حقن الوريد البوابة: طريقة لدراسة الانبثاث السرطان إلى الكبد

Overview

يصف هذا الفيديو إجراء جراحيا لتسليم خلايا الورم الثديي إلى كبد مورين عن طريق حقن الوريد المدخلي. يسمح هذا النموذج بالتحقيق في المراحل المتأخرة من انبثاث الكبد.

Protocol

1. إعداد المنطقة الجراحية والأدوات

1. إعداد مقص، ملقط، و hemostat عن طريق autoclaving في 124 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 1 -2 أيام قبل العمليات الجراحية المخطط لها. ضمان الوصول إلى الفراش أو العقيمة أو المعقمة، والأقفاص، والغذاء للتعافي بعد الجراحة.
2. إعداد منطقة جراحية مطهرة، ويفضل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح.
   1. امسح جميع أسطح المنطقة الجراحية بتبييض بنسبة 10٪، بما في ذلك وسادة التدفئة ومصدر الضوء وأنابيب التخدير ومخروط الأنف، وأي جزء آخر من الجناح الجراحي الذي سيكون على مقربة من العملية الجراحية أثناء إجرائها.
   2. في المنطقة الجراحية العقيمة ، ضع وسادة التدفئة النظيفة مع الستائر العقيمة ، مصدر الضوء ، أنابيب التخدير والأنف ، حقن الأنسولين ، حقن 1 مل ، bupivacaine ، الدموع الاصطناعية، المالحة العقيمة، 2 × 2 "الإسفنج الشاش العقيم، 4 × 4"الشاش المعقم، شاش الهيموستاتيكي مقطعة إلى 0.5 - 1 سم2 قطعة، مقص، ملقط، hemostat، 4-0 الغرز الفيكرييل مع إبرة تفتق، و 50 مل 2٪ الكلورهيكسيدين جلوكونات في وعاء أوتوكلافيد.
   3. تأكد من وجود مساحة في هذا الفضاء للخلايا السرطانية المعدة المخزنة على الجليد.
   4. على مقاعد البدلاء المجاورة للمنطقة الجراحية، وإعداد منطقة الانتعاش مع وسادة التدفئة الثانية وأقفاص نظيفة مع الفراش العقيمة.
      ملاحظة: يمكن لهذه المنطقة أيضا أن تضم عناصر مثل معقم الخرز.

