ביצוע Patch ו-pipettes אלקטרודות שארפ עם פולר לתכנות

Published 10/08/2008
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

וידאו זה מראה כיצד להשתמש חולץ לתכנות לעשות pipettes תיקון אלקטרודות חדה electrophysiology. הפרוצדורה זהה ניתן להשתמש כדי ליצור מגוון של כלי זכוכית, כולל הזרקה ומחטים.

Cite this Article

Copy Citation

L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Microelectrodes זכוכית (הנקרא גם pipettes) היה סוס עבודה של electrophysiology במשך עשרות שנים. היום, טפטפות כאלה עשויים זכוכית נימים באמצעות חולץ לתכנות. כזה חום המכשירים נימי שימוש או נימה מתכת או לייזר להוציא את הזכוכית באמצעות הכבידה, מנוע או שניהם. Pipettes הקלטה תיקון-clamp נוצרות באמצעות חום כוח הכבידה בלבד, בעוד האלקטרודות חדה הקלטה תאיים להשתמש בשילוב של חום, כוח הכבידה, ואת המנוע. הליך המשמש לייצור טפטפות הקלטה תאיים דומה לזה המשמש לייצור הזרקת מחטים עבור מגוון של יישומים, כולל הזרקה לתוך ביציות Xenopus קרנה. בשנת זכוכית, כללי נימי <1.2 מ"מ קוטר היא נהגה להכין pipettes הקלטה מהדק תיקון, בעוד זכוכית צר משמש להקלטת תאיים (קוטר חיצוני = 1.0 מ"מ). לכל אחד מהכלים, חולץ מתוכנת שונה במקצת. סרט הווידאו הזה מראה איך לעשות את שני סוגי pipettes הקלטה באמצעות שנקבעה מראש תוכניות חולץ.

Protocol

משיכת pipettes

שימוש microelectrode כזה חולץ כמו סאטר P-97 Flaming / בראון, למשוך קבוצה של כ 10-20 pipettes.

  1. בחר זכוכית נימי שלך. אנו משתמשים בורוסיליקט נימים (סאטר BF150-110-10, 1.5mm קוטר חיצוני, קוטר פנימי 1.1mm, 10 ס"מ אורך). אחסן את הכוס בזהירות כך הוא נשאר נקי אבק חינם.
  2. תוכנית עיצוב מושך. אנו להשתמש בתוכנית 5 צעד, עם החום יורד ומהירות בכל שלב, וכן למשוך קטן על המדרגה האחרונה. פיפטה של ​​סאטר בישול היא הפניה מצוינת לפתח תוכניות מתאימות.
  3. בדוק את הטיפים פיפטה תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בקוטר הפתיחה החלקות. בטל מחוספס, טיפים אחידה, או לא סדיר. פרוטוקול משיכת טוב צריך להבטיח האלה הם נדירים. להקלטת תיקון-clamp סטנדרטי, פתחים טיפ צריך להיות 1-3 מיקרונים בקוטר. להתחדד תלול (בוטה קצה) מוביל התנגדות נמוכה יותר עבור קוטר הפתיחה זהה. הצורה והגודל ניתן לשנות על ידי ליטוש הלחץ.

ליטוש אש pipettes

  1. הגדרת מעטה ליטוש (microforge) עם נימה פלטינה חימום מבוקר על ידי דוושת רגל. ערכת שימושי זמין ALA מדעי (CPM-2) או מנגנון דומה ניתן להרכיב טיפין טיפין.
  2. אופציונלי: מעיל פיפטה עם מבודד כדי להקטין קיבוליות ולשפר את המאפיינים רעש. אנו משתמשים שעווה שיניים. Sylgard 184 ™ (poly-דימתיל אלסטומר siloxane הידוע גם בשם PDMS) היא גם אופציה.
  3. אם באמצעות שעווה, לשמור על אספקת מותכת קטן בקרבת מקום. עם לחץ אוויר על גבו של פיפטה לשמור שעווה מלהיכנס פיפטה, טובלים את קצה בקצרה בשעווה נוזלית ולהסיר. עם Sylgard, אלסטומר חנות שהוכנו aliquots קפוא לצבוע את קצה פיפטה תחת מיקרוסקופ. מחממים לרפא את אלסטומר.
  4. מניחים את פיפטה (מצופה או לא) במנגנון ליטוש להביא את קצה ~ 50 מיקרון מן החוט. זכור כי החוט תרחיב כאשר מחומם.
  5. מומלץ: בצע את פרוטוקול נפרד עבור "ליטוש לחץ" כדי לשנות את הצורה של פיפטה להתנגדות אופטימלית קוטר קצה.
  6. הדופק חום קצר (1-2 שניות) הוא מספיק כדי להסיר את השעווה מהקצה של פיפטה וחלק הזכוכית.
  7. מניחים את פיפטה סיים בתיבה סגורה על מנת להגן מפני אבק, חזור עבור 10 pipettes מוצלח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאויר פרוטוקול כאן נמצא בשימוש יומיומי electrophysiology מעבדות משמש גם כדי להפוך את מחטי הזרקה של תאים וחיות. עם חולץ לתכנות, קל לעשות pipettes עבור מגוון רחב של שימושים. עם תשומת לב וטיפול, חולץ על נימה שלך יימשך שנה או יותר. בהצלחה עם הניסויים שלך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

אנו מודים סוכנויות מימון הבאים היסודות תמיכה: National Institutes of Health, הקרן הלאומית למדע, איגוד הלב האמריקני, איגוד ניוון שרירים, ב 'דונלד E. בקסטר דליה קרן, קרן Klingenstein ולקרן מק' נייט למדעי המוח.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats