Overview
Este vídeo descreve um procedimento cirúrgico para entregar células tumorais mamárias ao fígado murino através da injeção de veia portal. Este modelo permite a investigação de estágios tardios de metástase hepática.
Protocol
1. Preparação da Área Cirúrgica e Instrumentos
- Prepare a tesoura, fórceps e hemostat por autoclaving a 124 °C por 30 min, 1 - 2 dias antes das cirurgias planejadas. Certifique-se de acesso a roupas de cama autoclavadas ou estéreis, gaiolas e alimentos para recuperação pós-cirúrgica.
- Prepare uma área cirúrgica asséptica, de preferência em uma coifa de fluxo laminar.
- Limpe todas as superfícies da área cirúrgica com 10% de alvejante, incluindo a almofada de aquecimento, fonte de luz, tubos de anestesia e cone de nariz, e qualquer outra parte da suíte cirúrgica que estará próxima ao procedimento cirúrgico enquanto estiver sendo realizada.
- Na área cirúrgica asséptica, coloque a almofada de aquecimento limpa com cortina estéril, fonte de luz, tubos de anestesia e nariz, seringas de insulina, seringas de 1 ml, bupivacaína, lágrimas artificiais, soro fisiológico estéril, esponjas de gaze estéril de 2 x 2", gaze estéril de 4 x 4", gaze hemostática cortada em 0,5 - 1 cm2 pedaços, tesoura, fórceps, hemostat, suturas vicríl 4-0 com agulha de taper, e 50 ml 2% cloroxidina gluconato em um recipiente autoclavado.
- Certifique-se de que há espaço neste espaço para células tumorais preparadas armazenadas no gelo.
- No banco adjacente à área cirúrgica, prepare a área de recuperação com uma segunda almofada de aquecimento e gaiolas limpas com roupa de cama estéril.
NOTA: Esta área também pode abrigar itens como um esterilizador de contas.
2. Injeção de Veia portal
- Uma hora antes das injeções planejadas, trate camundongos fêmeas Balb/c de 8 a 15 semanas com 100 μl de 0,015 mg/ml buprenorfina, subcutânea, para o tratamento da dor.
NOTA: Este protocolo de injeção pode ser aplicado a qualquer cepa de camundongos femininos ou masculinos em qualquer idade, usando as linhas celulares apropriadas para alterações na cepa. - Prepare as células tumorais para injeção com base em protocolos para a linha celular ou explantação tumoral de escolha. Teste todas as linhas de células tumorais antes da administração para a presença de patógenos murinas para reduzir o risco de introduzir tais patógenos na colônia animal.
- Para as células tumorais sinagenic Balb/c, incluindo células tumorais D2A1, D2.OR e 4T1, descongelam as células em uma placa de cultura tecidual de 10 cm 3 dias antes da injeção, de tal forma que as células do dia seguinte estejam em ~ 90 - 100% de confluência.
- 1 dia após o degelo das células tumorais uma vez com 1x de salina tamponada de fosfato (PBS) e trypsinize as células tumorais confluentes usando 2 ml de trippsina de 0,05% a 37 °C por 5 min. Adicione 8 ml de mídia completa (DMEM alta glicose, 10% soro bovino fetal, 2 mM L-glutamina e 1x penicilina/estreptomicina) e passagem 1:10 em um prato fresco de 10 cm com 10 ml de mídia completa.
- No dia das injeções, lave as células uma vez com 1x PBS e tentepsinizar conforme descrito acima.
- Resuspend células experimentadas em 8 ml de mídia completa, gire por 5 min a 1.500 x g, remova a mídia e resuspende em 5 ml 1x PBS.
- Conte células em um hemócito usando exclusão azul trypan para avaliação de viabilidade. Células resuspend para injeção em 1x PBS em uma concentração e volume pré-determinados.
NOTA: Recomenda-se 5 a 10 μl, pois volumes menores de injeção evitam danos desnecessários ao fígado. - Mantenha as células no gelo durante as injeções. Após a conclusão das injeções, devolva uma amostra de células ao laboratório e coloque em cultura em mídia completa por 1 dia para garantir a viabilidade.
- Coloque o rato sob anestesia com 2 - 2,5% de isoflurano (2-cloro-2-(difluorometoxy)-1,1,1-trifluoro-etano) fornecido em oxigênio. Mantenha a temperatura corporal usando a almofada de aquecimento. Certifique-se de anestesia completa avaliando uma reação a uma pitada de dedo do dedo do dedo e, em seguida, manter a anestesia em 2 - 2,5% de isoflurane.
NOTA: É importante monitorar a taxa de respiração dos animais e ajustar a taxa de fluxo isoflurane de acordo com todo o procedimento. - Coloque uma pequena quantidade de lágrimas artificiais ou pomada veterinária sobre cada olho para evitar a secagem excessiva dos olhos durante o procedimento cirúrgico.
- Coloque o mouse em uma posição supina, em suas costas com o abdômen exposto.
- Remova o cabelo no lado esquerdo ventral do roedor do espaço da segunda costela até o 4º mamilo da glândula mamária inguinal, limpando a área com depilatório químico. Deixe que o depilatório se sente por 1 - 2 min e depois remova completamente com gaze e H2O. Esta etapa pode ser feita com 1 a 2 dias de antecedência para economizar tempo se inúmeras cirurgias forem planejadas.
- Pegue uma esponja de gaze estéril de 2 x 2" (encharcada em 2% de clorexidina) e limpe o mouse no local da depilação. Esterilize toda a área circundante, incluindo a cauda, para minimizar a contaminação bacteriana dos instrumentos.
- Limpe o local da depilação e área circundante para baixo com uma almofada de preparação para álcool.
- Repita 2% de clorhexidina e álcool passos mais uma vez e finalize com uma limpeza de clorexidina final para um total de três 2% de clorexidina e duas lavagens de almofada de preparação de álcool. Faça a limpeza final da Clorexidina de tal forma que o produto químico não esteja pingando ao redor do local cirúrgico para evitar a clorexidina em órgãos internos.
NOTA: A aplicação de grandes quantidades de clorexidina e álcool na pele e pelos circundantes pode resultar em uma queda significativa na temperatura corporal. Não limpe com volume excessivo durante as etapas 2.7-2.9. Mantenha a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento. - Usando luvas estéreis e um bisturi esterilizado com lâmina estéril, faça uma única incisão de 1 polegada na pele entre os planos mediano e sagital do lado esquerdo do mouse, começando logo abaixo das costelas e terminando logo acima do plano da quarta de glândula mamária inguinal.
- Usando tesouras e fórceps esterilizados autoclaved ou contas, faça uma incisão semelhante de 1 polegada no peritônio. Evite cortar a almofada de gordura mamária e certifique-se de não cortar os intestinos, fígado ou diafragma.
- Coloque uma almofada de gaze de 4 x 4" encharcada em soro fisiológico estéril no lado esquerdo do mouse, onde a incisão foi feita, de tal forma que órgãos internos possam ser colocados na gaze e não entrar em contato com a pele circundante ou área cirúrgica.
- Prepare as células tumorais pipetting para cima e para baixo várias vezes, pois as células tumorais se instalam durante a preparação do camundongo. Prepare uma seringa de agulha removível de 25 μl e agulha de calibre 32 com células tumorais. Empurre a seringa até que as células tumorais estejam na ponta da agulha e o êmbolo esteja no volume apropriado para injeção; evite a injeção de bolhas de ar.
- Limpe o lado de fora da agulha com uma almofada de álcool estéril para remover quaisquer células tumorais externas. Tenha cuidado para evitar agulhas.
- Segure o lado mediano da incisão, incluindo a pele e o revestimento peritoneal, de lado com os fórceps e use um cotonete estéril para puxar cuidadosamente os intestinos grosso e pequeno para fora, colocando-os sobre a gaze estéril encharcada em soro fisiológico estéril. Puxe intestinos grandes e pequenos até que a veia portal seja visualizada.
- Cubra os órgãos internos na gaze salina encharcada para manter a umidade interna e a esterilidade.
- Tenha um assistente, também usando luvas estéreis, segure os intestinos envoltos na gaze salina encharcada suavemente fora do caminho com um cotonete de algodão estéril para revelar completamente a veia portal. Além disso, pode ser necessário usar o hemostat ou fórceps autoclavados para manter o tecido de lado no lado mediano da incisão.
- Insira a agulha carregada com células tumorais ~ 3 - 5 mm na veia portal ~ 10 mm abaixo do fígado em um ângulo < 5° para a veia, com chanfrado voltado para cima. Injete lentamente o volume total contendo células tumorais. Deixe o sangue passar pela cabeça da agulha por vários segundos para evitar o fluxo de volta das células tumorais para fora da veia. Minimize o movimento da agulha na veia durante a injeção. Novamente, tenha cuidado para evitar agulhas.
NOTA: A visualização da veia do portal é feita sem ampliação, porém um microscópio estéreo pode ser usado se preferir. - Remova a agulha ao mesmo tempo colocando um aplicador de ponta de algodão estéril na veia com pressão. Com o assistente ainda segurando os intestinos de lado coloque um pedaço de 0,5 - 1 cm2 gaze hemostática sobre o local da injeção na veia.
NOTA: O pó hemostático também foi tentado para esta etapa no protocolo, mas não foi eficaz em parar a perda de sangue venoso após a injeção. - Segure a gaze hemostática no local da injeção com pressão de um aplicador de ponta de algodão estéril por 5 minutos.
- Avalie o fechamento da veia levantando cuidadosamente a gaze hemostática, se a gaze grudar no tecido circundante, uma pequena quantidade de soro fisiológico estéril pode ser usada para absorver e levantar a gaze.
- Se a perda de sangue ocorrer neste momento, coloque um pedaço adicional de gaze hemostática no local com pressão por mais 5 minutos. Quando o fluxo sanguíneo parar completamente, remova a gaze do rato.
NOTA: A perda de sangue durante o procedimento cirúrgico deve ser cuidadosamente avaliada e se o volume total permitido de perda de sangue for atendido ou excedido (com base em procedimentos operacionais padrão regulatórios para os conselhos de revisão institucionais do investigador), o camundongo deve ser eutanizado enquanto sob anestesia por perfusão cardíaca. - Uma vez que o local da injeção seja considerado intacto, sem sangue saindo do local da injeção, coloque os órgãos internos suavemente de volta à cavidade abdominal.
- Sutura o revestimento peritoneal e, em seguida, a pele com sutura vicríl estéril 4-0 e agulha de taper usando um simples padrão de sutura contínua ou interrompida. Normalmente, fechar a incisão requer 10-15 suturas.
- Injete 100 μl de bupivacaína (5 mg/ml) ao longo do local de incisão para o manejo local da dor usando uma seringa de insulina. Injete 0,5 ml de soro fisiológico estéril subcutâneamente usando uma seringa de 1 ml com agulha de calibre 26 para hidratação. As cirurgias demoram de 15 a 25 minutos para serem concluídas.
- Para manter as condições estéreis durante toda a cirurgia, certifique-se de que todas as ferramentas e materiais que entram em contato com o rato, incluindo as mãos enluvadas, sejam limpos adequadamente antes do contato. Sempre que possível, use materiais e luvas estéreis, ou utilize minimamente uma solução de 70% de etanol ou 10% solução de alvejante para limpar.
- Se várias cirurgias forem planejadas para uma única sessão, refaça a área cirúrgica inicial com cortina estéril fresca, seringas de insulina, seringas de 1 ml, soro fisiológico estéril, esponjas de gaze estéril de 2 x 2", gaze estéril de 4 x 4", gaze hemostática cortada em 0,5 - 1 cm2 peças, suturas vicríl 4-0 com agulha de fita adesiva, e 2% cloroxidina. Esterilizar a tesoura, fórceps e hemostat entre as cirurgias e permitir esfriar adequadamente antes de reutilizar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | 309597 |
Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |