Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Biology

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Summary

Questo video dimostra a 2 colori montare tutto ibridazione in situ, un metodo con cui il modello di espressione spaziale e temporale dei 2 geni differenti possono essere visualizzati in embrioni di pollo giovani. Questo metodo è stato originariamente introdotto da David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham e David Ish-Horowicz.

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Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

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Abstract

L'embrione di pollo è uno strumento prezioso per lo studio dello sviluppo embrionale precoce. La sua trasparenza, accessibilità e facilità di manipolazione, lo rendono uno strumento ideale per studiare l'espressione genica nel cervello, del tubo neurale, somite e il cuore la formazione di primordi. Questo video mostra le varie fasi a 2 colori montare tutto ibridazione in situ; In primo luogo, l'embrione è sezionato dall'uovo e fissati in paraformaldeide. In secondo luogo, l'embrione è trasformato per prehybridization. L'embrione viene quindi ibridato con due sonde diverse, una accoppiata a scavare, e uno accoppiato al FITC. A seguito di ibridazione durante la notte, l'embrione viene incubato con l'anticorpo DIG accoppiati. Reazione del colore per substrato DIG viene eseguita, e la regione di interesse appare blu. L'embrione viene quindi incubato con anticorpo FITC accoppiati. L'embrione è trasformato per una reazione a colori con FITC, e la regione di interesse appare rosso. Infine, l'embrione è fisso e trattati per phtograph e sezionamento. Una guida alla risoluzione è anche presentato.

Protocol

Parte 1: fissaggio degli embrioni

  1. Riempire piatto dissezione di ghiaccio freddo DEPC-PBS. Tenere su ghiaccio. Aprire l'uovo toccando il guscio con una pinza e rimuovere pezzi di conchiglia.
  2. Rimuovere spessore albumina con una pinza. Tilt sacco vitellino con una pinza grossolana in modo che embrione rivolto verso l'alto.
  3. Utilizzando le forbici, tagliare un quadrato di tutto il sacco vitellino dell'embrione.
  4. Utilizzando un cucchiaio, togliere embrione dal tuorlo e luogo sul ghiaccio freddo DEPC-PBS.
  5. Sotto il microscopio, rimuovere membrane e tuorlo e trasferimento piatto fissazione.
  6. Definire, rimuovere DEPC-PBS. Sostituire con 4% PFA in DEPC-PBS e fissare O / N a 4 ° C.
  7. Rimuovere fissativo. Sostituire con ghiaccio freddo DEPC-PBS. Utilizzando un ago smussato fine microcapillare o un coltello microdissezione, perforare il sistema nervoso e le cavità del cuore, per evitare cattura della sonda.
  8. Lavare 2x 10 mn DEPC-PBS con 0,1% di Tween-20 (PBT). Disidratare 10 minuti ciascuno in 25%, 50%, 75% di metanolo in PBT. Disidratare embrioni due volte in 100% di metanolo. Conservare a -20 ° C nel metanolo.

Parte 2: Prehybridization

  1. Reidratare embrioni 10 minuti ciascuna nel 75%, 50% e 25% di metanolo in PBT. Lavare 2x 10 mn in PBT.
  2. Nel frattempo, preparare fissativo freddo ghiaccio (4% paraformaldeide in PBT). Sostituire PBT con soluzione proteinasi K (3 ml / flacone; [? 5 g / ml] finale in PBT). Assicurarsi che la fiala intera è esposta alla soluzione proteinasi K da dolci colline del flaconcino, vedere Risoluzione dei problemi per tempi di esposizione.
  3. Utilizzando RNasi libero pipetta Pasteur rimuovere proteinasi K e aggiungere fissativo (2 ml). Immediatamente posto in ghiaccio per esattamente 20 minuti.
  4. Tutti i lavaggi RT vengono eseguite su nutator. Lavare 2x 10 milioni nel PBT, e 1x 10mn in PBT contenente tampone di ibridazione 50%.
  5. Lavare 1x nel buffer di ibridazione. Incubare a 65 ° C in 2 ml di buffer di ibridazione per 4-5 ore.

Parte 3: gli embrioni ibridare con sonde

  1. DIG e FITC sintesi accoppiata sonda è descritto in appendice. La sonda dovrebbe dare un segnale forte, dovrebbe essere synhesized con FITC contenenti nucleotidi, la sonda più deboli dovrebbero essere sintetizzati con con DIG contenenti nucleotidi.
  2. Preriscaldare sonde in tampone di ibridazione (500 ng / ml) utilizzando un flaconcino da 2 ml. Immediatamente sostituire il tampone di ibridazione con la soluzione della sonda. Non lasciare che gli embrioni a secco. Incubare per 16 ore a 65 ° C.
  3. Sostituire la sonda con tampone di ibridazione, 2 lavaggi, 30 minuti ciascuna a 65 ° C. Lavare 15 minuti in tampone di ibridazione / MABT (1 / 1 v / v /) a 65 ° C.

Parte 4: incubazione degli anticorpi DIG e colore di reazione

  1. Lavare 2x20 milioni nel MABT. Lavare 1 ora in 2% BBR / MABT. Lavare 5 ore nel 2% BBR/20% HISS / MABT (tampone di bloccaggio). Incubare in anticorpi 1:2000 DIG diluito in tampone di bloccaggio, O / N a 4 ° C su nutator.
  2. Lavare 3x 10 minuti ciascuno in MABT, e 3x 1 ora ciascuno in MABT.
  3. Lavare 2x 20 milioni nel NTMT. Aggiungi 200ul NBT / BCIP substrato NTMT a 10 ml. Rimuovere immediatamente NTMT dal flacone e sostituirlo con 1-2 ml NBT / BCIP buffer. Posto al buio. Monitorare la reazione del colore dopo 20 minuti, e ad intervalli di 20 minuti dopo.
  4. A seguito di reazione di colore (dovrebbe apparire blu), lavare in PBS per 10 milioni di euro, da definire sulla fissazione piatto pieno di PBS, e sostituire la soluzione con 4% PFA in PBS. Fix O / N a 4 ° C.
  5. Trasferimento a fiala di scintillazione nuovo. Lavare in PBST (PBS con 1% di Tween-20) 2x10 mn. Lavare in MABT 2x 10 mn.
  6. Incubare in MABT 30 mn a 63 ° C.

Parte 5: incubazione anticorpo FITC e il colore di reazione

  1. Lavare 2x 10 milioni nel MABT, 1 ora in 2% BBR / MABT, 5 ore in tampone di bloccaggio
  2. Incubare in fosfatasi alcalina accoppiamento anti-FITC-anticorpo (1:500) O / N a 4 ° C.
  3. Lavare 3x 10 minuti ciascuno in MABT, e 3x 1 ora ciascuno in MABT.
  4. Lavare in 2x 20 milioni nel TBS pH 8,45 con 0,1% di Tween-20 (TBST).
  5. Preparare vettore soluzione Rosso di lavoro (5 ml) in TBST utilizzando reagenti 1,2 e 3 fornito in kit. Rimuovere immediatamente TBST dal flacone e sostituirlo con tampone vettore rosso. Posto al buio. Monitorare la reazione del colore dopo 40 milioni di euro, e ad intervalli di 30 minuti dopo.
  6. Colore seguente reazione (dovrebbe apparire rosso), il trasferimento di embrioni PBS.

Parte 6: Fissazione ed elaborazione

  1. Trasferimento al piatto fissazione contenente PBS, e fissare nel 4% PFA per 20 minuti a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C.
  2. Lavare in PBS, 2x 10 mn. Al processo per la fotografia, il trasferimento del 20% glicerolo in PBS (questo renderà gli embrioni traslucido). Per creare una camera, taglio 2 strisce di nastro adesivo in PVC, sovrapporle sul vetrino. Tagliare una piazza del centro con una lama. Rimuovere le pinze piazza utilizzando.
  3. Al processo per il sezionamento cera, trasferimento a PBS, lavare 2x 10 mn, disidratano in serie graduata di metanolo (25%, 50%, 75% e 100% in PBS, a 10 minuti ciascuno).
  4. Sostituire con propanolo, 3mn. Sostituire con 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene, 20 minuti seguita da Histoclear (2 x 1 ora). Sostituire con histoclear / cera 1 / 1 (v / v) 60 ° C per 1 ora. Sostituire con cera un processoper l'esame istologico.

Parte 7: Soluzioni

Buffer di ibridazione, conservare a -20 ° C in Falcon da 50 ml: 25 formammide ml 3,25 ml (20xSSC), 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (10% di Tween-20), 2,5 ml (1% SDS) ; 125 ul (20mg/ml tRNA);. 100ul (50 mg / ml di eparina) MABT, preparare 100mM acido maleico, il pH a 7,5 con NaOH pellet. Aggiungi 150mm NaCl e lo 0,1% Tween-20.

NTMT (fatta al momento dell'uso), 50 ml: 1 ml (5M NaCl), 2,5 ml (2 M Tris-HCl pH9.5), 1,25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (10% di Tween-20).

TBST: 0.1M Tris-HCl, 0,15 m di NaCl, pH 8,45, 0,1% Tween-20.

Parte 8: Risoluzione dei problemi

Problema Causa Rimedio
Embrione è arrotolato Disidratazione insufficiente / reidratazione Mantenere intervalli di 10 minuti durante la successiva disidratazione / reidratazione passi
Non vi è alcun segnale della sonda La sonda è degradata contaminazione RNasi in flaconcino Esegui sonda su 1% gel Assicurarsi che la fiala intera è esposta alla soluzione proteinasi K al punto 2
Sonda è cavità etichette di cuore un tubo neurale Sonda è intrappolato Al punto 2, assicurarsi che tutte le cavità sono perforate coltello microdissezione con o microcapillare
Embrione disintegrato ibridazione seguente (punto 3) Proteinasi K passo sinistra temperatura di ibridazione troppo a lungo è troppo alta Proteinasi K non deve essere lasciato più lungo di 1mn (stadi 3 + e 4), 2 milioni (fase 5 a 7), 3 milioni di euro (stadio 8-10), 4 milioni di euro (stadio 11-13) Non ibridizzare a T o superiore di 65 ° C

Parte 9: Risultati Rappresentante

Embrioni rappresentante sono riportati di seguito: (A) Embrione (stadio HH7) è etichettato con un DIG-Sox sonda (blu) e una FITC-delta-1 sonda (rosso). (B) Embrione (stadio HH8) è etichettato con un DIG-Pax6 sonda (blu) e una FITC-Shh sonda (rosso). Nf, neurali piega, anp, piastra neurale anteriore, PSM, mesoderma presomitic, n, notocorda, nt, del tubo neurale). Doni sonda dai laboratori di Drs. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, e J. Briscoe.

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Discussion

Il 2-colore montare tutto nel metodo di ibridazione in situ è ​​utilizzato per determinare sia i modelli spaziali e temporali di espressione genica, utilizzando uno o due geni di interesse. Le applicazioni includono la valutazione dei pattern di espressione genica di nuovi geni (ad esempio 1,2, così come i cambiamenti nel gene insulto seguente espressione (manipolazione embrionale 3, perline 4, ed elettroporazione di RNA o DNA costruisce 5).

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Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal M. Margaret Alkek Fondazione RHF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

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