Portal Damar Enjeksiyonu: Karaciğere Kanser Metastazını İnceleme Yöntemi

Overview

Bu videoda meme tümörü hücrelerinin portal damar enjeksiyonu ile murine karaciğerine ulaştırılması için yapılan cerrahi bir işlem açıklanmaktadır. Bu model karaciğer metastazının geç evrelerinin araştırılmasına izin eder.

Protocol

1. Cerrahi Alan ve Aletlerin Hazırlanması

1. Makası, forsepsleri ve hemostatları planlanan ameliyatlardan 30 dakika, 1 - 2 gün önce 124 °C'de otoklavlayarak hazırlayın. Ameliyat sonrası iyileşme için otoklavlı veya steril yataklara, kafeslere ve yiyeceklere erişimi sağlayın.
2. Tercihen laminer akış davlumbazında aseptik bir cerrahi alan hazırlayın.
   1. Isıtma yastığı, ışık kaynağı, anestezi tüpü ve burun konisi dahil olmak üzere cerrahi bölgenin tüm yüzeylerini% 10 çamaşır suyu ile silin ve cerrahi süitin yapılırken cerrahi prosedüre yakın olacak diğer herhangi bir bölümünü silin.
   2. Aseptik cerrahi bölgeye, temizlenmiş ısıtma yastığını steril örtü, ışık kaynağı, anestezi tüpü ve burun kafesi, insülin şırınnaları, 1 ml şırınnalar, bupivacaine ile yerleştirin, yapay gözyaşı, steril salin, 2 x 2" steril gazlı bez süngerler, 4 x 4" steril gazlı bez, 0,5 - 1 cm2 parçalar halinde kesilmiş hemostatik gazlı bez, makas, toparlama, hemostat, konik iğneli 4-0 vicryl dikiş ve otoklavlı bir kapta 50 ml% 2 Klorheksidin glukat.
   3. Bu alanda buz üzerinde saklanan hazırlanmış tümör hücreleri için yer olduğundan emin olun.
   4. Cerrahi alanın bitişiğindeki bankta, ikinci bir ısıtma yastığı ile iyileşme alanını hazırlayın ve steril yataklarla kafesleri temizleyin.
      NOT: Bu alan boncuk sterilizatörü gibi eşyalara da ev sahipliği yapabilir.

2. Portal Damar Enjeksiyonu

1. Planlanan enjeksiyonlardan bir saat önce, 8 - 15 haftalık Balb / c dişi fareleri ağrı yönetimi için deri altından 100 μl 0.015 mg / ml buprenorfin ile tedavi edin.
   NOT: Bu enjeksiyon protokolü, herhangi bir yaşta kadın veya erkek farenin herhangi bir türüne, suşta yapılan değişiklikler için uygun hücre çizgileri kullanılarak uygulanabilir.
2. Tümör hücrelerini, hücre çizgisi veya tümörün tercih edilmesi için protokollere göre enjeksiyon için hazırlayın. Bu tür patojenlerin hayvan kolonisine sokulma riskini azaltmak için murin patojenlerinin varlığını uygulamadan önce tüm tümör hücre hatlarını test edin.
   1. D2A1, D2.OR ve 4T1 tümör hücrelerini içeren singeneik Balb/c tümör hücre hatları için, enjeksiyondan 3 gün önce hücreleri 10 cm doku kültürü plakasına çözün, böylece ertesi gün hücreler ~ 90 - 100% izdiahtadır.
   2. 1 gün sonra tümör hücresi çözülme hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez yıkayın ve 5 dakika boyunca 37 °C'de% 0.05 tripsin 2 ml kullanarak birleştiğinde tümör hücrelerini trypsinize edin. 8 ml tam ortam (DMEM yüksek glikoz, %10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin ve 1x penisilin/streptomisin) ekleyin ve 1:10'u 10 ml tam medya ile taze 10 cm'lik bir yemeğe geçirin.
   3. Enjeksiyonların olduğu gün, hücreleri yukarıda açıklandığı gibi 1x PBS ve trypsinize ile bir kez yıkayın.
   4. 8 ml komple ortamda trypzzed hücreleri yeniden biriktirin, 1.500 x g'da 5 dakika döndürün, ortamı çıkarın ve 5 ml 1x PBS'de yeniden biriktirin.
   5. Canlılık değerlendirmesi için trypan mavi dışlama kullanarak hemositometredeki hücreleri sayın. Önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda ve hacimde 1x PBS'de enjeksiyon için hücreleri yeniden biriktirin.
      NOT: Daha küçük enjeksiyon hacimleri karaciğerin gereksiz hasar görmesini önlediği için 5 - 10 μl önerilir.
   6. Enjeksiyonlar süresince hücreleri buzda tutun. Enjeksiyonların tamamlanmasından sonra, bir hücre örneğini laboratuvara geri verin ve canlılığı sağlamak için 1 gün boyunca tam medyada kültüre yerleştirin.
3. Fareyi oksijende verilen % 2 - 2,5 izofluran (2-kloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-etan) ile anestezi altına yerleştirin. Isıtma yastığını kullanarak vücut sıcaklığını koruyun.  Bir ayak parmağı sıkışmasına reaksiyon için değerlendirerek tam anestezi sağlayın ve ardından anesteziyi% 2 - 2.5 izofluranda koruyun.
   NOT: Hayvanların nefes alma hızını izlemek ve izofluran akış hızını prosedür boyunca buna göre ayarlamak önemlidir.
4. Cerrahi işlem sırasında gözlerin aşırı kurumasını önlemek için her gözün üzerine az miktarda yapay gözyaşı veya veteriner merhem yerleştirin.
5. Fareyi sırtüstü bir konuma, karnı açık olacak şekilde sırtına yerleştirin.
6. Bölgeyi kimyasal depilatör ile silerek kemirgenlerin ventral sol tarafındaki saçları ikinci kaburga boşluğundan 4. kasık meme bezi meme ucuna kadar çıkarın. Depilatörün 1 - 2 dakika oturmasına izin verin ve ardından gazlı bez ve H2O ile tamamen çıkarın. Bu adım, çok sayıda ameliyat planlanıyorsa zaman kazanmak için 1 - 2 gün önceden yapılabilir.
7. Bir adet 2 x 2" steril gazlı bez süngeri alın (%2 Klorheksidin'e batırılmış) ve epilasyon yerinde fareyi silin. Aletlerin bakteriyel kirlenmesini en aza indirmek için kuyruk da dahil olmak üzere tüm çevreyi sterilize edin.
8. Epilasyon ve çevresini alkol hazırlık yastığı ile silin.
9. % 2 Klorheksidin ve alkol adımlarını bir kez daha tekrarlayın ve toplam üç% 2 Klorheksidin ve iki alkol prep pad yıkaması için son bir Klorheksidin silme ile bitirin. Son Klorheksidin silme işlemini, iç organlara Klorheksidin bulamamak için kimyasalın cerrahi bölgenin etrafına damlamayacak şekilde yapın.
   NOT: Cilde ve çevresindeki kürke büyük miktarlarda klorheksidin ve alkol uygulanması vücut ısısında önemli bir düşüşe neden olabilir. 2.7-2.9. adımlar sırasında fazla hacimle silmeyin. Isıtma yastığı ile vücut sıcaklığını koruyun.
10. Steril eldivenler ve steril bıçaklı sterilize edilmiş bir neşter kullanarak, farenin sol tarafındaki ortanca ve sagittal düzlemler arasında, kaburgaların hemen altından başlayıp dördüncü kasık meme ucunun düzleminin hemen üzerinde biten cilde 1 inçlik tek bir kesi yapın.
11. Otoklavlı veya boncuk sterilize makas ve tozlar kullanarak peritona benzer bir 1 inçlik kesi yapın. Meme yağ yastığını kesmekten kaçının ve bağırsakları, karaciğeri veya diyaframı kesmemeye dikkat edin.
12. Farenin sol tarafına steril salin içine batırılmış, kesiğin yapıldığı, iç organların gazlı bez üzerine yerleştirilebileceği ve çevredeki cilt veya cerrahi alanla temas etmeyecek şekilde 4 x 4" gazlı bez pedi yerleştirin.
13. Farenin hazırlanması sırasında tümör hücreleri yerleşeceğinden, birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak tümör hücrelerini hazırlayın. Tümör hücreleri ile 25 μl çıkarılabilir iğne şırıngası ve 32-gauge iğne hazırlayın. Tümör hücreleri iğnenin ucuna gelene ve piston enjeksiyon için uygun hacme gelene kadar şırıngayı itin; hava kabarcıklarının enjeksiyonundan kaçının.
14. Dış tümör hücrelerini çıkarmak için iğnenin dışını steril bir alkol pedi ile silin. İğne çubuklarını önlemek için dikkatli olun.
15. Deri ve periton astarı da dahil olmak üzere kesiğin ortanca tarafını, ön ayaklarla bir kenara tutun ve büyük ve ince bağırsakları dikkatlice çekmek için steril bir pamuklu çubuk kullanın ve steril saline batırılmış steril gazlı bez üzerine yerleştirin. Portal damar görselleşene kadar iri ve ince bağırsakları çekin.
16. İç organları, iç nemi ve steriliteyi korumak için salinle ıslatılmış gazlı bezle örtün.
17. Ayrıca steril eldivenler giyen bir asistanınız olsun, salinle ıslatılmış gazlı beze sarılı bağırsakları, portal damarı tamamen ortaya çıkarmak için steril pamuk uçlu bir çubukla yavaşça yoldan uzak tutun. Ek olarak, kesiğin ortanca tarafında dokuyu bir kenara tutmak için otoklavlı hemostat veya tokmak kullanmak gerekebilir.
18. Tümör hücreleriyle dolu iğneyi ~ 3 - 5 mm portal damara ~ karaciğerin 10 mm altına, eğim yukarı bakacak şekilde, damara 5° açıyla yerleştirin. Tümör hücrelerini içeren tüm hacmi yavaşça enjekte edin. Tümör hücrelerinin damardan geri akışını önlemek için kanın iğne kafasının yanından birkaç saniye akmasına izin verin. Enjeksiyon sırasında iğneyi damarda hareket ettirmeyi en aza indirin. Yine, iğne çubuklarını önlemek için dikkatli olun.
    NOT: Portal damarın görselleştirilmesi büyütme olmadan yapılır, ancak tercih edilirse stereo mikroskop kullanılabilir.
19. Damar üzerine basınçla aynı anda steril bir pamuk ucu aplikatörü yerleştirirken iğneyi çıkarın. Asistan hala bağırsakları bir kenara tutarken, damardaki enjeksiyon bölgesinin üzerine 0,5 - 1 cm2 hemostatik gazlı bez parçası yerleştirin.
    NOT: Hemostatik toz da protokoldeki bu adım için denendi, ancak enjeksiyondan sonra venöz kan kaybını durdurmada etkili olmadı.
20. Hemostatik gazlı bezi enjeksiyon alanında steril bir pamuk ucu aplikatörden gelen basınçla 5 dakika tutun.
21. Hemostatik gazlı bezi dikkatlice kaldırarak damarın kapanmasını değerlendirin, gazlı bez çevredeki dokuya yapışırsa, gazlı bezi ıslatmak ve kaldırmak için az miktarda steril salin kullanılabilir.
22. Şu anda kan kaybı meydana gelirse, ek bir 5 dakika boyunca basınçla bölgeye ek bir hemostatik gazlı bez yerleştirin. Kan akışı tamamen durduğunda, gazlı bezi fareden çıkarın.
    NOT: Cerrahi işlem sırasında kan kaybı dikkatle değerlendirilmeli ve izin verilen toplam kan kaybı hacmi karşılanırsa veya aşılırsa (araştırmacının kurumsal inceleme kurulları için düzenleyici standart çalışma prosedürlerine dayanarak) fare kalp perfüzyonu ile anestezi altındayken ötenaziye tabi edilmelidir.
23. Enjeksiyon bölgesi sağlam kabul edildikten sonra, enjeksiyon bölgesinden kan çıkmadan, iç organları yavaşça karın boşluğuna geri yerleştirin.
24. Basit bir sürekli veya kesintili dikiş deseni kullanarak periton astarını ve ardından cildi steril 4-0 vicryl dikiş ve konik iğne ile dikin. Tipik olarak, kesiği kapatmak 10-15 dikiş gerektirir.
25. İnsülin şırınnası kullanarak lokal ağrı yönetimi için kesi bölgesi boyunca 100 μl bupivakain (5 mg/ml) enjekte edin. Hidrasyon için 26-gauge iğne ile 1 ml şırınga kullanarak 0,5 ml steril salin deri altından enjekte edin. Ameliyatların tamamlanması 15 - 25 dakika sürer.
26. Ameliyat boyunca steril koşulları korumak için, eldivenli eller de dahil olmak üzere fareyle temas eden tüm araç ve gereçlerin temastan önce uygun şekilde temizlendiğini sağlayın. Mümkün olduğunda steril malzemeler ve eldivenler kullanın veya temizlemek için% 70 etanol çözeltisi veya% 10 çamaşır suyu çözeltisi kullanın.
27. Tek seans için birden fazla ameliyat planlanıyorsa, ilk cerrahi bölgeyi taze steril örtü ile yeniden yapmak, insülin şırıngaları, 1 ml şırıngalar, steril salin, 2 x 2" steril gazlı bez süngerleri, 4 x 4" steril gazlı bez, 0,5 - 1 cm2 parça halinde kesilmiş hemostatik gazlı bez, konik iğneli 4-0 vicryl dikiş ve% 2 Klorheksidin. Ameliyatlar arasında makası, tosları ve hemostatı boncuk sterilize edin ve yeniden kullanmadan önce yeterince soğumaya bırakın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery