Abstract
Митоз имеет решающее значение для роста и дифференцировки организменном. Процесс является очень динамичным и требует упорядоченный событий для достижения надлежащего конденсацию хроматина, микротрубочек кинетохор привязанность, расхождение хромосом и цитокинез в небольшой промежуток времени. Ошибки в деликатном процессе может привести к болезни человека, в том числе врожденных дефектов и рака. Традиционные подходы, расследующие болезненных состояний митотический человека часто полагаются на системах клеточных культур, которые испытывают недостаток естественной физиологии и развития / контекст тканеспецифичную выгодный при изучении болезней человека. Этот протокол позволяет преодолеть многие препятствия, предоставляя способ визуализации с высоким разрешением, динамики хромосом в системе позвоночных, данио. Этот протокол будет подробно подход , который может быть использован для получения динамических изображений делящихся клеток, которые включают в себя: в пробирке транскрипции, данио разведения / сбора, эмбрион вложения и покадровой обработки изображений. Оптимизация и MODIFications этого протокола также исследуются. Использование H2A.F / Z-EGFP (маркирует хроматин) и mCherry-CAAX (метки клеточных мембран) мРНК-впрыскивается эмбрионов, митоз в АВ дикого типа, auroraB hi1045 и esco2 hi2865 мутанта данио визуализируется. Высокое разрешение изображения в прямом эфире в данио позволяет наблюдать множественные митозы статистически количественно митотические дефекты и сроки митоза. Кроме того, наблюдается наблюдение качественных аспектов , которые определяют неправильные процессы митоза (т.е. congression дефекты, missegregation хромосом и т.д.) и результаты неправильного хромосомные (т.е. анеуплоидии, полиплоидия, микроядер и т.д.). Этот анализ может быть применен к наблюдению тканевой дифференцировки / развития и поддается использованию мутанта данио рерио и фармакологических агентов. Визуализация как дефекты в митозе привести к раку расстройствами и нарушениями развития будет в значительной степениспособствовать более глубокому пониманию патогенеза заболевания.
Introduction
Митоз является критическим ячеистый основной процесс роста, дифференцировки и регенерации в живом организме. После точной подготовки и репликации ДНК в интерфазе, клетка грунтуется разделить. Первая фаза митоза, профазы, инициируется активацией циклин B / Cdk1. Профаза характеризуется конденсацией хроматина материала в хромосомы. пробой ядерной оболочки происходит при переходе между профазе и прометафазе. В прометафазе, Центросомы, Нуклеирующий центр для формирования веретена, начинают мигрировать к противоположным полюсам при расширении микротрубочки в поисках прикрепления кинетохор. После присоединения, преобразования к конечным прикомандирован микротрубочек и натяжной силы ориентировать хромосомы , образующие метафазного пластину 1. Если все хромосомы прикреплены правильно, узел шпинделя контрольной точки выполняется, Cohesin кольца, удерживающие сестринские хроматиды вместе расщепляются, и микротрубочки сократить тянуть сеструхроматиды к полюсам во время анафазы 2,3. На заключительном этапе, телофаза, включает в себя удлинение клетки и реформирования ядерной оболочки вокруг двух новых ядер. Цитокинез завершает процесс разделения путем разделения цитоплазмы двух новых дочерних клеток 4-6. Изменение ключевых митотических путей (т.е. шпинделя сборки контрольно - пропускном пункте, центросомы дублирования, сестринских хроматид сцепления и др.) Может привести к метафазе аресту, missegregation хромосом и геномной нестабильности 7-10. В конечном счете, дефекты путей распространения контрольного митоза могут вызвать нарушения развития и рака, что вызывает необходимость визуализации митоза и его дефекты в живом, позвоночное, многоклеточного организма 10-16.
Эмбрионы рыбок данио служить отличным модельного организма для живого изображения благодаря прозрачной ткани, легкость микроинъекции, и быстрое развитие. Использование данио, общая цель этой рукописи являетсяописывают способ живой 5D (размеры X, Y, Z, время и длина волны) визуализации митоза 17 (рис 1C). Использование мутанта данио дефектного в различных митотических путей демонстрируют последствия таких дефектов. Для этого протокола, были выбраны Aurora B и Esco2 мутанты, чтобы проиллюстрировать эти дефекты. Aurora B является киназа, которая является частью хромосомы пассажирского комплекса (КПК), участвующих в формировании веретена и прикрепления микротрубочек. Он также необходим для формирования расщепления борозды в цитокинезе 18,19. В данио, дефицит Aurora B ведет к дефектам по бороздам индукции, цитокинеза и сегрегации хромосом 20. Esco2, с другой стороны, является ацетилтрансферазы , что имеет важное значение для сестринских хроматид когезии 21,22. Он ацетилирует Cohesin на SMC3 части кольца , таким образом , стабилизирующего Cohesin для обеспечения правильной сегрегации хромосом в метафазе-анафазе перехода 23. Потеря Esco2 в данио приводит к спromosome missegregation, преждевременные сестра разделения хроматид, геномная нестабильность и p53-зависимые и независимые апоптозом 24,25. Благодаря наличию, auroraB hi1045 и esco2 hi2865 мутанта данио (далее именуемые как aurB м / м и esco2 м / м, соответственно) будет использоваться для иллюстрации этого метода 25-27.
Муфта конфокальной микроскопии с флуоресцентно меченых клеток машин позволило исследователям визуализировать хроматина и клеточной мембраны динамика во время митоза 25,28,29. Флуоресцентные меченных гистонов исторически использовались для визуализации хроматина. Гистоны ядерные белки , состоящие из четырех различных пар (H2A, H2B, H3 и H4), которые ответственны за структуры нуклеосомы , которые сочиняет хромосомы 30. В то время как Н2В, возможно, является наиболее часто используемым гистонов для флуоресцентных белков вмышь и культура клеток, использование Гистона 2А, Семейный Z (H2A.F / Z) доказал , хорошо для использования в данио 31,32. Конканавалин А и казеин - киназы 1-гамма, например, локализовать на клеточной мембране , и как было показано ранее эффективными в визуализацией через клеточную мембрану в морских ежей и Drosophila 33,34. Другие исследования показали , что CAAX флуоресцентно меченый белок этикетки клеточную мембрану и была успешной в данио 31. CAAX является мотив, который признан посттрансляционными модифицирующих ферментов, таких как farnesyltransferases и geranylgeranyltransferases. Изменения этими ферментами вызывают белки , чтобы стать ассоциированный с мембранами, таким образом маркируя клеточную мембрану 35.
В связи с предшествующим уровнем использования в данио рерио, этот протокол решили использовать H2A.F / Z и CAAX маркировать хроматин и клеточную мембрану. Применение этого метода позволит исследователя контролировать митоза на уровне отдельных клеток, чтобы наблюдать отдельные хромосомыдинамика, а также одновременно контролировать несколько клеточных делений, которые могут повлиять на тканевой дифференцировки и развития. В данной статье основное внимание будет уделено визуализации динамики сегрегации хромосом во время митоза на уровне отдельных клеток. В этой рукописи, способность наблюдать несколько митотических делений, вычислить время деления, и расшифровать митотического фенотипы будут проиллюстрированы и обсуждены. Используя эти параметры, физиологически соответствующие данные могут быть собраны и применены к нескольким болезненных состояний, пострадавших от митотических дефектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In Vitro Транскрипция
- Линеаризуем шт.2-H2A.F / Z-EGFP и / или векторы шт.2-mCherry-CAAX ограничением NotI фермента переварить 31. Использование РНК в пробирке транскрипции набора, генерировать 5 'блокированы мРНК продуктов из каждого шаблона, в соответствии с протоколом производителя.
- Очищают блокированы мРНК с использованием набора для очистки. Следуйте инструкциям производителя. Элюции с РНКазы H 2 O.
- Определить концентрацию РНК по оптической плотности при длине волны 260 нм с использованием спектрофотометра. (OD 260 х разбавление х 40 мкг / мл).
- Развести РНК до 100 нг / мкл для каждого H2A.F / Z-EGFP и mCherry-CAAX с РНКазы H 2 O. Если концентрация РНК является слишком низкой, флуоресценция будет уменьшена или отсутствует. Ярче образцы будут уменьшить беспокойство по поводу фототоксичности и фотообесцвечивания. С другой стороны, слишком много РНК могут быть токсичными и / или вызывают от целевых эффектов.
Примечание: Храните оставшиесяочищенной мРНК в -80 ° C морозильнике.
2. рерио Разведение, эмбрионов и мРНК Инъекции 36-38
- Собрать селекционных резервуары с барьером для отделения танка на две области и заполнить каждую племенную бак с системой аквакультура воды, используемой в данио объекте.
- Для того, чтобы предотвратить преждевременную размножение, место два мужских рыбы с одной стороны барьера и двух женщин рыбы на другой стороне ночь перед разведением.
- На следующий день, растопить предварительно приготовленной смеси мРНК на льду. Замените воду в селекционных резервуарах со свежей водой системы аквакультуры и устранения барьеров. Сразу после того, как барьеры, вытягиваются, согреть инъекции плесени до 28,5 ° C и установить оборудование для микроинъекции.
Примечание: Для получения информации о шприцформ, пожалуйста , обратитесь к Герлах 36. - Собирать яйца каждые 10 - 15 мин, используя ситечко и промыть яйца в чистую 100 х 15 мм чашки Петри с E3 Синий (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4, 10 -5% Метиленовый синий). E3 Синий используется для предотвращения роста грибов и обеспечить надлежащее развитие личинок рыб. Для получения дополнительной информации о спаривании и сбора эмбрионов, относятся к Герлах 36 и Porazinkski 37.
- Вставить одноклеточный поставил эмбрионов в подогретом литьевой пресс - формы и инъекции РНК в желток в необходимом количестве эмбрионов (Рис . 1А) Счет для естественного эмбриональной смерти и неоплодотворенных эмбрионов, выполняя эмбриональные инъекции на 15% больше, чем эмбрионов, необходимых для проведения эксперимента. Для получения дополнительной информации о микроинъекции эмбрионов данио, пожалуйста , обратитесь к Герлах 36 и Porazinkski 37.
Примечание: При первом использовании мРНК, провести анализ доза-кривой для определения оптимальной дозы для флуоресценции и жизнеспособности (определяется как отсутствие грубых пороков развития до 5 DPF) перед выполнением обработки изображений 5D. 150 - 200 нг / мклвводили в эмбрионы часто оптимальная концентрация, поэтому она является хорошей отправной точкой для конечной концентрации. - Осторожно извлечь инъецированные эмбрионы из пресс-формы с использованием модифицированного 9 "стеклянной пипетки Пастера. Чтобы изменить пипетку, растопить конец, используя горелку, пока она не образует шар.
- Поместите инъекционные эмбрионов в 100 х 15 мм чашки Петри в Е3 Синий и дом в 28,5 ° С инкубатор.
- Шесть часов после инъекции, удалить любые мертвые или неоплодотворенные эмбрионов из пластин и добавить чистую E3 Blue. Дом эмбрионы при 28,5 ° C.
3. Подготовка и внедрение Живого эмбрионов данио рерио для визуализации (рис 1B)
- Два часа до того изображения, экран инъекционные эмбрионов для GFP с помощью флуоресцентного микроскопа рассекает. Поместите ярко-зеленые GFP-экспрессирующих эмбрионов в новом 100 х 15 мм чашки Петри с E3 Blue.
- Кипение в исходный раствор 1% агарозном низкой расплава путем добавления 1 г низкой расплава агарозы в 100 мл E3 синий, После того, как с использованием агарозы, покрывают колбу с алюминиевой фольгой. Исходный раствор остается полезным в течение одного месяца.
- Аликвоты 3 мл расплавленным агаром в культуральную пробирку 17 х 100 мм. Хранить агарозы в тепле не помещая в культуральную пробирку С водяной бане при 42 ° до готовности к использованию. Готовят 15 мМ раствора Tricaine в деионизированной воде , чтобы обезболить данио эмбрионов 36.
Примечание: Если в визуализации более ранних моментов времени желательно, концентрация агара может быть уменьшена по цене от 0,3% 39. - Принесите 15 мМ Tricaine, экранированных эмбрионов, низкий агарозы расплава, E3 синего и 35 мм стекло покровное дном культуры блюдо к рассечение световым микроскопом. Осторожно удалите хориона эмбриона с # 5 пинцетом. Делайте это в течение трех эмбрионов.
- Поместите dechorionated эмбрионов в отдельном контейнере, чтобы быть под наркозом. Крышка покровное нижней тарелки часто используется для этой цели. С помощью пипетки передачи, добавить три капли (примерно 150 мкл)15 мМ Tricaine к блюду 5 мл E3 синего (если не используя крышку покровного нижней тарелки), или до тех пор, эмбрионы были достаточно наркозом. Кроме того, добавьте 3-4 капли (около 150 - 200 мкл) 15 мМ раствора Tricaine в 1% агарозном расплавленным трубки.
- Использование P200 пипетки с 1 см кончика пипетки отрезан; передать наркозом эмбрионов на покровное дном блюдо. Удалите излишки E3 Синий: решение Tricaine.
- Медленно добавляют 5 - 10 мкл легкоплавкой агарозы: Tricaine раствора над эмбрионами, сохраняя каждую каплю отдельного, чтобы гарантировать, что эмбрионы не случайно дрейфовать близко друг к другу.
Предупреждение: Если агарозном слишком тепло, это может повредить зародыш. Хорошая температура для поддержания агаре при 42 ° С. - Использование 21 G 1 ½ иглы, мягко ориентировать эмбриона в агарозном в нужное положение. При использовании инвертированного микроскопа для покадровой обработки изображений, сориентировать область интереса (ROI) как можно ближе к покровным как possibле.
Примечание: Для общего назначения, хвостовой области предлагает легкость ориентации и ясности в связи с относительно тонкой ткани (фиг.1А). Другие ткани, такие как эпителиальный слой , окружающий желток и заусениц складками, могут быть использованы 28,29. Эти ткани предлагают большую ясность, однако эти регионы имеют толщину всего несколько слоев клеток. Для целей настоящего протокола, полезно для образа хвостовой области, чтобы приобрести как можно больше клеточных делений, как это возможно. - Разрешить несколько минут для частичного затвердевания агара. Используйте иглу распадаться небольшой кусочек агара, чтобы проверить его затвердевание. Когда часть агара может быть отстранилась от падения, переходите к следующему шагу.
- Покройте всю покровное с низким агара расплава образуя купол над вложенными эмбрионов. Дайте агар затвердеть перед перемещением антенны для конфокальной микроскопии (рис 1А).
- Во время агара затвердевание процесс (занимает около 10 мин), подготовить 3 мл ое E3 синий раствор с пятью каплями (примерно 250 мкл) 15 мМ Tricaine необходимо установить над вложенными эмбрионов во время формирования изображения.
4. 5D конфокальной микроскопии в реальном маштабе времени эмбрионов данио рерио 40,41
ПРИМЕЧАНИЕ: См Ariga 40 и О'Брайен 41 Подробную информацию о том , как выполнить визуализацию 5D с использованием других систем конфокальной. Для Z-интервала, Z-стек, Z-глубины, интервал времени, и определения 5D рис 1С.
- Откройте программу обработки изображений и установите микроскоп на 60X NA 1.4 объектива. Нанесите иммерсионное масло на объектив и место культуры блюдо в держатель слайдов на столик микроскопа. С помощью контроллера оси, центр зародыш интерес выше объектива и принести объектив вверх, чтобы встретить культуры блюдо.
- Нажмите на иконку глаза кусок и перейти к GFP фильтр на микроскопе. Фокус на ROI. Сосредоточив внимание на ткани ближе всего к покровным будет Offer лучших результатов визуализации.
- Снять блокировку. Выберите каналы и GFP mCherry (предустановленные длины волн в программном обеспечении) и установить линию усреднения вариант к нормальному.
- Используйте "Элементы управления View / Приобретение / A1 Scan Area" команду, чтобы открыть инструмент A1 Scan Area.
- Начать сканирование. С помощью оси-контроллера, установите эмбрион так, чтобы область сканирования заполнена, как большая часть данио, насколько это возможно. Мощность лазера не должна быть оптимальной в данный момент. Опустите мощность лазера, чтобы избежать ненужных фотообесцвечивания.
- С помощью "Элементы управления View / Приобретение / приобретение ND" команду, чтобы открыть панель управления приобретением ND.
- Начать сканирование, чтобы установить параметры Z-стека. Установите Z-стека верхний предел, когда клетки не в фокусе, и нижний предел, где клетки больше не будут видны. Разрешить для пространства 3 мкм над образцом для роста и движения клеток, который может расширяться в области визуализации. Z-стек для фигуры, показанные в этом протокол охватывали Z-глубину 40 мкм в зародышевом хвоста.
- Установите Z-интервал размера шага до 2 мкм. В среднем, клетка диаметром 10 мкм; поэтому 2 мкм будет производить пять интервалов данных изображений, которые будут проанализированы для каждой ячейки.
Примечание: Глубина изображения, которые могут быть приобретены в зависимости от Z интервала. Разрешение Z приносится в жертву, чтобы получить общую глубину в Z размерности, чтобы изображения, как много клеток, подвергающихся митоза, насколько это возможно (большой Z-глубина). Обратное верно, то в том, что за счет уменьшения размера шага, разрешение Z достигается, в то время как глубина Z приносится в жертву (небольшой Z-глубина). - Регулировка мощности лазера изображения, HV, и смещение уровней. Для экспериментов продемонстрировали в этом протоколе, используйте следующую мощность лазера, HV, и смещение уровней, установленных на соответствующих уровнях, соответственно, для канала GFP; 2 - 5, 120 - 140, и от -9 до -11. Для канала mCherry используйте следующую мощность лазера, HV, и смещение уровней, соответственно; 3 - 6, 120 - 140, и от -3 до-8. После того как параметры установлены, отключите сканирование, чтобы предотвратить ненужное лазерное воздействие, которое может вызвать фототоксичности и фотообесцвечивания образца.
- Выберите значок усреднения 2x линии. "Нет усреднения" не производит зернистое изображение в то время как "4x линия усреднения" резко увеличивает время сканирования. Использование 2х линейного усреднения обеспечивает наилучшее качество изображения и время сканирования быстро.
- Выберите нужное значение длительности временной интервал, и время, необходимое для эксперимента. Для подклассов дикого типа, два-минутные интервалы времени в течение 2 часов лучше всего подходит для определения митотического длительности (на рисунках 1, 2, 3А и 3В). Дивизион, активирующие сборки шпинделя контрольной точки в течение более 30 мин являются более подходящими в течение пяти - минутными интервалами на четыре часа, чтобы сохранить флуоресценцию , как показано на рисунке 3C.
- Установите флажок "Сохранить в файл" и введите имя файла для автоматического сохранения файла, как он приобретается. Двойная проверка все рараметры установлены правильно и нажмите кнопку "начать бег".
- После завершения приобретения, чтобы просмотреть файл в трехмерном формате, нажмите на иконку порога громкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 2 демонстрирует способность наблюдать множество клеточных делений , используя широкий вид поля АВ дикого типа данио хвоста. Более семи митоза клетки изображаются в срок 14 мин (Movie 1). В течение двух час времени, конечно, были захвачены в плен более 40 митотических событий. В среднем, наблюдались 50 делящиеся клетки в АВ и 30 делящиеся клетки в Aur В м / м эмбрионов (рис 2В). Для учета количества клеток , изображаемый отношение митотических клеток к числу клеток изображаемых рассчитывалась (фиг.2С). Эти данные свидетельствуют о том, что существует не меньшее количество клеток , идущих через митоз в Aur B м / м эмбрионов (рис 2В) , но меньше количества клеток изображаемого. Возможность приобрести статистически значимое число таких событий, как это поможет в статистической мощности.
Рисунок 3 расширяет эту технику , чтобы включать в себя количественной оценки митотическую длительности. После того, как замедленная сессия приобретается, отдельная ячейка может быть проанализирован на время , проведенное в митозе с адекватным разрешением при помощи функции масштабирования (рисунок 3A, B). Митотическое длительность рассчитывается вручную путем подсчета, сколько временных интервалов занимают одно деление клеток. Число временных интервалов затем умножается на интервал времени между каждым Z-стека. Например, на рисунке 3C, разделение взял 12 интервалов времени и интервал времени между каждым Z-стек составлял 2 мин. Таким образом, с временным разделением каналов для этой ячейки было 24 мин. Среднее AB время дикого типа деления составляет 25 мин и 58 мин для aurB м / м (рис 3B). Длительная с временным разделением каналов, как показано на aurB м / м предполагает , что сборка шпинделя контрольно - пропускной пункт не был удовлетворен из - за ошибочного коровьимtochore вложения 1,2. Присмотревшись на Увеличиваемую у эмбрионов дикого типа, каждая фаза митоза можно выделить (рис 3C, Movie 2). Кроме того, митотические дефекты можно наблюдать в aurB м / м эмбрионе , которые включают митотический и неудачной цитокинез приводит к двуядерных клеток и последующее образование микроядер (рис 3D, фильм 3). Это увеличено анализ показывает митотические дефекты поддерживает увеличенное время деления приобретенную на фигуре 3В.
Различные другие дефекты разнообразны митоза и клеточные судьбы , которые могут встретиться исследуются на рисунке 4; продемонстрировано в esco2 + / м и esco2 м / м эмбрионов. В esco2 + / м эмбриона, ошибочные движения хромосом захвачены и могут быть определены как congression дефектаs. Congression дефекты возникают, когда неправильные вложения микротрубочки сделаны. Эти дефекты будут вызывать отказ хромосом мигрировать в направлении метафазную пластины. Спаренные сестринские хроматиды, в частности, идентифицируемые при мин 20 и 46, которые не congressed к пластине метафазы может быть сначала наблюдается при мин 14. анафазы отделяет сестринские хроматиды, выровненные на метафазы пластины, а также парными сестринских хроматид вправо, наблюдался в минуту 50. Дополнительно, наблюдается возможно образование микроядер , как эти разделенные сестринские хроматиды остаются изолированными вне ядра (T = 50, рис 4A, Movie 4). На фигуре 4В, многополярный деление визуализируется (Видео 5). Многополярного подразделения часто происходят из - за амплификации центросом, но может произойти через другие средства 42. На фигуре 4C, esco2 м / м ячейка первоначально демонстрирует преждевременное сестринских хроматид separatВращение ионов и шпиндель 9,43,44. Еще одна ячейка судьба продемонстрировала в этой панели является анафазе мост , в котором merotelic вложения нерешенным 45,46. Анафазе мост может быть впервые показан в минуту 62. хроматина появляется преждевременно decondense в то время как клетка претерпевает цитокинез. Как происходит цитокинез, борозда расщепление посягает на деконденсированных хромосом и, как это происходит опадение, тянет хроматина материал для формирования анафазы моста (рис 4C, Movie 6). Хотя это и не показано здесь, для того, чтобы количественно оценить клеточные судьбы, запись всех митотических делений в каждом кадре и тип судьбы клеток они демонстрируют. Разделите число клеток в каждой судьбе на общее количество делений, записанных и умножить на 100, чтобы вычислить процент клеток судьбы.
Рисунок 1: Протокол Чертежи Outline. (А) (Б) Схематическое изображение процесса эмбриона вложения. Инъецированные эмбрионы должны быть dechorionated и наркозом. Эмбрионы затем переносят в покровное дном тарелки и избыток Е3 Синий удаляется. Низкий агар расплава используется для создания отдельных куполов, охватывающих каждого эмбриона. Ориентируйте эмбрионы так хвост ближе всего к покровным. Подождите две минуты перед добавлением агар, охватывающих весь покровное. Подождите , пока агар не затвердевает , прежде чем перейти к изображению. (С) Схематическое изображение , чтобы определить термины Z-интервал, Z-Stack, Z-глубины, интервал времени, продолжительность времени и 5D, которые используются в протоколе и обсуждения. Z-интервал определяется как расстояние между каждым изображением в качестве микроскопа перемещается глубже в образец для создания Z-стека. Z-стек все снимки, сделанные черезОбразец в определенном Z-интервала. Расстояние, пройденное в Z-стека определяет Z-глубину. Временной интервал промежуток времени между одним Z-стека и следующего Z-стека, чтобы создать замедленную изображение. Продолжительность времени представляет собой общее количество времени, используемый для изображения. 5D определяется как размеры X, Y, Z, время и флуоресцентное излучение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Замедленная изображений Захват нескольких митотических событий в прямом эфире данио эмбрион. (A) ЗАМЕДЛЕННАЯ кадры из увеличенной из эксперимента в АВ дикого типа, 24 HPF данио показывая несколько митотических событий. Звездочки указывают на семь клеток в митоз. T = время, прошедшее в мин. Шкала бар = 5 мкм. (B) Число митотической CELLS , наблюдаемые в АВ и aurB м / м данио хвостов на 24 часов после оплодотворения. Среднее значение ± ул. DEV., п = 3 эмбрионы / генотип. (C) Отношение делящихся клеток к общему числу клеток в АВ и aurB м / м данио хвосты на 24 часов после оплодотворения. Среднее значение ± ул. DEV., п = 3 эмбрионы / генотип. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Анализ индивидуальной ячейки Захватывает Каждая фаза Митотическое и Митотическое Продолжительность. (А) Клетка , выбранный из широкой области АБ дикого типа, 24 HPF данио эмбриона показано на рисунке 2А. Наблюдается (В) с временным разделением каналов для AB и aurB м / м клетки и рассчитывали из выводя ядерной оболочки гнakdown (NEB) при первом наблюдении конденсированного хроматина в клетке к образованию двух новых дочерних клеток. п = 3 эмбрионы / генотип, п = 66 деления для AB, N = 29 дивизий для aurB м / м, *** р-значение <0,001. (C) AB дикого типа клеток обрезается визуализировать прогрессирование фазы через митоза , т = мин. Шкала бар = 5 мкм. (D) aurB м / м ячейки обрезается для визуализации митоза путем митоза, который включает в себя митотический, что приводит к недостаточности цитокинеза и образованию микроядер. Стрелки указывают на микроядер. T = время, прошедшее в мин. Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4.Single Cell Живая съемка Съемка нескольких митотических дефектов , связанных с хромосомными сегрегация и Отделом митотической Mutant Рерио. (A) обрезанное изображение клетки , подвергающегося congression дефекты в esco2 + / м эмбриона. Тонкая стрелка контролирует левую хромосому, которая вытягивается обратно в метафазе пластину. Толстая стрелка контролирует правую хромосому, которая не тянул обратно в метафазе тарелку и выведенный для формирования микроядер. Двойная стрелка показывает разделение правой хромосомы, который не имел на съезде анафазы. Вставках увеличено видом хромосом, которые не к съезду. Вставки были обрезаны и яркость увеличена для лучшей визуализации. CAAX флуоресценции была удалена, чтобы визуализировать хромосомами более легко. Шкала бар = 5 мкм. (B) обрезанное изображение клетки подвергаются митотический , что приводит к многополярной разделения в esco2 + / М эмбриона. Шкала бар = 5 мкм. (С) обрезанное изображение клетки подвергаются усталости сцепления , что приводит к образованию анафазной моста , увиденные нитевидный вытягивать между двумя ядрами , отмеченных скобками. Шкала бар = 5 мкм. т = время , прошедшее в мин. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1. Несколько деления клеток могут быть визуализированы в широком зрения с данио эмбриона вводят дикого типа (правой кнопкой мыши , чтобы скачать).
Фильм 2. Фазы митоза могут быть легко визуализированы в данио эмбрионов дикого типа (г IGHT нажмите , чтобы загрузить). Разбивка ядерной оболочки выводится нерегулярным появлением ядра и переходит к congression из сестринских хроматид с образованием метафазного пластины , Точная сегрегация происходит и дает две новые дочерние клетки.
Фильм 3. Живая съемка aurB м / м эмбриона показывает хромосомный промахegregation, не удалось цитокинез, и формирование микроядер (правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). Разбивка ядерной оболочки выводится нерегулярным появлением ядра, хромосомы рассеивают к противоположным полюсам не в состоянии сформировать правильную метафазного пластину, и продолжайте вращать по оси , проходящей деление время клетки. Цитокинез не происходит в результате 4н клетки и множественных микроядер.
Фильм 4. Congression дефекты наблюдаются в esco2 + / м эмбриона (правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). Разбивка ядерной оболочки выводится нерегулярным появлением ядра. После того, как формируется метафаза пластина, несколько Индидуальные хромосомы разбросать по обеим сторонам. Один человек хромосома отбросило влево, в конце концов вытащил обратно в метафазе пластины в то время как хромосома справа остается за пределами метафазы пластины и их можно увидеть отделения сестринские хроматиды в начале анафазы. Ячейка обладает пролонгированным временным разделением каналов, но конечной делит с потенциальным формированием микроядер.
Фильм 5. Мультиполярная деление наблюдается в esco2 + / м эмбриона (правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). Разбивка ядерной оболочки выводится нерегулярным появлением ядра , а затем хромосомы сливаются, образуя Y-образный indicativе полюсов 3-шпинделя. Ячейка обладает пролонгированным с временным разделением каналов, но в конечном счете делится на 3 дочерние клетки.
Фильм 6. Преждевременное сестра разделения хроматид и формирования анафазе моста наблюдаются в esco2 м / м эмбриона (правой кнопкой мыши , чтобы загрузить). Разбивка ядерной оболочки выводится нерегулярным появлением ядра , а затем хромосомы разбрасывать по всей клетке не в состоянии сформировать собственно метафаза пластины. Хроматина decondenses до цитокинеза и как клетка делится, создает анафазы мост между двумя клетками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование этого метода позволяет сделать вывод о разбивку ядерной оболочки, образование метафазы пластины микротрубочек-кинетохора вложения и сегрегации сестринских хроматид с образованием двух новых клеток в естественных условиях и в зависимости от времени способом. Способность наблюдать митоза в данио имеет преимущество по сравнению фиксированных образцов и систем культивирования клеток, поскольку клетки изображаемого в естественной физиологии, ткани является прозрачной, которая позволяет флуоресцентные белки, которые будут использоваться, они развиваются относительно быстро, и обработки изображений в заданный промежуток времени могут быть приобретены. Использование взрослых данио для этого протокола ограничено из-за ограниченного Z-глубины, которые могут быть приобретены за счет более толстой ткани, которая не кожу или в глаза. В то время как трансгенные животные, выражающие H2A.F / Z-EGFP и mCherry-CAAX можно было бы использовать для той же цели, универсальности и простоты инъекции мРНК в различные мутанта данио имеет преимущество по сравнению генетических скрещиваний. В ситуациях, когда анализ митоза являетсятребуется в течение трех дней после оплодотворения (DPF) или более поздних эмбрионов, трансгенные животные будут необходимы в связи с периодом полураспада РНК в этой быстро развивающегося организма.
Другие флуоресцентные белки для визуализации митоза поддаются этому протоколу. Например, Н2В-GFP, мРНК является альтернативой H2A.F / Z-EGFP для хроматина, и обеспечивает аналогичную маркировку. Другие флуоресцентные меченные белки, которые могут быть использованы в этой технике включают POM121, centrin, EB1, Hec1 и EMTB, который позволил бы для живого в-зародыша визуализации ядерной оболочки, центриоли, плюс конец микротрубочки, кинетохорах и микротрубочек, соответственно 32,47-51.
Этот протокол имеет несколько ключевых шагов обработки изображений, которые должны быть выполнены для достижения качественных результатов: 1) Убедитесь в том, чтобы оптимизировать качество мРНК и концентрации, чтобы получить самую яркую флуоресценцию и не токсичны, насколько это возможно. Чем больше флуоресценции приведет к снижению воздействия лазерного излучения и, следовательно, менее photobleaцзин и фототоксичности. 2) Эмбрион должен быть полностью под наркозом и безопасно в агаре. Незначительные движения изменит результаты и может разрушить эксперимент. 3) Агар концентрация должна быть подходящей для стадии эмбриона желательно быть отображены. На 24-й ФВЧ и далее, 1% агарозы легкоплавкой подходит. Если изображения в 12 часов после оплодотворения или ранее, 0,3% раствор агарозы следует использовать 39. 4) ROI в зародыше должно быть как можно ближе к покровным, насколько это возможно. Этот шаг не ограничивает один для визуализации хвост. Глаза, кожа, спинной область, желток, и плавник складки являются примерами других областей, которые могут использовать этот протокол.
Время является определяющим фактором, который отделяет этот протокол от визуализации фиксированных эмбрионов или тканей. При настройке Z-стек, Z-интервал, интервал в заданный промежуток времени, и продолжительность времени покадровой, важно иметь в виду контекст эксперимента (рис 1C). Разделение дикого типа клеток, как правило, длится около 25 минут при температуре 24 часов после оплодотворения. В гоявляется экземпляром, 2 мкм Z-интервал покрытия 40 мкм ткани в Z-стека, с двухминутного интервала времени в течение двух часов доказала свою эффективность. Кроме того, у эмбрионов с дефектным митоза, клетки в митоза, скорее всего, будет присутствовать, резко увеличивая время клеточного деления. Для того, чтобы приобрести несколько полных подразделений, продолжительность времени должна быть увеличена, то есть, от 2 часов до 4 часов. Более длительное время приобретение будет подвергать образец к большему количеству мощности лазерного излучения и увеличивают риск фотообесцвечивания и фототоксичности. В этом случае интервал времени между каждым Z-стека должен быть увеличен. Динамические движения хромосом будут принесены в жертву за счет увеличения интервала времени между Z-стеков, но продолжительность времени достигается. Это необходимо при визуализации деления клеток, которые могут длиться в течение двух ч.
Хотя это непосредственно не обсуждался, этот протокол может быть оптимизирован для получения более высокого разрешения изображения в Z-плоскости, чтобы более точно визуализировать отдельные хромосомы моvements. Например, на рисунке 4A наблюдаются два missegregated хромосомами. Хромосома вправо (отмеченного толстой стрелкой) изначально яркий и в центре внимания, но тускнеет в последних кадрах. С 2 мкм Z-интервала uncongressed хромосомы падает между Z-интервалом. Захват минут движения и особые события хромосом может быть достигнуто путем увеличения разрешения в Z плоскости. Чтобы сделать это, увеличить на отдельной ячейке с помощью инструмента A1 Область сканирования. При настройке параметров Z-стек, использовать меньший Z-интервал расстояния. Рекомендуемый диапазон составляет 0,5 - 1 мкм. Кроме того, уменьшение интервала времени между каждым Z стека будет создавать более плавные переходы между каждым периода времени, то есть от двух минут до 30 секунд - 1 мин. Одно предостережение к этому типу изображения является ограниченная Z-глубина, которая может быть достигнута. Из-за меньшего Z-интервала и временного интервала, более ткань будет подвергаться воздействию лазеров в меньшем времени. Чтобы преодолеть это, смпродолжительность времени Aller может быть использована; Однако это также зависит от того, как долго исследователь хотел бы захватить подразделений.
Аналогия, которая может помочь с этими изменениями, чтобы думать о Z-стека как гармошку. Расстояние между каждым складке сильфона является Z-интервал и Z-глубина представлена длине гармошкой. В случае, когда один не хотели бы накапливать больше лазерного воздействия на образец, как аккордеона участков (увеличивает Z-глубину), расстояние между складками мехов (Z-интервала) должна возрастать, а также. Обратное верно в том, что в качестве аккордеона контрактов, Z-глубина уменьшается. Складки договора сильфона, а также, что соответствует уменьшению Z-интервала. Эта аналогия может быть применена к фиксированной и живых образцов. Сложность увеличивается в данном протоколе, когда время добавляется к уравнению. Существует конечное количество времени, которое аккордеонист может продлить или заключить контракт на аккордеоне. Это представиТ.С. временного интервала. Для того, чтобы покрыть больше расстояния (Z-глубина) интервал времени должен увеличиваться. А также для того, чтобы услышать больше музыки, нужно слушать на более длительный промежуток времени (продолжительности времени) С точки зрения этого протокола, для того, чтобы засвидетельствовать больше деления клеток, продолжительность времени должна увеличиваться. Рецептуру фактор, чтобы иметь в виду, что чем больше музыки, которая играет, более уставшим гармонист. Это аналогично окончательной размерной, флуоресценции. Чем больше лазерное облучение образца дается, тем больше фотообесцвечивание и фототоксичности (усталость) становится проблемой.
Таким образом, этот протокол подробно описан метод визуализации митоза в живом данио эмбриона, применимые к различным анализам; 1) деление номер 2) с временным разделением каналов 3) судьба деления и 4) динамика хроматина с высокой разрешающей способностью. Широкие возможности для визуализации митоза компонентов, начиная от микротрубочек кинетохор вложений в центриоля динамику могут быть применены. Сочетание возможностеймитоза визуализации в естественных условиях с последними достижениями в области редактирования генома в данио позволит легко генерировать мутантов в различных аспектах митоза моделировать заболевания человека в организме позвоночных животных 25,26,52-56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N.
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A.
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J.
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
