Изображениями создания эффектов памяти Т-клеток в ухо после индукции приемных DTH

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Здесь мы показываем, способ индуцирования и записи хода замедленного типа, гиперчувствительность (DTH) реакции у крыс уха. Это сопровождается демонстрацией подготовки крысы ткани уха в течение двух-фотонной визуализации эффектор / память ответа Т-клеток.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Matheu, M. P., Beeton, C., Parker, I., Chandy, K. G., D. Cahalan, M. Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH. J. Vis. Exp. (18), e907, doi:10.3791/907 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является иммунная реакция, в которой основными игроками являются CCR7 - эффектор / память Т-лимфоцитов. Здесь мы демонстрируем метод для стимулирования и записи хода DTH реакцию у крыс уха. Это сопровождается демонстрацией подготовки крысы ткани уха в течение двух-фотонной визуализации CCR7 - эффектор / память ответа Т-клеток.

Приемные DTH индуцирована при введении препарата в GFP-меченых Ova конкретных CCR7 - эффектор / память линии Т-клеток (Битон, С J. Визуализированные Эксперименты, выпуск 8). Затем клетки позволили, чтобы уравновесить у крыс в течение 48 часов до заражения путем введения одного уха физиологическим раствором (контроль уха), а другая с 1:01 смесь яиц и Ova сопряженных в Техас-красный (Ова-TR), чтобы позволить визуализации резидентов антиген-представляющих клеток.

Мы опишем метод подготовки ткани полезны для работы с изображениями подвижность клеток в глубокие слой кожи во время иммунного ответа, в сочетании с визуализацией коллагеновых волокон путем генерации второй гармоники. Ухо ткань разрезают на 5 х 5 мм квадраты (немного больше, тем лучше) и монтируются на пластиковые скользит покрова с использованием Vetbond ™, которые затем крепится с помощью силиконовой смазки в камеру изображения и superfused кислородом-пузырилась культуральной среде ткани при температуре 37 ° C .

Protocol

Индукция приемных DTH

Пожалуйста, смотрите Юпитера статье: индукция и мониторинг приемных гиперчувствительности замедленного типа у крыс
Кристина Битон, Джордж К. Chandy
Кафедры физиологии и биофизики университета Калифорнии в Ирвине
Дж. Визуализированные Эксперименты, выпуск 8

Здесь мы изменили этому протоколу с помощью антигена (Овальбумин) сопряженных в Техас-красный в пропорции 1:1 с немеченого антигена для обеспечения визуализации фагоцитарной антиген-представляющих клеток.

Урожай уха ткани

  1. Усыпить крысу в заданное время точки по процедурам, изложенным в Вашем утвержденным животных протокола. Здесь мы используем передозировка анестетика, изофлуран. Это делается в закрытом контейнере находится внутри хорошо вентилируемом капот. Обеспечить животное мертво либо обезглавливание, открыв грудную полость и режущие сердца.

  2. Используя большие ножницы удалить ухо с одной вырезать, как можно ближе к телу животного, насколько возможно (рис. 1).

    Figure_1.jpg
    Рисунок 1. Удаление крысы ухо

  3. Место ухо в 15 мл коническую трубку с ~ 10 мл ледяной 1x PBS или RPMI-1640. Храните образцы ткани на льду, пока вы не готовы подготовить ткань для работы с изображениями.

  4. Изображение ткань как можно скорее, мы находим, однако, что с 1 по 2 часа на льду не имеет заметного влияния на клеточной подвижности в тканях по сравнению с тканью собирают и отображаемого сразу.

Подготовка тканей для работы с изображениями

I. Удаление эпидермального и дермального слоя

* Примечание: глубокий слой кожи должны быть сохранены. Если все сделано правильно крупные кровеносные сосуды остаются неповрежденными и хряща уха не будет подвергаться. Это сложная техника, особенно, когда нет воспаления (контроль условий), и это полезно использовать рассекает микроскопом.

  1. Положите обе ткани и средств массовой информации из конической трубе в 10 см блюдо культуры ткани.

  2. С руками в перчатках держать ухо крысы мягко на кончике уха (дистальных) с дорсальной стороне уха вверх (рис. 2).

    Figure_2.jpg
    Рисунок 2. Trim мех ухо

  3. С большой палец на верхнюю часть уха, устойчивые ткани при использовании кончика закрытой Дюмон # 5 ножницы, чтобы отделить от дермы глубокие слои дермы. Или же, если край уха навеса кожи / глубокие слои дермы, это может быть понято пинцетом и аккуратно вытащил отделить это от ткани снизу (рис. 3).

    Figure_3.jpg
    Рисунок 3. Удаление верхней дермы

  4. После небольшой участок кожи был отделен от основной ткани, повторите шаги разделения альтернативно с помощью ножниц резать между кожных слоев и щипцы, чтобы аккуратно удалить и шелушиться кожа выбили.

  5. Expose 5 х 5 мм и более области уха ткани, которая составляет не менее 3 мм от начальной сайт антигена инъекции (рис. 4).

    Figure_4.jpg
    Рисунок 4. Ткань подвергается для работы с изображениями

II. Обеспечение тканей для изображений этап

  1. Вырезать пластического скольжения корки до размера чуть больше, чем готов ткани.

  2. Нанесите тонкий слой 3M ™ Vetbond ткани безопасный клей по слайду.

  3. Возьмитесь углу подготовлены ткани (где вы, вероятно, не образ), удалите из средств массовой информации, и приложите нижней ткани на бумаге линзы или Ким стереть, чтобы удалить излишки средства массовой информации.

  4. Сенсорный край ткани, чтобы клей покрыты слайд (Vetbond лечит сразу на мокрой ткани). Слегка растянуть ткань плоские, с противоположного конца будучи Последним, кто коснулся слайд (рис. 5)

    Figure_5.jpg
    Рисунок 5. Горы ткани для покрытия скольжения

  5. Cure Vetbond ™ обращением образец ткани / слайдов и макая ее в резервуар носителей, таких, что ткани и слайде лицом вниз, и примерно на 45 градусов. Холдинг ткани с ног на голову под углом помогает предотвратить лишний клей от лечения на открытой поверхности ткани. Клей на поверхность ткани будет блокировать лазера (рис. 6).

    Figure_6.jpg
    Рисунок 6. Cure vetbond ткани Gluэлектронной путем погружения в средствах массовой информации

    Примечание: Шаги 2-5 может занять немного практики для освоения. Попробуйте тренироваться с отбрасываются или дополнительных частей ткани, прежде чем в первый раз.

  6. Нанесите небольшое количество силиконовой смазки на нижней части слайда.

  7. Место слайда в перфузионной камере. Убедитесь, что перфузия СМИ течет, 37 ° С и кислородом перед добавлением ткани. Осторожно надавите на края слайда сделать печать с силиконовой смазки между дном перфузии камеры и пластического скольжения покрытия.

III. Два-Фотон изображений

  1. Использование светлого поля проходящего света, сосредоточьтесь на верхней части ткани. Выключите все огни.

  2. Включите лазер, ФЭУ, как того требует ваш многофотонной микроскопии системы.

  3. Генерация второй гармоники (ГВГ) в сильно упорядоченное белки волокнистых (коллаген и миозина) выдает сигнал на половину длины волны лазерного возбуждения. Мы используем возбуждение при 900 нм, что приводит к генерации второй гармоники на длине волны 450 нм, которые могут быть визуализированы с помощью "синего" канала микроскопа. ГВГ поколение нелинейные (двухфотонного) процесс, и таким образом обеспечивает оптическое "срезов" Эффект похож на двухфотонного возбуждения флуоресценции. Максимальной эффективности ГВГ происходит, когда фибриллы перпендикулярно лазер, в то время как фибриллы, которые работают параллельно не будут визуализированы 1.

  4. Найдите хорошего области изображения с большим количеством ячеек, установите приобретения области, такие, что большинство клеток находятся в центре и начать съемки. Примечание: В DTH реакции, Т-клетки и другие инфильтраты клетка часто встречаются, чтобы быть сконцентрированы вместе, пока другие районы лишены проникают клетки 2. Таким образом, это может занять некоторое время на поиск ткани, чтобы найти лучшее место для изображения.

  5. Проверка жизнеспособности клеток путем оценки скорости клеток и полярность во время съемки. Используйте низкую мощность лазера, который обеспечивает приемлемое качество изображения для обеспечения минимального фото-повреждения.

  6. Замена в новый препарат ткани по мере необходимости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
  2. Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
  3. Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
  4. Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
  5. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
  6. Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. In Press (2008).

Comments

6 Comments

  1. Hello. That was a great explanation for adoptive transfer and the techniques associated with that. In our laboratory, we are trying to employ DTH mouse model but we are using footpad, instead of an ear as it was shown that ear is less sensitive to linked suppression that footpad (W. J. Burlingham et. al.) We just acquired the same micrometer (thickness gauge) but our reading are very inconsistent. I was wondering if you ever tried footpad and could share some methods/hints to get stable/reproducible measurements.  Thanks, Vyacheslav Palchevskiy, Ph.D.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2008 - 10:27 PM
  2. Dear Vyacheslav, we have done a few trials in the footpad and have also had difficulties getting consistent results. I think it is because this area contains more soft tissue than the ear. One thing that may help: make sure your injections are very consistent in terms of amount and location (including depth). We have found that the depth of injection can considerably change the amount of inflammation and the number of T cells in the tissue. This is not a problem in the ear as you can’t really go too deep there. We always take at least 6 serial measurements for each ear or paw and then calculate a mean to try and get rid of the variation. The more variation we have, the more measurements we take of each ear or paw. Hope this help! Christine

    Reply
    Posted by: Christine B.
    November 11, 2008 - 4:52 PM
  3. We are in agreement  that the mouse footpad presents technical problems, even for routine histology. We use footpad for adoptive transfer of human PBMC because this site seems more sensitive for detecting regulation; however if Vyacheslav only wants to study effector response the mouse ear works fine. Your imaging system looks very appealing . We will try in ear first, then later in footpad. Thanks for this very nice 'webinar'. Cheers--Will Burlingham, UW-Madison, WI

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 5, 2008 - 3:41 PM
  4. Christine, I see you are using an Olympus ²0x dipping lens--is your ²photon system breadboard or a commercial Olympus? Right after you focus the objective into the ear tissue, the video switchs to the fluorescence time lapse.  Do you cover your sample/microscope or is your room very very dark.  Are you using non-descanned detectors?  Reason I am asking is on my ²004 BioRad MP system I have to cover the sample, monitors etc in order to use the nondesanned detectors.  It is hard for me to try these studies as I am also on an inverted system.  What wavelength are you using? Lance Rodenkirch UW

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 10, 2008 - 5:13 PM
  5. Hi Lance, This is Melanie. We use a custom breadboard for our two photon scan head system, the detailed plans for our custom system are on the Parker Laboratory (UC Irvine) website. We both keep the room dark and cover our microscope and PMT detectors with black-out curtain to reduce noise from stray light. In order to manipulate the sample after this we work "blind" with our hands under the black-out curtain. Our PMT detectors are also mounted inside sealed aluminum box. To reduce stray light from the monitors from affecting the sample we have them at an angle facing slightly away from where the microscope and PMTs are, but we do not cover them. To visualize collagen and GFP at the same time we use between 890 and 9²0nM. 9²0nM is typically the wavelength we used. I hope this helps. Do check the Parker Lab website for more details on the system. Best of luck with your experiments! Melanie  

    Reply
    Posted by: Melanie M.
    January 20, 2009 - 11:29 AM
  6. Great demo. We can employ this to our Imm. Lab. for the medical students. Can we acquire reagents from you girls and try it out here in Mackay Medical College, Taiwan.

    Reply
    Posted by: Nan Chi C.
    April 20, 2011 - 5:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics