Overview
इस वीडियो पोर्टल नस इंजेक्शन के माध्यम से मुरीन जिगर के लिए स्तन ट्यूमर कोशिकाओं को देने के लिए एक शल्य प्रक्रिया का वर्णन करता है । यह मॉडल लिवर मेटास्टेसिस के देर से चरणों की जांच की अनुमति देता है।
Protocol
1. सर्जिकल क्षेत्र और उपकरणों की तैयारी
- नियोजित सर्जरी से 1 - 2 दिन पहले 30 मिनट के लिए 124 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेविंग करके कैंची, संदंश और हीमोस्टेट तैयार करें। सर्जिकल के बाद वसूली के लिए ऑटोक्लेव या बाँझ बिस्तर, पिंजरों, और भोजन तक पहुंच सुनिश्चित करें।
- एक असेप्टिक सर्जिकल क्षेत्र तैयार करें, अधिमानतः एक लैमिनार प्रवाह हुड में।
- हीटिंग पैड, प्रकाश स्रोत, संज्ञाहरण ट्यूबिंग और नाक शंकु, और सर्जिकल सुइट के किसी भी अन्य भाग है कि शल्य प्रक्रिया के करीब निकटता में होगा, जबकि यह किया जा रहा है सहित 10% ब्लीच के साथ शल्य क्षेत्र की सभी सतहों नीचे पोंछ ।
- एसेप्टिक सर्जिकल क्षेत्र में, साफ हीटिंग पैड को बाँझ कपड़ा, प्रकाश स्रोत, संज्ञाहरण ट्यूबिंग और नाक के साथ रखें, इंसुलिन सीरिंज, 1 मिलीलीटर सीरिंज, बुपिवाकेन, कृत्रिम आंसू, बाँझ खारा, 2 x 2 "बाँझ धुंध स्पंज, 4 x 4" बाँझ धुंध, हेमोस्टेटिक धुंध 0.5 में कटौती - 1 सेमी2 टुकड़े, कैंची, संदंश, हेमोस्टेट, टेपर सुई के साथ 4-0 vicryl टांके, और 50 मिलीलीटर 2% क्लोरहेक्सीडीन ग्लूकोनेट एक ऑटो कंटेनर में।
- सुनिश्चित करें कि बर्फ पर संग्रहीत तैयार ट्यूमर कोशिकाओं के लिए इस स्थान में कमरा है।
- सर्जिकल क्षेत्र से सटे बेंच पर, एक दूसरे हीटिंग पैड और बाँझ बिस्तर के साथ साफ पिंजरों के साथ वसूली क्षेत्र तैयार करते हैं।
नोट: इस क्षेत्र में मनका स्टरलाइजर जैसी वस्तुएं भी घर कर सकती हैं।
2. पोर्टल नस इंजेक्शन
- नियोजित इंजेक्शन से एक घंटे पहले, दर्द प्रबंधन के लिए 0.015 मिलीग्राम/एमएल बुप्रेनोरफिन के 100 माइक्रोन के साथ 8-15 सप्ताह की आयु के बाल्ब/सी महिला चूहों का इलाज करें।
नोट: इस इंजेक्शन प्रोटोकॉल को किसी भी उम्र में महिला या पुरुष माउस के किसी भी तनाव पर लागू किया जा सकता है, तनाव में परिवर्तन के लिए उपयुक्त सेल लाइनों का उपयोग करके। - कोशिका रेखा या पसंद के ट्यूमर एक्सप्लांट के लिए प्रोटोकॉल के आधार पर इंजेक्शन के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को तैयार करें। पशु कॉलोनी में ऐसे रोगजनकों को शुरू करने के जोखिम को कम करने के लिए मुरीन रोगजनकों की उपस्थिति के लिए प्रशासन से पहले सभी ट्यूमर सेल लाइनों का परीक्षण करें।
- D2A1, D2.OR, और 4T1 ट्यूमर कोशिकाओं सहित सिंजेनिक Balb/c ट्यूमर सेल लाइनों के लिए, एक 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेट में कोशिकाओं गल 3 दिन पहले इंजेक्शन से पहले इस तरह है कि अगले दिन कोशिकाओं ~ ९०-१००% संकुचन पर हैं ।
- 1 दिन ट्यूमर सेल गल वॉश कोशिकाओं के बाद एक बार 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% ट्राइप्सिन के 2 मिलीलीटर का उपयोग करके कॉन्फ्ल्यूंट ट्यूमर कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें। पूर्ण मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें (DMEM उच्च ग्लूकोज, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 mM L-ग्लूटामाइन, और 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) और 1:10 पूर्ण मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ एक ताजा 10 सेमी पकवान में पारित होने ।
- इंजेक्शन के दिन, 1x पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोएं और ऊपर वर्णित के रूप में ट्रिपसिनाइज करें।
- 8 मिलीलीटर पूर्ण मीडिया में ट्राइस्डिनाइज्ड कोशिकाओं को रीसुस्पेंड करें, 1,500 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें, मीडिया को हटा दें और 5 मिलीलीटर 1x पीबीएस में पुनर्सुस्ल्प करें।
- व्यवहार्यता मूल्यांकन के लिए ट्राइपैन ब्लू अपवर्जन का उपयोग करके हीमोसाइटोमीटर पर कोशिकाओं की गणना करें। पूर्व निर्धारित एकाग्रता और मात्रा में 1x पीबीएस में इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को फिर से र्घनी।
नोट: 5 - 10 माइक्रोन की सिफारिश की जाती है क्योंकि छोटे इंजेक्शन की मात्रा यकृत को अनावश्यक क्षति को रोकती है। - इंजेक्शन की अवधि के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को रखें। इंजेक्शन के पूरा होने के बाद, व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगशाला में कोशिकाओं का एक नमूना वापस करें और संस्कृति में 1 दिन के लिए पूरे मीडिया में रखें।
- माउस को ऑक्सीजन में वितरित 2 - 2.5% आइसोफ्लोरेन (2-क्लोरो-2- (डिफ्लोरोमेमेथोक्सी) - 1,1,1-ट्राइफ्लोरो-एथेन) के साथ संज्ञाहरण के नीचे रखें। हीटिंग पैड का उपयोग करके शरीर के तापमान को बनाए रखें। एक अंगुली चुटकी के लिए एक प्रतिक्रिया के लिए आकलन करके पूर्ण एनेस्थेटाइजेशन सुनिश्चित करें, और फिर 2 -2.5% आइसोफ्लुने पर संज्ञाहरण बनाए रखें।
नोट: यह जानवरों की सांस लेने की दर की निगरानी और प्रक्रिया के दौरान तदनुसार आइसोफ्लुन प्रवाह दर समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है । - सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान आंखों के अत्यधिक सूखने से बचने के लिए प्रत्येक आंख पर कृत्रिम आँसू या पशु चिकित्सक मरहम की एक छोटी राशि रखें।
- माउस को एक रीढ़ की स्थिति में रखें, पेट के साथ अपनी पीठ पर उजागर करें।
- रासायनिक डिपिलेटरी के साथ क्षेत्र को पोंछते हुए दूसरी रिब स्पेस से 4 इंगिनल स्तन ग्रंथि निप्पल तक कृंतक के वेंट्रल बाईं ओर बालों को हटा दें। डिपिलेटरी को 1 - 2 मिनट के लिए बैठने की अनुमति दें और फिर धुंध और एच 2ओ के साथ पूरी तरह से हटा दें। यदि कई सर्जरी की योजना बनाई जाती है तो समय बचाने के लिए यह कदम 1 -2 दिन पहले किया जा सकता है।
- एक 2 x 2 "बाँझ धुंध स्पंज (2% क्लोरहेक्सीडीन में भिगोया) लें और बालों को हटाने की साइट पर माउस को मिटा दें। उपकरणों के जीवाणु संदूषण को कम करने के लिए पूंछ सहित पूरे आसपास के क्षेत्र को स्टरलाइज करें।
- बालों को हटाने और आसपास के क्षेत्र की साइट को एक शराब तैयारी पैड के साथ नीचे पोंछें।
- दोहराएं 2% क्लोरहेक्सिडीन और अल्कोहल कदम एक बार फिर और अंतिम क्लोरहेक्सीडीन के साथ समाप्त करें कुल तीन 2% क्लोरहेक्सिडीन और दो अल्कोहल प्रेप पैड वॉश के लिए पोंछें। अंतिम क्लोरेक्सिडीन वाइप इस तरह करें कि आंतरिक अंगों पर क्लोरहेक्सीडीन होने से बचने के लिए सर्जिकल साइट के आसपास रसायन टपकता नहीं है।
नोट: त्वचा और आसपास के फर के लिए क्लोरहेक्सीडीन और अल्कोहल की बड़ी मात्रा के आवेदन के परिणामस्वरूप शरीर के तापमान में महत्वपूर्ण गिरावट आ सकती है। चरण 2.7-2.9 के दौरान अतिरिक्त मात्रा के साथ पोंछ न करें। हीटिंग पैड के साथ शरीर का तापमान बनाए रखें। - बाँझ दस्ताने और बाँझ ब्लेड के साथ एक निष्फल स्केलपेल का उपयोग करना, माउस के बाईं ओर औसत और sagittal विमानों के बीच त्वचा में एक 1 इंच चीरा बनाने के लिए, बस पसलियों के नीचे शुरू करने और सिर्फ चौथे inguinal स्तन ग्रंथि teat के विमान के ऊपर समाप्त ।
- ऑटोक्लेव या मनका निष्फल कैंची और संदंश का उपयोग करके, पेरिटोनम में एक समान 1 इंच चीरा बनाएं। स्तन वसा पैड में काटने से बचें और आंतों, जिगर, या डायाफ्राम को काटने के लिए सुनिश्चित न करें।
- माउस के बाईं ओर बाँझ नमकीन में भिगोए गए 4 x 4 "गॉज पैड रखें, जहां चीरा लगाया गया था, जैसे कि आंतरिक अंगों को धुंध पर रखा जा सकता है और आसपास की त्वचा या शल्य क्षेत्र के संपर्क में नहीं आ सकता है।
- ट्यूमर कोशिकाओं को कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके तैयार करें क्योंकि माउस की तैयारी के दौरान ट्यूमर कोशिकाएं व्यवस्थित हो जाएंगी। ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक 25 μl हटाने योग्य सुई सिरिंज और 32 गेज सुई तैयार करें। सिरिंज पर पुश जब तक ट्यूमर कोशिकाओं सुई की नोक पर है और प्लंजर इंजेक्शन के लिए उपयुक्त मात्रा में है; हवा के बुलबुले के इंजेक्शन से बचें।
- किसी भी बाहरी ट्यूमर कोशिकाओं को हटाने के लिए एक बाँझ शराब पैड के साथ सुई के बाहर पोंछें। सुई की छड़ें से बचने के लिए सावधानी बरतें।
- चीरा के औसत पक्ष को पकड़ें, जिसमें त्वचा और पेरिटोनियल अस्तर शामिल हैं, एक तरफ संदंश के साथ और बड़ी और छोटी आंतों को ध्यान से खींचने के लिए बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करें, उन्हें बाँझ खारा में भिगोए हुए बाँझ धुंध पर रखें। पोर्टल नस की कल्पना होने तक बड़ी और छोटी आंतों को बाहर निकालें।
- आंतरिक नमी और बंध्यता बनाए रखने के लिए खारा लथपथ धुंध में आंतरिक अंगों को कवर करें।
- एक सहायक है, भी बाँझ दस्ताने पहने हुए, खारा लथपथ धुंध में लिपटे आंतों धीरे एक बाँझ कपास इत्तला दे दी झाड़ू के साथ रास्ते से बाहर पकड़ पूरी तरह से पोर्टल नस प्रकट करने के लिए । इसके अतिरिक्त, चीरा के औसत पक्ष पर ऊतक को अलग रखने के लिए ऑटोक्लेवेड हेमोस्टेट या संदंश का उपयोग करना आवश्यक हो सकता है।
- ट्यूमर कोशिकाओं से भरी सुई डालें ~ 3 - 5 मिमी पोर्टल नस में ~ 10 मिमी जिगर के नीचे एक कोण पर और एलटी; 5 डिग्री नस के लिए, बेवेल के साथ ऊपर का सामना करना पड़ रहा है। धीरे-धीरे ट्यूमर कोशिकाओं युक्त पूर्ण मात्रा इंजेक्ट करें। नस से बाहर ट्यूमर कोशिकाओं के पीछे प्रवाह से बचने के लिए कई सेकंड के लिए सुई सिर पिछले प्रवाह के लिए रक्त की अनुमति दें। इंजेक्शन के दौरान नस में सुई को स्थानांतरित करने को कम करें। फिर से, सुई की छड़ें से बचने के लिए सावधानी का प्रयोग करें।
नोट: पोर्टल नस का दृश्य आवर्धन के बिना किया जाता है, हालांकि यदि पसंदीदा हो तो स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है। - सुई निकालें, जबकि एक साथ दबाव के साथ नस पर एक बाँझ कपास टिप एप्लिकेटर रखकर। सहायक के साथ अभी भी आंतों को एक तरफ रखने के साथ नस पर इंजेक्शन साइट पर 0.5 - 1 सेमी 2 हेममोस्टेटिक धुंध का एक टुकड़ा रखें।
नोट: प्रोटोकॉल में इस कदम के लिए हेमोस्टेटिक पाउडर का भी प्रयास किया गया था लेकिन इंजेक्शन के बाद विषैले रक्त की कमी को रोकने में प्रभावी नहीं था। - 5 मिनट के लिए बाँझ कपास टिप एप्लिकेटर के दबाव के साथ इंजेक्शन साइट पर हीमोस्टेटिक धुंध पकड़ो।
- ध्यान से हीमोस्टेटिक धुंध को उठाने से नस के बंद होने का आकलन करें, यदि धुंध आसपास के ऊतकों से चिपक जाती है, तो थोड़ी मात्रा में बाँझ नमकीन का उपयोग धुंध को भिगोने और उठाने के लिए किया जा सकता है।
- यदि इस समय रक्त की कमी होती है, तो अतिरिक्त 5 मिनट के लिए दबाव के साथ साइट पर हीमोस्टेटिक धुंध का एक अतिरिक्त टुकड़ा रखें। जब रक्त प्रवाह पूरी तरह से बंद हो गया हो, तो माउस से धुंध को हटा दें।
नोट: शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान रक्त की कमी का सावधानीपूर्वक आकलन किया जाना चाहिए और यदि कुल अनुमति प्राप्त रक्त हानि की मात्रा को पूरा किया जाता है या पार कर लिया जाता है (अन्वेषक के संस्थागत समीक्षा बोर्डों के लिए नियामक मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं के आधार पर) माउस को हृदय परि ओरफ्यूजन द्वारा संज्ञाहरण के तहत इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए। - एक बार इंजेक्शन साइट को बरकरार समझा जाता है, इंजेक्शन साइट छोड़ने वाले कोई रक्त के साथ, आंतरिक अंगों को धीरे-धीरे पेट की गुहा में वापस रखें।
- सीवनियल अस्तर और फिर एक साधारण सतत या बाधित सीवन पैटर्न का उपयोग कर बाँझ 4-0 vicryl सीवन और टेपर सुई के साथ त्वचा। आमतौर पर, चीरा बंद करने के लिए 10-15 टांके की आवश्यकता होती है।
- इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके स्थानीय दर्द प्रबंधन के लिए चीरा साइट के साथ बुपिवाकेन (5 मिलीग्राम/मिलीलीटर) के 100 माइक्रोन इंजेक्ट करें। जलयोजन के लिए 26 गेज सुई के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके 0.5 मिलीलीटर बाँझ नमकीन को संक्षेप में इंजेक्ट करें। सर्जरी को पूरा करने के लिए 15 -25 मिनट लेते हैं।
- सर्जरी के दौरान बाँझ स्थितियों को बनाए रखने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि दस्ताने हाथों सहित माउस के संपर्क में आने वाले सभी उपकरणों और सामग्रियों को संपर्क से पहले उचित रूप से साफ किया जाता है। जहां संभव उपयोग बाँझ सामग्री और दस्ताने, या कम से कम एक 70% इथेनॉल समाधान या 10% ब्लीच समाधान का उपयोग करने के लिए साफ।
- यदि एक ही सत्र के लिए कई सर्जरी की योजना बनाई है ताजा बाँझ कपड़ा के साथ प्रारंभिक शल्य क्षेत्र रीमेक, इंसुलिन सीरिंज, 1 मिलीलीटर सीरिंज, बाँझ नमकीन, 2 x 2 "बाँझ धुंध स्पंज, 4 x 4" बाँझ धुंध, हेमोस्टेटिक धुंध 0.5 में कटौती - 1 सेमी2 टुकड़े, टेपर सुई के साथ 4-0 vicryl टांके, और 2% क्लोरहेक्सीडीन। मनका-सर्जरी के बीच में कैंची, संदंश, और हीमोस्टेट नसबंदी और फिर से उपयोग करने से पहले पर्याप्त रूप से शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | 309597 |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
