent GIBCO, by Life Technologies 11360-70
β-mercapt–thanol Reagent Chemicon International ES-007-E
leukemia inhibitory factor(LIF) Reagent Chemicon International LIF2005
96-well ultralow attachment plate Tool Corning 3474

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
  2. Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).

Comments

7 Comments

  1. Dear Doctor Xiang Wang,  your technique appear useful and very interesting. I' m studying mES and I want to differentiate them into simple embryoid bodies, but not into predefinite cells. So I have a question for you. The differentiation medium could be a stem cell medium just without LIF? Or do I need to add some elements to my medium to produce embryoid bodies? Thank you very much and best regards,  Barbara Tondelli.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 7:13 AM
  2. hi, i work together w/ xiang. he returned to china so i asked him to respond to you but in case he dŒsn't, let me answer: 1. yes. embryoid bodies can be made w/ the stem cell medium w/o lif. you need to create a voumetric clusters. this could be done using the hanging drop method or plate in cluster of cells. we have had best exerience making hanging drop. hope this helps.   phil

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 8, 2008 - 12:09 PM
  3. Hello I want to know the function and concentration here of sodium pyvurate. Can the heartbeat appear in a differentiation medium without sodium pyvurate? And if the plates are taken out sometimes during the suspension culture period, dŒs it matter so much? I've been trying but no cardiocytes seemed to appear, and I cannot find the key to this. Thank you a lot!  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 7, 2008 - 3:02 AM
  4. Dear Huijun Zhu,   I use 1mM Sodium pyvurate for mESC culturing. Sodium pyvurate works mostly  as  an additional source  energy. It also have protective effects against hydrogen peroxide.  According to my experience,  Sodium pyruvate is not necessary for differentiation. It 's not good for moving  out of the incubate when the EBs are in hanging drop situation. It should be fine to take out the plate carefully and take a simple look once they were in ultralow attachment plates. Hope this helps, Good luck!   Xiang Wang  
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2008 - 8:00 AM
  5. Thank you Xiang Wang! The cardiaomyocyte contractions became obvious after 9days. But the contraction of a certain area became weaker and finally disappeared. Is it  normal or something gŒs wrong? And how can I purify the cardiaomyocytes? How can I increase the percent of the cardiomyocytes? Thank you a lot!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 18, 2008 - 3:59 AM
  6. Dear Doctor Xiang Wang

    is necessary to add gelatin on the plate or not??

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 12, 2009 - 10:42 AM
  7. Dear Doctor Xiang Wang,

    is it possible to split the cardiomyocytes? Or how can i isolate them, to start my assays with them?
    Thank you very much.

    Kind regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 26, 2011 - 11:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics