포털 정맥 주입: 간암 전이를 연구하는 방법

Overview

이 비디오는 포털 정맥 주사를 통해 뮤린 간으로 유방 종양 세포를 전달하는 외과 적 절차를 설명합니다. 이 모델은 간 전이의 늦은 단계의 조사를 허용합니다.

Protocol

1. 수술 부위 및 기기 준비

1. 계획된 수술 전에 124°C에서 30분, 1 -2일 동안 124°C에서 자동으로 자동화하여 가위, 집게 및 헤모스타를 준비한다. 수술 후 회복을 위해 자동 식용 또는 멸균 침구, 케이지 및 음식에 대한 액세스를 보장하십시오.
2. 기동 후드에서 기부 수술 부위를 준비한다.
   1. 가열 패드, 광원, 마취 관 및 코 콘을 포함하여 10 % 표백제로 수술 영역의 모든 표면을 닦아내고 수술 용 수술과 가까운 수술 용 스위트 룸의 다른 부분을 닦아 냅니다.
   2. 무균 수술 부위에는 멸균 드레이프, 광원, 마취 튜브 및 노세콘, 인슐린 주사기가있는 청소 된 가열 패드를 놓고 주사기, 부피바카인, 인공 눈물, 멸균 식염수, 2 x 2" 멸균 거즈 스폰지, 4 x 4" 멸균 거즈, 헤모정 거즈가 0.5 - 1cm2 개, 가위, 집게, hemostat, 4-0 vicryl 봉합사, 테이퍼 바늘, 50 mled 에 50 mled.
   3. 얼음에 저장된 준비된 종양 세포를 위한 공간이 이 공간에 있는지 확인하십시오.
   4. 수술 부위에 인접한 벤치에서 는 두 번째 가열 패드와 멸균 침구가있는 깨끗한 케이지로 회복 영역을 준비하십시오.
      참고: 이 지역은 비드 멸균기와 같은 물품을 보관할 수도 있습니다.

2. 포털 정맥 주입

1. 계획된 주사 1시간 전에, 통증 관리를 위해 0.015 mg/ml buprenorphine의 100 μl으로 8-15 주 세 의 Balb/c 암컷 마우스를 치료하십시오.
   참고: 이러한 주사 프로토콜은 변형에 대한 변화에 적합한 세포주를 사용하여 모든 연령대에 여성 또는 남성 마우스의 변형에 적용될 수 있다.
2. 셀 라인 또는 종양 절제에 대한 프로토콜에 기초하여 주사를 위한 종양 세포를 준비합니다. 뮤린 병원균의 존재에 대한 투여 전에 모든 종양 세포주를 테스트하여 동물 식민지에 그러한 병원체를 도입할 위험을 줄입니다.
   1. D2A1, D2.OR 및 4T1 종양 세포를 포함하는 syngeneic Balb/c 종양 세포주를 위해, 세포를 주사 3일 전에 10cm 조직 배양판으로 해동하여 다음 날 세포가 ~ 90-100% 인 경우.
   2. 종양 세포 다음 1일 후 1x 인산완충식염(PBS)으로 세포를 한 번 해동하고, 37°C에서 0.05% 트립신2ml을 5분 동안 사용하여 컨실릭 종양 세포를 트립시화한다. 완전한 미디어 8ml(DMEM 고혈당, 10% 태아 소 세럼, 2mM L-글루타민, 1x 페니실린/스트렙토마이신)를 넣고 1:10을 10ml의 완전한 미디어가 있는 신선한 10cm 접시에 넣습니다.
   3. 주사 당일, 1x PBS로 한 번 세포를 씻고 위에서 설명한 대로 트립시니즈합니다.
   4. 완전한 매체 8 ml에서 트립시화 된 세포를 다시 중단하고 1,500 x g에서 5 분 동안 회전하고 미디어를 제거하고 5 ml 1x PBS로 다시 중단하십시오.
   5. 생존 가능성 평가를 위해 트라이판 블루 제외를 사용하여 혈종계에 세포를 계산합니다. 미리 결정된 농도 및 부피에서 1x PBS에서 주입을 위한 세포를 재중단합니다.
      참고: 5 - 10 μl은 더 작은 주사 부피가 간으로 불필요한 손상을 방지하기 때문에 권장됩니다.
   6. 주사 기간 동안 얼음에 세포를 유지합니다. 주사가 완료 된 후, 실험실에 세포의 샘플을 반환하고 생존을 보장하기 위해 1 일 동안 완전한 미디어에 문화권에 배치.
3. 마우스를 마취 하에 2-2.5% 이소플루란(2-클로로-2-(디플루오로메톡시)-1,1,1-트리플루오로 에탄)으로 산소로 전달한다. 가열 패드를 사용하여 체온을 유지합니다.  발가락 핀치에 대한 반응을 평가한 다음 2 - 2.5 %의 이소플루란에서 마취를 유지하여 완전한 마취를 보장하십시오.
   참고: 동물의 호흡 속도를 모니터링하고 시술 전반에 걸쳐 이소플루란 유량을 조정하는 것이 중요합니다.
4. 수술 시 눈의 과도한 건조를 피하기 위해 각 눈에 소량의 인공 눈물이나 수의사 연고를 놓습니다.
5. 마우스를 등 뒤쪽에 두는 복통이 노출되어 있습니다.
6. 두 번째 리브 공간에서 4번째 잉게인 유방 선젖꼭지까지 설치류의 복부 왼쪽에 있는 모발을 제거하여 화학적 증실로 부위를 닦아낸다. 1 -2 분 동안 앉아서 거즈와 H2O로 완전히 제거하십시오. 이 단계는 수많은 수술이 계획되어있는 경우 시간을 절약하기 위해 1 - 2 일 전에 수행 할 수 있습니다.
7. 2 x 2" 멸균 거즈 스폰지 (2 % 클로레시딘에 담근)를 가지고 제모 부위에 마우스를 닦아. 꼬리를 포함한 주변 지역 전체를 살균하여 기기의 세균 오염을 최소화합니다.
8. 알코올 준비 패드로 제모 및 주변 지역을 닦아냅니다.
9. 2% 클로레히시딘과 알코올 단계를 한 번 더 반복하고 최종 클로르헤시딘이 총 3개의 2% 클로르히시딘과 2개의 알코올 준비 패드 세차재를 닦아 냅니다. 화학 물질이 내부 장기에 클로렉시딘을 얻기 않도록 수술 부위 주위에 떨어지는되지 않도록 최종 클로르헤시딘 닦아 마십시오.
   참고: 피부에 다량의 클로르헨시딘과 알코올을 적용하면 체온이 현저할 수 있습니다. 2.7-2.9 단계 동안 초과 볼륨으로 닦지 마십시오. 가열 패드로 체온을 유지합니다.
10. 멸균 장갑과 멸균 블레이드를 사용하여 마우스 왼쪽의 중앙분리대와 처진 평면 사이의 피부에 1인치 절개를 하고 갈비뼈 바로 아래에서 시작하여 네 번째 잉게인 유방 선의 평면 바로 위에 끝납니다.
11. 자동 또는 비드 살균 가위와 집게를 사용하여, 회막에 유사한 1 인치 절개를합니다. 유방 지방 패드로 절단하지 말고 내장, 간 또는 횡격막을 절단하지 않도록하십시오.
12. 마우스 왼쪽에 멸균식 식염수에 담근 4 x 4" 거즈 패드를 놓고, 절개가 만들어진 곳, 내부 장기는 거즈에 배치될 수 있고 주변 피부 또는 수술 부위와 접촉하지 않을 수 있습니다.
13. 종양 세포가 마우스의 준비 중에 정착할 때 여러 번 위아래로 파이프팅하여 종양 세포를 준비합니다. 종양 세포를 가진 25 μl 착탈식 바늘 주사기 및 32 게이지 바늘을 준비합니다. 종양 세포가 바늘의 끝에 있고 플런저가 주입을 위한 적당한 양에 있기 전까지 주사기를 밀어; 기포의 주입을 피하십시오.
14. 멸균 알코올 패드로 바늘의 외부를 닦아 외부 종양 세포를 제거합니다. 바늘 스틱을 피하기 위해주의하십시오.
15. 피부와 하원 안감을 포함한 절개의 중앙측을 집게옆으로 잡고 멸균 면봉을 사용하여 크고 작은 내장을 조심스럽게 꺼내멸식 식염수에 담근 멸균 거즈에 놓습니다. 포털 정맥이 시각화될 때까지 크고 작은 내장을 꺼냅니다.
16. 내부 수분과 멸균을 유지하기 위해 식염수 에 젖은 거즈내부 장기를 덮습니다.
17. 멸균 장갑을 끼고 있는 도우미를 데고, 멸균 면이 기울어진 면봉으로 살짝 젖은 식염수에 싸인 내장을 잡고 포털 정맥을 완전히 드러냅니다. 추가적으로, 절개의 중앙측에 조직을 따로 붙이기 위해 자동 분리된 헤모스타또는 집게를 사용해야 할 수도 있다.
18. 종양 세포가 로드된 바늘을 3-5mm의 문맥에 넣고 간 아래 10mm ~ 정맥에 5°를 넣고 벨이 위를 향하도록 한다. 천천히 종양 세포를 포함하는 전체 부피를 주입. 정맥에서 종양 세포의 역류를 피하기 위해 몇 초 동안 바늘 머리를 지나 혈액을 흐르도록 허용하십시오. 주입 하는 동안 정맥에서 바늘이동을 최소화. 다시, 바늘 스틱을 피하기 위해주의 사용.
    참고: 포탈 정맥의 시각화는 배율 없이 수행되지만, 바람직한 경우 스테레오 현미경이 사용될 수 있다.
19. 동시에 압력정맥에 멸균 면 팁 어플리케이터를 배치하는 동안 바늘을 제거합니다. 도우미는 여전히 정맥에 주입 부위위에 0.5 - 1 cm2 혈전성 거즈의 한 조각을 배치 옆으로 내장을 들고.
    참고: 혈전성 분말은 또한 프로토콜에 있는 이 단계를 위해 시도되었지만 주사 다음 정맥 혈액 손실을 중지에 효과적이지 않았습니다.
20. 멸균 면 팁 어플리케이터의 압력으로 주입 부위에 혈전거를 5분 간 누울 수 있습니다.
21. 혈전성 거즈를 조심스럽게 들어 올려 정맥의 폐쇄를 평가하고, 거즈가 주변 조직에 달라붙는 경우 소량의 멸균 식염수를 사용하여 거즈를 담그고 들어올릴 수 있습니다.
22. 이 때 혈액 손실이 발생하는 경우, 추가 5 분 동안 압력과 사이트에 혈전 성 거즈의 추가 조각을 배치합니다. 혈류가 완전히 중단되면 마우스에서 거즈를 제거하십시오.
    참고: 수술 중 혈액 손실을 신중하게 평가해야 하며 총 허용된 혈액 손실 량이 충족되거나 초과되는 경우(조사자의 기관 검토 위원회에 대한 규제 표준 수술 절차에 따라) 마우스는 심장 관류에 의한 마취 하에 안락사되어야 합니다.
23. 주사 부위가 그대로 간주되면 주입 부위를 떠나지 않고 내부 장기를 복강으로 부드럽게 다시 배치하십시오.
24. 간결한 연속 또는 중단된 봉합사 패턴을 사용하여 멸균 4-0 비릴 봉합사 및 테이퍼 바늘로 피부를 봉합합니다. 일반적으로 절개를 닫는 경우 10-15 봉합사가 필요합니다.
25. 인슐린 주사기를 사용하여 국소 통증 관리를 위한 절개 부위를 따라 부피바카인(5 mg/ml)의 100 μl을 주입한다. 수분 공급을 위해 26 게이지 바늘이 있는 1ml 주사기를 사용하여 멸균 식염수 0.5 ml를 피하시주입합니다. 수술은 완료하는 데 15 - 25 분이 소요됩니다.
26. 수술 내내 멸균 상태를 유지하려면 장갑을 낀 손을 포함하여 마우스와 접촉하는 모든 도구와 재료가 접촉하기 전에 적절하게 청소되도록 하십시오. 가능한 경우 멸균 재료와 장갑을 사용하거나 70 % 에탄올 용액 또는 10 % 표백솔루션을 최소한으로 사용하여 청소하십시오.
27. 단일 세션에 여러 수술이 계획되면 신선한 멸균 드레이프, 인슐린 주사기, 1ml 주사기, 멸균 식염수, 2 x 2"멸균 거즈 스폰지, 4 x 4 "멸균 거즈, 혈성 거즈가 0.5 - 1cm2 개, 4-0 vicryl sutures와 함께 초기 수술 영역을 리메이크합니다. 비드 살균 가위, 집게, 수술 사이에 hemostat 및 재사용 하기 전에 적절 하 게 냉각 할 수 있도록.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery