El apoyo de bicapa plana para la Formación de Estudio de la sinapsis inmunológica y Kinapse

Biology

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Summary

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Aquí, se muestra los métodos para el anclaje de las proteínas de adhesión celular sabe que modulan la formación de sinapsis en el folleto superior de la bilyer lípidos y visualizar la formación de sinapsis mediante microscopía TIRF.

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

Apoyado bicapas planas son potentes herramientas que pueden ser utilizados para modelar las interacciones moleculares en una sinapsis inmunológica. Para imitar la interacción entre los linfocitos y las células presentadoras de antígenos, se utiliza Ni2 + quelante de los lípidos para anclar la adhesión celular recombinante y proteínas MHC de la hoja superior de una bicapa con poli-histidina etiquetas. Bicapas planas son generados por la preparación de los lípidos, el tratamiento de las superficies de vidrio en la doble capa se forma, y ​​luego la formación de la bicapa en una cámara especial que contiene una celda de flujo, donde los linfocitos se añadirán. Entonces, bicapas están acusados ​​de Ni y su marcada con proteínas recombinantes se agregan. Finalmente, los linfocitos se inyectan en la celda de flujo y microscopía TIRF se puede utilizar para la formación de imágenes sinapsis y los mecanismos que controlan la locomoción de las células T, los sitios de la clasificación de los receptores, y los sitios de la degradación del receptor.

Protocol

1. La preparación de los lípidos

  1. A fin de vincular las proteínas de la hoja superior de una bicapa, usamos Ni 2 + lípidos quelantes, que anclan las proteínas recombinantes con poli-histidina etiquetas. Ciertos tipos de células pueden adherirse de forma inespecífica a Ni 2 + con recubrimiento bicapa, pero las células T en general, no, por lo que este método óptimo para el estudio de la activación de células T.
  2. La solución bicapa lipídica se realiza mediante la preparación de una solución de 20% de Ni 2 + quelante de lípidos y el 80% de fosfatidilcolina en la cuantía apropiada en un tubo de vidrio con 2.1 ml de cloroformo-metanol.
    1. Se evapora el solvente bajo una corriente de gas nitrógeno en un ambiente cálido (30-37 ° C) baño de agua. Esto suele tardar unos 15 minutos.
    2. Eliminar cualquier disolvente que queda en alto vacío, utilizando un liofilizador durante 90 minutos.
  3. Disolver los lípidos en el 2% de N-octil-glucósido detergente en Tris-buffer salina, lo que crea una solución de detergente mezclado / fosfolípido micelas. La concentración de fosfolípidos final debe ser de 0,4 mm. Para formar liposomas, diálisis de esta solución con tres cambios de Tris-salina para eliminar los liposomas detergente y forma. Por lo general, trabajan con volúmenes del orden de 1 ml con 6 mm de diámetro Spectra / Por # 2 tubos con un corte alrededor de 10 kDa. Tenemos el cuidado de excluir cualquier burbuja de aire cuando s de sujeción del tubo. Por lo general estériles filtro de esta solución y hacer la diálisis en condiciones de limpieza, la manipulación que utiliza el 70% de etanol guantes esterilizados.
  4. Esta solución debe ser transparente. Se almacena en atmósfera de argón para evitar la oxidación. Si la solución está turbia, y luego de varias paredes vesículas se han generado, y tendrá que empezar de nuevo.

2. Determinar la cantidad de ICAM-1 y MHC se depositan en la bicapa plana

  1. Con el fin de preparar el experimento, primero es necesario determinar la cantidad de ICAM-1 y MHC se depositan en una superficie dada de Ni 2 + quelante bicapa en una determinada concentración de proteína soluble. Para ello, bicapas depósito el 5 de cuentas de vidrio micrómetro de diámetro, se incuban las perlas de vidrio con soluciones de proteínas en las condiciones que se aproximan a los de las células de flujo utilizado para la imagen y leer la densidad de las proteínas mediante un ensayo de flujo immunofluorometric.
  2. Anticuerpos FITC marcado con un número conocido de fluoresceína por molécula se utilizan para detectar las proteínas unidas a la superficie. Fluoresceína cuentas estándar se utiliza para calibrar el flujo de microfluorimeter.
  3. Vamos a establecer las condiciones que se aproximan a los de células presentadoras de antígenos con 200 molecules/μm2 de ICAM-1 y 0.2-20 molecules/μm2 de I-Ek-MCC91-103 complejos.

3. Limpieza de los cubreobjetos de vidrio para la formación de bicapas planas

  1. Bicapas planas se forman espontáneamente cuando los liposomas se fusionan para vidrio, pero sólo si el cristal se limpian adecuadamente.
  2. Cuando se trabaja con Piraña, que use ropa de protección completa, incluyendo un delantal y guantes de ácido fuerte, resistente a los ácidos. Con cuidado, separar los residuos de los desechos orgánicos y deshágase de ellos apropiadamente.
  3. Para preparar la solución Piranha ácido, agregar 75 ml de ácido sulfúrico concentrado a un vaso de seco, y añadir con cuidado 25 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. La solución se calienta rápidamente a más de 100 ° C.
  4. Sumerja el cubreobjetos secos en la solución durante 15 minutos. Eliminar de la solución y enjuague con agua purificada durante un minuto por cada lado. Seque el cubreobjetos con una fuente de vacío para drenar el agua purificada. Deje que la solución Piranha de enfriar y agregar al contenedor de residuos Piranha, que se queda con la tapa suelta, bien marcado en la campana extractora de humos. Cuando todos los liposomas, cubreobjetos, y las proteínas están preparados, la sinapsis inmunológica está listo para ser formado.

4. La formación de las bicapas

  1. Para formar las bicapas, nuestro laboratorio utiliza Bioptechs FCSII cámaras, que tienen la ventaja de calefacción integrado. El sistema FCSII se encuentra en una base de acero inoxidable que se fija en conjunto de un colector de microfluidos con una junta de 0,5 mm superior, un tobogán microaqueduct recubiertas con óxido de estaño e indio para la calefacción en una superficie, con ranura de fluidos en el otro lado, libre de polvo 0,25 mm junta que define la altura de la cámara de flujo y la limpieza Piranha 40 mm cubreobjetos ronda en la que se forma la bicapa.
  2. Mientras que la hoja de la cubierta, sobre la cual se forma la doble capa, tiene que ser altamente hidrofílico y limpia, la diapositiva microacqueduct realmente funciona mejor si es más hidrofóbico. Haciendo que el hidrofóbicas microaqueduct más se logra mediante el tratamiento con 1% de HSA durante 60 minutos a temperatura ambiente, luego lavar con agua pura y el secado por completo después de este proceso de acondicionamiento, así como entre los usos. La capa de proteínas desnaturalizadas que dejan este procedimiento permite una l de suspensión de liposomas para formar una ronda, hemispherical gota que es> 0,25 mm de alto.
  3. Para montar la celda de flujo y la forma bicapas planas, coloque el colector, con los tubos dirigidos hacia arriba, sobre una superficie plana. Luego, coloque el 0. 5 mm junta con agujeros colocados en los tubos de fluidos, asegurándose de que está sentado plano. Con cuidado, coloque el lado microaqueduct en la junta con los canales de fluidos hacia arriba, y asegúrese de que se asiente plana sin aplicar ninguna presión a la baja, hasta comprobar que los orificios de la diapositiva se alinean con los tubos de microfluidos. Coloque el polvo 0,25 mm junta con un corte rectangular en la cima de la diapositiva microaqueduct para que el canal está alineada con los canales fluidos y no hay espacios de aire mayor.
  4. Coloque un máximo de 5 gotas x 1 l de suspensión de liposomas en la superficie de la diapositiva microaqueduct en un patrón tal que la distancia de centro a centro entre cada gota es de 2,5 mm. El 5 gotas de liposomas pueden tener diferentes composiciones, pero en este caso sólo se forman dos capas dobles, uno con no Ni 2 + + lípidos y un quelante con un 10% de Ni 2 + + lípidos quelantes.
  5. Una vez que las gotas están en su lugar, se coloca cuidadosamente la tapa de deslizamiento sobre la superficie en un solo movimiento. Abrazadera en la base lo más rápidamente posible. Las gotas de liposomas se pondrá en contacto con la hoja de la cubierta. Este contacto no se deben romper, ya que las bicapas probablemente ya han formado, cualquier interrupción puede resultar en bicapas defectuoso.
  6. Es importante tener en cuenta para marcar las posiciones de las capas dobles con manchas de tinta algunos pequeños en la diapositiva microacqueduct para ayudar en la colocación del cubreobjetos en el microscopio. Espere 20 minutos para asegurarse de que el sistema se haya equilibrado. La transferencia de todas las soluciones con una jeringa de 20 ml conectada a unos 20 cm de tubo flexible y una llave de 3 vías. Conectar otro puerto de la llave de paso a la celda de flujo en un tramo corto de tubería para reducir al mínimo el volumen muerto entre la llave y la célula de flujo. Llene la jeringa con solución salina tamponada con HEPES que contenía 2 mM de MgCl2, 1 mM CaCl 2, 5 mM de glucosa y 1% de albúmina sérica humana.
  7. El primer tubo de la llave de paso y para que no haya burbujas de aire. Conectar el flujo de las células y empujar a través de 5 ml en un solo movimiento mientras se ve para asegurarse de que no queden burbujas de aire pasar por encima de la bicapa. Ahora, usted tendrá su bicapas.

Este vídeo es compatible con el artículo "Hunter Gatherer y en la espalda: las sinapsis inmunológica y Kinapses como variaciones sobre el tema de la locomoción ameboide" por Michael L. Dustin , Informe Anual de Biología Celular y del Desarrollo , Volumen 24, 2008.

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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