2. مدخل الوريد حقن

1. قبل ساعة واحدة من الحقن المخطط لها ، عالج فئران Balb / c الأنثوية التي تتراوح أعمارهم بين 8 - 15 أسبوعا مع 100 ميكرولتر من 0.015 ملغ / مل بوبرينورفين ، تحت الجلد ، لإدارة الألم.
   ملاحظة: يمكن تطبيق بروتوكول الحقن هذا على أي سلالة من الفأر الأنثوي أو الذكر في أي عمر ، باستخدام خطوط الخلية المناسبة لإجراء تغييرات على السلالة.
2. إعداد الخلايا السرطانية للحقن على أساس بروتوكولات لخط الخلية أو الورم explant الاختيار. اختبار جميع خطوط الخلايا السرطانية قبل الإدارة لوجود مسببات الأمراض مورين للحد من خطر إدخال هذه مسببات الأمراض في مستعمرة الحيوان.
   1. لsyngeneic بالب / ج خطوط الخلايا السرطانية بما في ذلك D2A1، D2.OR، و 4T1 الخلايا السرطانية، إذابة الخلايا في لوحة زراعة الأنسجة 10 سم قبل 3 أيام من الحقن بحيث الخلايا في اليوم التالي هي في ~ 90 - 100٪ التقاء.
   2. 1 بعد يوم من ذوبان الخلايا السرطانية غسل الخلايا مرة واحدة مع 1x فوسفات العازلة المالحة (PBS) وتجربس الخلايا السرطانية التقاء باستخدام 2 مل من 0.05٪ تريبسين في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أضف 8 مل من الوسائط الكاملة (DMEM عالية الجلوكوز، 10٪ مصل البقر الجنيني، 2 mM L-الجلوتامين، و 1x البنسلين / streptomycin) ومرور 1:10 إلى طبق طازج 10 سم مع 10 مل من الوسائط الكاملة.
   3. في يوم الحقن، وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1x وتريبسينيز كما هو موضح أعلاه.
   4. Resuspend الخلايا جربسينيد في 8 مل من وسائل الإعلام كاملة، تدور لمدة 5 دقائق في 1500 × ز، وإزالة وسائل الإعلام وإعادة الإنفاق في 5 مل 1x برنامج تلفزيوني.
   5. عد الخلايا على مقياس الدم باستخدام استبعاد الأزرق تريبان لتقييم الجدوى. Resuspend الخلايا للحقن في برنامج تلفزيوني 1x في تركيز محدد مسبقا وحجم.
      ملاحظة: يوصى ب 5 - 10 ميكرولترات حيث تمنع أحجام الحقن الأصغر تلف الكبد غير الضروري.
   6. إبقاء الخلايا على الجليد لمدة الحقن. بعد الانتهاء من الحقن، أعد عينة من الخلايا إلى المختبر ووضعها في الثقافة في وسائط كاملة لمدة يوم واحد لضمان البقاء.
3. ضع الماوس تحت التخدير مع 2-2.5٪ ايزوفلوران (2-chloro-2-(ثنائيfluoromethoxy)-1،1،1-ثلاثي الفلورو-إيثان) تسليمها في الأكسجين. الحفاظ على درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة.  ضمان تخدير كامل عن طريق تقييم لرد فعل لقرصة إصبع القدم، ومن ثم الحفاظ على التخدير في 2-2.5٪ isoflurane.
   ملاحظة: من المهم مراقبة معدل تنفس الحيوانات وضبط معدل تدفق الأيزوفلوران وفقا لذلك طوال العملية.
4. ضع كمية صغيرة من الدموع الاصطناعية أو مرهم الطبيب البيطري فوق كل عين لتجنب التجفيف المفرط للعينين أثناء العملية الجراحية.
5. ضع الماوس في وضع ية، على ظهره مع تعرض البطن.
6. إزالة الشعر على الجانب الأيسر البطيني من القوارض من مساحة الضلع الثاني وصولا الى الحلمة الغدة الثديية الأربية 4 عن طريق مسح المنطقة مع إزالة الشعر الكيميائية. السماح لإزالة الشعر للجلوس لمدة 1 - 2 دقيقة ثم إزالة تماما مع الشاش وH2O. يمكن القيام بهذه الخطوة قبل 1 -2 أيام لتوفير الوقت إذا تم التخطيط للعديد من العمليات الجراحية.
7. اتخاذ واحد 2 × 2 "الشاش الاسفنج العقيم (غارقة في 2٪ Chlorhexidine) ومسح أسفل الماوس في موقع إزالة الشعر. تعقيم المنطقة المحيطة بأكملها، بما في ذلك الذيل، للحد من التلوث البكتيري للأدوات.
8. مسح موقع إزالة الشعر والمنطقة المحيطة بها إلى أسفل مع وسادة الإعدادية الكحول.
9. كرر 2٪ كلوهيكسيدين والكحول الخطوات مرة أخرى والانتهاء مع الكلورهيكسيدين النهائي مسح أسفل لما مجموعه ثلاثة 2٪ كلوهيكسيدين واثنين من الكحول الإعدادية يغسل وسادة. هل مسح الكلورهيكسيدين النهائي بحيث لا تقطر المادة الكيميائية حول موقع الجراحة لتجنب الحصول على الكلورهيكسيدين على الأعضاء الداخلية.
   ملاحظة: تطبيق كميات كبيرة من الكلورهيكسيدين والكحول على الجلد والفراء المحيطة بها قد يؤدي إلى انخفاض كبير في درجة حرارة الجسم. لا تمسح مع حجم الزائدة خلال الخطوات 2.7-2.9. الحفاظ على درجة حرارة الجسم مع وسادة التدفئة.
10. باستخدام قفازات معقمة ومشرط معقم مع شفرة معقمة، وجعل شق واحد 1 بوصة في الجلد بين الطائرات المتوسطة ومترهل على الجانب الأيسر من الماوس، بدءا فقط تحت الأضلاع وتنتهي فقط فوق مستوى الحلمة الغدة الثديية الإربي الرابع.
11. باستخدام مقص أو خرز معقمة أو ملقط، وجعل شق مماثل 1 بوصة في الصفاق. تجنب قطع وسادة الدهون الثديية وتأكد من عدم قطع الأمعاء أو الكبد أو الحجاب الحاجز.
12. ضع وسادة شاش 4 × 4 بوصة غارقة في محلول ملحي معقم على الجانب الأيسر من الماوس ، حيث تم إجراء الشق ، بحيث يمكن وضع الأعضاء الداخلية على الشاش وعدم ملامسة الجلد المحيط أو المنطقة الجراحية.
13. إعداد الخلايا السرطانية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات كما سوف تستقر الخلايا السرطانية أثناء إعداد الماوس. إعداد حقنة إبرة قابلة للإزالة 25 ميكرولتر وإبرة قياس 32 مع الخلايا السرطانية. دفع على حقنة حتى الخلايا السرطانية هي في غيض من الإبرة والمغطاس هو في الحجم المناسب للحقن; تجنب حقن فقاعات الهواء.
14. امسح الجزء الخارجي من الإبرة بوسادة كحول معقمة لإزالة أي خلايا ورم خارجية. توخي الحذر لتجنب العصي إبرة.
15. عقد الجانب المتوسط من الشق، بما في ذلك الجلد وبطانة الصفاق، وبصرف النظر مع ملقط واستخدام مسحة قطنية معقمة لسحب بعناية الأمعاء الكبيرة والصغيرة، ووضعها على الشاش المعقم غارقة في المالحة العقيمة. سحب الأمعاء الكبيرة والصغيرة حتى يتم تصور الوريد المدخل.
16. قم بتغطية الأعضاء الداخلية في الشاش الملوح المنقوع للحفاظ على الرطوبة الداخلية والعقم.
17. يكون مساعد، يرتدي أيضا قفازات معقمة، عقد الأمعاء ملفوفة في الشاش المالحة غارقة بلطف للخروج من الطريق مع مسحة القطن المعقم يميل للكشف تماما عن الوريد البوابة. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الضروري استخدام الهموستات أو ملقط autoclaved لعقد الأنسجة جانبا على الجانب المتوسط من الشق.
18. أدخل الإبرة المحملة بالخلايا السرطانية ~ 3 - 5 مم في الوريد المدخل ~ 10 مم تحت الكبد بزاوية و 5 درجات إلى الوريد ، مع شطبة تواجه. قم بحقن الحجم الكامل الذي يحتوي على خلايا الورم ببطء. السماح للدم بالتدفق عبر رأس الإبرة لعدة ثوان لتجنب التدفق الخلفي للخلايا السرطانية خارج الوريد. تقليل تحريك الإبرة في الوريد أثناء الحقن. مرة أخرى، توخي الحذر لتجنب العصي إبرة.
    ملاحظة: يتم تصور الوريد البوابة دون التكبير، ولكن يمكن استخدام المجهر ستيريو إذا كان ذلك مفضلا.
19. إزالة الإبرة في حين وضع في وقت واحد قضيب طرف القطن معقمة على الوريد مع الضغط. مع مساعد لا يزال عقد الأمعاء جانبا مكان قطعة واحدة من 0.5 - 1 سم2 الشاش الهيموستاتيكي على موقع الحقن على الوريد.
    ملاحظة: كما تمت محاولة مسحوق الهيموستاتيكي لهذه الخطوة في البروتوكول ولكنه لم يكن فعالا في وقف فقدان الدم الوريدي بعد الحقن.
20. عقد الشاش الهيموستاتيكي في موقع الحقن مع الضغط من قضيب طرف القطن العقيم لمدة 5 دقائق.
21. تقييم إغلاق الوريد عن طريق رفع بعناية الشاش الهيموستاتيكي، إذا كان الشاش العصي على الأنسجة المحيطة بها، يمكن استخدام كمية صغيرة من المالحة العقيمة لنقع ورفع الشاش.
22. إذا كان فقدان الدم يحدث في هذا الوقت، ضع قطعة إضافية من الشاش الهيموستاتيكي في الموقع مع الضغط لمدة 5 دقائق إضافية. عندما توقف تدفق الدم تماما، وإزالة الشاش من الماوس.
    ملاحظة: يجب تقييم فقدان الدم أثناء العملية الجراحية بعناية وإذا تم استيفاء إجمالي حجم فقدان الدم المسموح به أو تجاوزه (استنادا إلى إجراءات التشغيل القياسية التنظيمية لمجالس المراجعة المؤسسية للمحقق) يجب قتل الفأر أثناء التخدير عن طريق تغلغل القلب.
23. بمجرد اعتبار موقع الحقن سليما ، مع عدم وجود دم يغادر موقع الحقن ، ضع الأعضاء الداخلية بلطف مرة أخرى في تجويف البطن.
24. خياطة بطانة الصفاق ثم الجلد مع خياطة معقمة 4-0 فيكرييل وإبرة تفتق باستخدام نمط خياطة مستمرة أو متقطعة بسيطة. عادة، إغلاق الشق يتطلب 10-15 خياطة.
25. حقن 100 ميكرولتر من bupivacaine (5 ملغ / مل) على طول موقع شق لإدارة الألم المحلية باستخدام حقنة الأنسولين. حقن 0.5 مل من المالحة المعقمة تحت الجلد باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة قياس 26 للترطيب. تستغرق العمليات الجراحية من 15 إلى 25 دقيقة لإكمالها.
26. للحفاظ على الظروف العقيمة طوال فترة الجراحة، تأكد من تنظيف جميع الأدوات والمواد التي تتلامس مع الماوس، بما في ذلك الأيدي القفازة، بشكل مناسب قبل الاتصال. حيثما أمكن استخدام المواد والقفازات العقيمة، أو الحد الأدنى من الاستفادة من محلول الإيثانول 70٪ أو محلول التبييض 10٪ لتنظيف.
27. إذا كان من المقرر إجراء عمليات جراحية متعددة لدورة واحدة طبعة جديدة من المنطقة الجراحية الأولية مع الستائر العقيمة الطازجة، ومحاقن الأنسولين، 1 مل المحاقن، المالحة المعقمة، 2 × 2"الإسفنج الشاش المعقم، 4 × 4 "الشاش المعقم، الشاش الهيموستاتيكي مقطعة إلى 0.5 - 1 سم2 قطعة، 4-0 الغرز الفيكريال مع إبرة تفتق، و 2٪ كلرهيكسيدين. الخرز تعقيم المقص، ملقط، والهموستات في ما بين العمليات الجراحية والسماح لتبرد بشكل كاف قبل إعادة الاستخدام.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery