Abstract
Mitos är avgörande för organismtillväxt och differentiering. Processen är mycket dynamisk och kräver beordrade händelser för att åstadkomma korrekt kromatinkondensation, mikrotubuli-kinetochor fastsättning, kromosomsegregation, och cytokines i en liten tid. Fel i den känsliga processen kan leda till mänskliga sjukdomar, inklusive fosterskador och cancer. Traditionella metoder undersöker mitotiska humana sjukdomstillstånd är ofta beroende cellodlingssystem, som saknar den naturliga fysiologi och utvecklings / vävnadsspecifika sammanhang fördelaktig när man studerar mänskliga sjukdomar. Detta protokoll vinner många hinder genom att tillhandahålla ett sätt att visualisera, med hög upplösning, kromosom dynamik i ett ryggradsdjur system, zebrafisk. Detta protokoll kommer detalj en metod som kan användas för att erhålla dynamiska bilder av delande celler, som omfattar: transkription in vitro, zebrafisk avel / insamling, embryo inbäddning och time-lapse avbildning. Optimering och modifIKATION av detta protokoll är också utforskas. Med användning H2A.F / Z-EGFP (etiketter kromatin) och mCherry-CAAX (etiketter cellmembranet) mRNA-injicerade embryon, mitos i AB vildtyp, auroraB hi1045 och esco2 hi2865 mutant zebrafisk är visualiseras. Högupplöst Live avbildning i zebrafisk gör att man kan observera flera mitoses att statistiskt mäta mitotiska defekter och tidpunkten för mitotisk progression. Dessutom är observation av kvalitativa aspekter som definierar felaktiga mitotiska processer (dvs. congression defekter, missegregation av kromosomer, etc.) och felaktig kromosom utfall (dvs aneuploidi, polyploidi, mikrokärnor, etc.) observerades. Denna analys kan appliceras på observationen av vävnadsdifferentiering / utveckling och är mottaglig för användningen av mutant zebrafisk och farmakologiska medel. Visualisering av hur defekter i mitos leda till cancer och störningar i utvecklingen kommer i hög gradöka förståelsen av patogenesen för sjukdomen.
Introduction
Mitos är en kritisk cellulär process avgörande för tillväxt, differentiering och regenerering i en levande organism. Vid noggrann beredning och replikation av DNA i interfas, är cellen primas att dela sig. Den första fasen av mitos, profas, initieras genom aktivering av cyklin B / Cdk1. Profas kännetecknas genom kondensation av kromatin material i kromosomer. Kärnhöljet nedbrytning inträffar vid övergången mellan profas och prometafas. I prometafas, centrosom, kärnbildningscentrum för spindelbildning, börja migrera till motsatta poler samtidigt utvidga mikrotubuli på jakt efter kinetochore fäste. Vid fastsättning, till konverteringar slut på mikrotubuli infästning och dragkrafter orientera kromosomerna bildar en metafas plattan 1. Om alla kromosomer är fästa på rätt sätt, är spindelenhet checkpoint nöjd, cohesin ringar som håller systerkromatider tillsammans klyvs och mikrotubuli förkorta dra systerkromatider till motsatta poler under anafas 2,3. Den sista fasen, telofas, involverar förlängning av cellen och bildning av kärnhöljet runt de två nya kärnor. Cytokines avslutar division processen genom att separera cytoplasman av de två nya dotterceller 4-6. Ändring av viktiga mitotiska banor (dvs spindelenhet checkpoint, centrosom dubbel, systerkromatidutbyten sammanhållning, osv.) Kan resultera i metafas stillestånd, missegregation av kromosomer, och genomisk instabilitet 7-10. I slutändan kan defekter i vägar styra mitos orsaka störningar i utvecklingen och cancer, kräver visualisering av mitos och dess defekter i en levande, ryggradsdjur, flercelliga organismer 10-16.
Zebrafisk embryon fungera som en stor modellorganism för levande avbildning på grund av den genomskinliga vävnad, enkel mikroinjektion, och snabb utveckling. Med hjälp av zebrafisk, är det övergripande målet för detta manuskript tillbeskriver en metod för levande 5D (dimensioner X, Y, Z, tid och våglängd) avbildning av mitos 17 (Figur 1C). Användningen av mutant zebrafisk defekt i olika mitotiska vägar visar en följd av sådana defekter. För detta protokoll, var Aurora B Esco2 mutanter valt att illustrera dessa brister. Aurora B är ett kinas som är en del av kromosomen passagerarkomplex (CPC) som deltar i spindelbildning och mikrotubuli fäste. Det krävs också för klyvning fåra bildning i cytokines 18,19. I zebrafisk, leder Aurora B brist på defekter i fåra induktion, cytokines, och kromosomsegregation 20. Esco2, å andra sidan, är ett acetyltransferas som är nödvändig för systerkromatidseparation sammanhållning 21,22. Det acetylater cohesin på SMC3 partiet av ring sålunda stabiliserande cohesin att säkerställa korrekt kromosomsegregation vid metafas-anafas övergången 23. Förlust av Esco2 i zebrafisk leder till chromosome missegregation, tidig systerkromatidseparation, genomisk instabilitet, och p53-beroende och oberoende apoptos 24,25. På grund av tillgången, auroraB hi1045 och esco2 hi2865 mutant zebrafisk (hädanefter kallad aurB m / m och esco2 m / m, respektive) kommer att användas för att illustrera denna teknik 25-27.
Koppling konfokalmikroskopi med fluorescerande-märkta cellmaskineriet har gjort det möjligt för forskare att visualisera kromatin och cellmembrandynamik under mitos 25,28,29. Fluorescerande-märkta histoner har historiskt använts för att visualisera kromatin. Histoner är nukleära proteiner som består av fyra olika par (H2A, H2B, H3 och H4) som ansvarar för nukleosomen struktur som komponerar kromosomerna 30. Medan H2B är utan tvekan den mest använda histon för fluorescerande proteiner imus och cellodling, användning av Histon 2A, Familje Z (H2A.F / Z) har visat sig vara bra för användning i zebrafisk 31,32. Konkanavalin A och kasein kinas 1-gamma till exempel, lokaliseras till cellmembranet och har tidigare visats effektiva i att visualisera cellmembranet i sjöborrar och drosophila 33,34. Andra studier har visat att CAAX fluorescerande-märkt protein etiketter cellmembranet och var framgångsrik i zebrafisk 31. CAAX är ett motiv som känns igen av posttranslationella modifieringsenzymer såsom farnesyltransferases och geranylgeranyltransferases. Ändringar av dessa enzymer orsakar proteiner att bli membranassocierade, alltså märkning cellmembranet 35.
På grund av den tidigare användningen i zebrafisk, valde detta protokoll att använda H2A.F / Z och CAAX att märka kromatin och cellmembranet. Tillämpningen av denna metod gör det möjligt för forskaren att övervaka mitos på individuell cellnivå för att observera individuella kromosomdynamik, liksom samtidigt övervaka flera celldelningar som kan påverka vävnadsdifferentiering och utveckling. Denna artikel kommer att fokusera på att avbilda dynamiken i kromosomsegregation under mitos på individuell cellnivå. Inom detta manuskript, kommer förmågan att observera flera mitotiska delningar, beräkna divisionen tid, och dechiffrera de mitotiska fenotyper att illustreras och diskuteras. Genom att använda dessa parametrar, fysiologiskt relevanta data kan samlas in och användas till flera sjukdomstillstånd som påverkas av mitotiska defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro-transkription
- Linjärisera pCS2-H2A.F / Z-EGFP och / eller pCS2-mCherry-CAAX-vektorer genom Notl restriktionsenzym smälta 31. Använda en RNA in vitro transkription kit, generera 5 'utjämnade mRNA produkter från varje mall, enligt tillverkarens protokoll.
- Rena de utjämnade mRNA med användning av en reningssats. Följ tillverkarens instruktioner. Eluera med RNas-fritt H2O
- Bestämma koncentrationen av RNA genom absorbans vid 260 nm med användning av en spektrofotometer. (OD 260 x utspädning x 40 ^ g / ml).
- Späd RNA till 100 ng / | il för varje H2A.F / Z-EGFP och mCherry-CAAX med RNas-fritt H2O Om RNA-koncentrationen är för låg, kommer fluorescensen att minskas eller frånvarande. Ljusare prover kommer att minska oron över fototoxicitet och fotoblekning. Å andra sidan kan för mycket RNA vara giftiga och / eller orsaka utanför mål effekter.
Obs! Förvara de återståenderenat mRNA i -80 ° C frys.
2. Zebrafish Avel, embryosamling och mRNA Injection 36-38
- Montera avelstankar med en barriär för att separera behållaren i två regioner och fylla varje avels tank med vattenbruk systemvatten som används i zebrafisk anläggning.
- För att förhindra för tidig avel, placera två manliga fisk på ena sidan av barriären och två honor på andra sidan natten innan avel.
- Nästa dag, tina den tidigare framställda mRNA blandningen på is. Byt vatten i avelstankar med färskt vattenbruk Vatten och undanröja hinder. Omedelbart efter barriärerna dras, värma en sprutform till 28,5 ° C och installera utrustningen för mikroinjektion.
Obs! För information om sprutformar, hänvisas till Gerlach 36. - Samla in ägg var 10 - 15 min med hjälp av en tesil och skölj äggen i en ren 100 x 15 mm petriskål med E3 Blå (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% metylenblått). E3 Blue används för att förhindra svamptillväxt och säkerställa korrekt utveckling av yngel. För mer information om parning och embryosamlings hänvisas till Gerlach 36 och Porazinkski 37.
- Embed en-cell iscensatt embryon i en uppvärmd formspruta och injicera RNA i äggulan i den önskade mängden av embryon (Figur 1A). Konto för naturlig embryonal död och obefruktade embryon genom att utföra embryonala injektioner på 15% fler embryon än vad som behövs för försöket. För ytterligare information om mikroinjektion av zebrafisk embryon hänvisas till Gerlach 36 och Porazinkski 37.
OBS: För första gången användning av mRNA, utföra en dos-kurva analys för att bestämma den optimala dosen för fluorescens och livskraft (definierat som inga stora utvecklingsdefekter upp till 5 DPF) innan du utför 5D avbildning. 150-200 ng / | ilinjiceras i embryon är ofta den optimala koncentrationen, därför är det en bra utgångspunkt för den slutliga koncentrationen. - Noggrant extrahera injicerade embryon från formen med hjälp av en modifierad 9 "glas pasteurpipett. Om du vill ändra pipett smälta slutet med hjälp av en bunsenbrännare tills den bildar en boll.
- Placera injicerade embryon i en 100 x 15 mm petriskål i E3 blått och hus i en 28,5 ° C inkubator.
- Sex timmar efter injektion, ta bort alla döda eller obefruktade embryon från plattorna och lägg ren E3 Blue. Hus embryona vid 28,5 ° C.
3. Upprättande och inbäddning av Live Zebrafish embryon för bildbehandling (Figur 1B)
- Två timmar före avbildning, screena injicerade embryon för GFP med hjälp av en fluorescerande dissekera mikroskop. Placera ljusa gröna GFP-uttryckande embryon i en ny 100 x 15 mm petriskål med E3 Blue.
- Koka en förrådslösning av 1% låg smält agaros genom att tillsätta 1 g av låg smält agaros till 100 ml av E3 Blue. Efter att ha använt agarosen täcker kolven med aluminiumfolie. Stamlösningen förblir användbara för upp till en månad.
- Alikvot 3 ml av den smälta agar in i en 17 x 100 mm odlingsrör. Hålla agaros varm genom att placera odlingsrör i en 42 ° C vattenbad tills klar för användning. Förbered en 15 mM Tricaine lösning i avjoniserat vatten för att söva de zebrafisk embryon 36.
OBS: Om bildåtergivning vid tidigare tidpunkter önskas, kan koncentrationen av agar minskas så lite som 0,3% 39. - Ta med 15 mM Tricaine, skärmad embryon, låg smält agaros, E3 blå, och en 35 mm täckglas bottnad odlingsskål till en dissektion ljusmikroskop. Försiktigt bort embryots chorion med # 5 pincett. Gör detta för tre embryon.
- Placera dechorionated embryona i en separat behållare som skall bedövas. Locket på täckglas nedre skålen används ofta för detta ändamål. Med hjälp av en överföringspipett, tillsätt tre droppar (cirka 150 l)av 15 mM Tricaine till skålen av 5 ml E3 blå (om du använder locket på täck nedre skålen) eller tills embryon har tillräckligt sövd. Dessutom till 3-4 droppar (cirka 150-200 l) av 15 mM Tricaine lösning på 1% smält agaros rör.
- Med hjälp av en P200 pipett med 1 cm pipettspetsen avskuren; överför de sövda embryon på täckglas bottnade skålen. Ta bort överflödigt E3 Blå: Tricaine lösning.
- Tillsätt långsamt 5 - 10 | il av låg smältpunkt agaros: Tricaine lösningen under embryona, att hålla varje droppe separat för att säkerställa embryona inte av misstag glida nära varandra.
Varning: Om agarosen är för varmt, kommer det att skada embryot. En bra temperatur för att bibehålla agar vid är 42 ° C. - Med användning av en 21 G 1 ½ nål, försiktigt orientera embryot i agarosen till önskat läge. Vid användning av ett inverterat mikroskop för time-lapse avbildning, orientera regionen av intresse (ROI) så nära täck som possible.
Notera: För allmänna ändamål, erbjuder svansregionen enkel orientering och klarhet på grund av den relativt tunna vävnad (Figur 1A). Andra vävnader, såsom den epiteliala skikt som omger gulan och fenan veck, kan användas 28,29. Dessa vävnader har stor klarhet, men dessa områden är bara några cellager tjockt. Vid tillämpningen av detta protokoll, är det fördelaktigt att bilden svansregionen att förvärva så många celldelningar som möjligt. - Låt några minuter för partiell stelning av ägarn. Använd nålen för att bryta sönder en liten bit av agar att testa dess stelning. När kan dras bort från droppen en bit agar, gå vidare till nästa steg.
- Täck hela täckglas med låg smält agar bildar en kupol över de inbäddade embryon. Låt agar stelna innan du flyttar skålen för konfokal avbildning (Figur 1A).
- Under agar stelningsprocessen (tar ungefär 10 minuter), förbereda tre ml of E3 Blå lösning med fem droppar (cirka 250 l) 15 mM Tricaine att placeras över de inbäddade embryon under avbildning.
4. 5D Confocal avbildning av Live Zebrafish embryon 40,41
OBS: Se Ariga 40 och O'Brien 41 för mer information om hur man utför 5D avbildning med andra konfokala system. För Z-intervall, Z-stack, Z-djup, tidsintervallet, och 5D definitioner se figur 1C.
- Öppna bildbehandlingsprogram och ställa mikroskop för att 60X NA 1,4 objektiv. Applicera immersionsolja till objektiv och placera kulturen skålen i diapositivhållaren på mikroskop scenen. Med hjälp av axelstyrning, centrera embryot av intresse ovanför objektivlinsen och bringa objektivlinsen uppåt för att möta den odlingsskålen.
- Klicka på ikonen okularet och växla till GFP filtret på mikroskopet. Fokus på ROI. Med fokus på vävnaden närmast täck kommer offer de bästa bildbehandling resultat.
- Ta bort låsningen. Välj GFP och mCherry kanaler (förinställda våglängder i programvara) och långreven genomsnitt alternativ till det normala.
- Använd "Visa / Förvärvskontroll / A1 Scan Area" för att öppna verktyget A1 Scan Area.
- Börja skanna. Med användning av den axelstyrenheten, placera embryot så att avsökningsytan är fylld med så mycket av zebrafisk som möjligt. Lasereffekten behöver inte vara optimal vid denna tidpunkt. Sänk lasereffekt för att undvika onödig fotoblekning.
- Använd "Visa / Förvärvskontroll / ND förvärv" för att öppna ND förvärvet kontrollpanel.
- Börja skanna att ställa in Z-stack parametrar. Ställa in Z-stack övre gräns för där cellerna inte är i fokus och lägre gräns för där celler inte längre är synliga. Möjliggöra en 3 um utrymme ovanför provet för tillväxt och cellrörelse, som kan expandera in i bildfältet. Z-stack för de siffror som visas i denna proprotokoll omfattade en Z-djup av 40 pm i embryot svansen.
- Ställ Z-intervall steglängd till 2 pm. I genomsnitt är en cell 10 pm i diameter; Därför 2 pm kommer att producera fem intervaller av bilddata som skall analyseras för varje cell.
OBS: Djupet av bilden som kan förvärvas är beroende av Z-intervall. Z upplösning offras för att få totala djup i Z-dimensionen för att bilden som många celler som genomgår mitos som möjligt (stora Z-djup). Det omvända är sant, att, genom att minska stegstorleken är Z upplösning vunnit, medan Z djup offras (små Z-djup). - Justera bildlasereffekt, HV, och offset nivåer. För experiment visade i detta protokoll, använd följande lasereffekt, HV, och offset nivåer som på motsvarande nivå, respektive, för GFP-kanalen; 2-5, 120-140, och -9 till -11. För mCherry kanal, använd följande lasereffekt, HV, och offset nivåer, respektive; 3-6, 120-140, och -3 till-8. När parametrarna är inställda, stänga av skanningen för att förhindra onödig laserexponering som kan orsaka fototoxicitet och fotoblekning av provet.
- Välj medelvärdesikonen 2x linje. "Ingen medelvärdes" ger en kornig bild medan "4x linje genomsnitt" drastiskt ökar söktiden. Användning av 2x linje genomsnitt ger den bästa bildkvaliteten och snabbaste söktiden.
- Välj lämpligt tidsintervall och varaktighet som krävs för experimentet. För vildtyp divisioner, är två-minuters tidsintervall för 2 h bäst för bestämning mitotiskt varaktighet (som används i figurerna 1, 2, 3A och 3B). Divisioner som aktiverar spindelaggregatet riktpunkt för längre tid än 30 minuter är mer lämpade för fem minuters intervall för fyra timmar i syfte att bevara fluorescens såsom visas i figur 3C.
- Kontrollera "spara till fil" rutan och namnge filen att automatiskt spara filen som den förvärvas. Dubbelkolla alla pametrar är korrekt inställda och klicka på "start run".
- Efter förvärvet är klar att visa filen i ett tredimensionellt format, klicka på ikonen tröskelvolymen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar förmågan att observera många celldelningar som använder ett brett fält vy av ett AB vildtyp zebrafisk svans. Över sju mitotiska celler avbildas i en 14 min tidsram (film 1). Inom två timmar tidsförloppet, var över 40 mitotiska händelser fångas. I genomsnitt har 50 delande celler observerades i AB och 30 delande celler i aur B m / m embryon (figur 2B). Att ta hänsyn till antalet celler avbildas, förhållandet av mitotiska celler till antalet celler avbildas beräknades (Figur 2C). Dessa data tyder på att det inte finns ett lägre antal celler går igenom mitos i aur B m / m embryon (figur 2b) men färre antal celler som avbildas. Förmågan att skaffa sig en statistiskt signifikant antal händelser som denna kommer att underlätta statistisk styrka.
Figur 3 expanderar på denna teknik för att inkludera kvantifiera mitotisk varaktighet. När en time-lapse session förvärvas, kan en enskild cell analyseras för tid i mitos med tillräcklig upplösning med hjälp av zoomverktyget (Figur 3A, B). Mitotisk varaktighet beräknas manuellt genom att räkna hur många tidsintervall ta upp en celldelning. Antalet tidsintervall multipliceras sedan med tidsintervallet mellan varje Z-stack. Till exempel i figur 3C, tog divisionen upp 12 tidsintervall och tidsintervallet mellan varje Z-stack var 2 min. Därför divisionen tid för denna cell var 24 min. Den genomsnittliga AB vildtyp division Tiden är 25 min och 58 min för aurB m / m (figur 3B). En förlängd division tid som sett i aurB m / m tyder på att den spindelenhet checkpoint inte är uppfyllt på grund av felaktig kinetochore bilagor 1,2. Ta en närmare titt på den zoomade i embryon av vildtyp, kan varje mitotiska fas urskiljas (figur 3C, film 2). Dessutom kan observeras mitotiska defekter i aurB m / m embryo som omfattar mitotiska stillestånd och misslyckades cytokines som resulterar i en binucleated cell och efterföljande bildning av en mikrokärn (Figur 3D, Movie 3). Detta inzoomad analys visar mitotiska defekter stöder ökad division tid förvärvats i figur 3B.
Olika andra diverse mitotiska defekter och cellöden som kan uppstå utforskas i figur 4; visats i esco2 + / m och esco2 m / m embryon. I en esco2 + / m embryo, är felaktiga kromosom rörelser fångas och kan definieras som congression defekts. Congression fel uppstår när felaktiga mikrotubuli bilagor görs. Dessa defekter kommer att orsaka fel på kromosomerna att migrera mot metafas plattan. Parade systerkromatider, särskilt identifierbara vid min 20 och 46, som inte har congressed mot metafas plattan kan först observeras vid min 14. Anaphase debut separerar systerkromatider inriktade på metafas plattan liksom de parade systerkromatider till höger, observerades vid minut 50. Dessutom är möjlig mikrokärnbildning observer eftersom dessa separerade systerkromatider förblir isolerade utanför kärnan (T = 50, figur 4A, Movie 4). I figur 4B är en multipolär division visualiseras (film 5). Multipolär divisioner uppstår ofta på grund av centrosom förstärkning, men kan ske genom andra medel 42. I figur 4C, en esco2 m / m cell visar initialt tidigt systerkromatidutbyten Separatjon och spindelrotation 9,43,44. Annan cell öde visade i denna panel är en anafas bro där merotelic bilagor är olösta 45,46. Det anafas bro kan först ses på minut 62. kromatin verkar förtid decondense medan cellen genomgår cytokines. Som cytokines inträffar, träffar klyvnings fåra på dekondenserad kromosomer, och som abskission inträffar drar kromatin materialet för att bilda en anafas brygga (Figur 4C, film 6). Även om det inte visas här, för att kvantifiera de cellulära öden, spela in alla mitotiska divisioner i varje bildruta och den typ av cell öde de uppvisar. Dividera antalet celler i varje ödet av det totala antalet avdelningar som registrerats och multiplicera med 100 för att beräkna cell öde procent.
Figur 1: Protokoll Ritningar skisserar. (EN) (B) Schematisk bild av embryot bädda processen. De injicerade embryon måste dechorionated och bedövas. Embryon överförs sedan till täckglas-nedre skålen och överskott E3 Blue avlägsnas. Låg smält agar används för att skapa separata kupoler täcker varje embryo. Orientera embryon så svansen är närmast täck. Vänta två minuter innan du lägger agar täcker hela täck. Vänta tills agar stelnar innan han flyttade till bilden. (C) Schematisk ritning att definiera villkoren Z-intervall, Z-stack, Z-djup, tidsintervall, varaktighet och 5D som används i protokollet och diskussion. Z-intervall definieras som avståndet mellan varje bild som mikroskopet flyttas djupare in i provet för att skapa en Z-stack. Z-stack är alla bilder som tagits genom enprovet vid det definierade Z-intervall. Den tillryggalagda sträckan i en Z-stack definierar Z-djup. Tidsintervallet är den mängd tid mellan en Z-stack och nästa Z-stack för att skapa en time-lapse bild. Varaktighet är den totala tid som används för att avbilda. 5D definieras som måtten X, Y, Z, tid, och fluorescensemission. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. time-lapse avbildning Fångar Flera Mitotiska händelser i en levande zebrafisk embryo. (A) Time-lapse stillbilder från en zoomat ut experiment i ett AB vildtyp, 24 HPF zebrafisk visar flera mitotiska händelser. Asterisker pekar mot sju celler i mitos. t = tid som gått i min. Skalstreck = 5 um. (B) Antalet mitotiska cells observerats i AB och aurB m / m zebrafisk svansar vid 24 HPF. Medelvärde ± st. dev., n = 3 embryon / genotyp. (C) Förhållandet mellan mitotiska celler per totala antalet celler i AB och aurB m / m zebrafisk svansar vid 24 HPF. Medelvärde ± st. dev., n = 3 embryon / genotyp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Individuell cellanalys Fångar Varje Mitotisk fas och Mitotisk varaktighet. (A) En cell vald från den breda fältet vy av AB vildtyp, 24 HPF zebrafisk embryo visas i figur 2A. (B) Division tid observeras för AB och aurB m / m celler och beräknas från sluta sig till kärnhöljet breakdown (NEB) vid den första observationen av kondenserat kromatin i en cell till bildning av två nya dotterceller. n = 3 embryon / genotyp, n = 66 divisioner för AB, n = 29 divisioner för aurB m / m, *** p-värde <0,001. (C) AB vild celltyp beskärs för att visualisera fas progression genom mitos . t = min. Skalstreck = 5 | j, m. (D) aurB m / m cell beskärs för att visualisera mitotiska progression genom mitos som innehåller mitotiska arrestering leder till cytokines misslyckande och mikrokärnor bildning. Pilar pekar mot mikrokärnor. t = tid som gått i min. Skalstreck = 5 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4.Enda cell Live Imaging Fångar Flera Mitotiska Defekter förknippade med kromosomsegregation och division i Mitotisk Mutant Zebrafisk. (A) en beskuren bild av en cell genomgår congression defekter i en esco2 + / m embryo. Den tunna pilen övervakar vänstra kromosomen som dras tillbaka in i metafas plattan. Den tjocka pilen övervakar rätt kromosom som inte dras tillbaka in i metafas plattan och sluta för att bilda en mikrokärn. Den dubbla pilen visar separationen av rätten kromosom som inte gjorde kongressen vid anafas debut. Inläggningar visar zoomas in synpunkter från kromosomerna som misslyckats med att kongressen. Inläggningar var beskäras och ljusstyrka förbättras för bättre visualisering. CAAX fluorescens togs bort för att lättare visualisera kromosomer. Skalstreck = 5 | j, m. (B) En beskärs bilden av en cell som genomgår mitotiskt stillestånd som resulterar i en multipolär division i en esco2 + / M embryo. Skalstreck = 5 um. (C) En beskurna bilden av en cell genomgår sammanhållning trötthet resulterar i anafas bro formation ses av trådliknande dra mellan de två kärnorna noteras av konsolerna. Skalstreck = 5 | j, m. t = tid som gått i min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Flera celldelningar kan visualiseras i en vidsträckt utsikt över en injicerad vildtyp zebrafisk embryo (högerklicka för att ladda ner).
Film 2. faser mitos kan enkelt visualiseras i en vild-typ zebrafisk embryo (r ight klicka för att ladda ner). Är kärnhöljet uppdelning härledas av den oregelbundna utseendet av kärnan och fortsätter mot congression av systerkromatider att bilda en metafas platta . Exakt segregation inträffar och ger två nya dotterceller.
Film 3. Live avbildning av aurB m / m embryo avslöjar kromosom missegregation misslyckades cytokines, och mikrokärnor bildning (högerklicka för att ladda ner). Kärn kuvert uppdelning framgår av den oregelbundna utseendet av kärnan, kromosomer scatter till motsatta poler som inte kan bilda en ordentlig metafas plattan, och fortsätt att rotera på axeln sträcker divisionen tid av cellen. Cytokines förekommer inte resulterar i en 4N cell och flera mikrokärnor.
Movie 4. Congression defekter observeras i en esco2 + / m embryo (högerklicka för att ladda ner). Är kärnhöljet uppdelning härledas av den oregelbundna utseendet av kärnan. Efter metafas plattan är bildad, några indiskilda kromosomer scatter på vardera sidan. En enskild kromosom av till vänster slutligen dras tillbaka in i metafas plattan medan kromosom till höger förblir utanför metafas plattan och kan ses separera systerkromatider i början av anafas. Cellen uppvisar en förlängd division tid men ultimata klyftor med potentiella mikrokärnbildning.
Film 5. multipolär division observeras i en esco2 + / m embryo (högerklicka för att ladda ner). Är kärnhöljet uppdelning härledas av den oregelbundna utseendet på kärnan och sedan kromosomer går samman och bildar en Y-form indicative av 3-spindelstolpar. Cellen uppvisar en förlängd division tid men i slutändan delar i 3 dotterceller.
Film 6. tidig systerkromatidseparation och anafas bryggbildning observeras i en esco2 m / m embryo (högerklicka för att ladda ner). Är kärnhöljet uppdelning härledas av den oregelbundna utseendet på kärnan och sedan kromosomer sprider hela cellen inte kan bilda en ordentlig metaplatta. Kromatinet decondenses före cytokines och som cellen delar sig, skapar en anafas bro mellan de två cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av denna metod gör att man kan sluta sig till kärnhöljet nedbrytning, bildandet av en metafas platta genom mikrotubuli-kinetochore bilagor, och segregering av systerkromatider för att bilda två nya celler in vivo och i ett tidsberoende sätt. Förmågan att observera mitos i zebrafisk är fördelaktig över fasta prover och cellodlingssystem, eftersom cellerna som avbildas i den naturliga fysiologi är vävnaden transparent vilket gör det möjligt för fluorescerande proteiner som skall användas, utvecklar de relativt snabbt, och tidsförlopp avbildning kan förvärvas. Användning av vuxna zebrafisk för detta protokoll är begränsad på grund av den begränsade Z-djup som kan förvärvas på grund av den tjockare vävnad som inte är hud eller ögon. Medan transgena djur som uttrycker H2A.F / Z-EGFP och mCherry-CAAX skulle kunna användas för samma ändamål, mångsidighet och lätthet av mRNA-injektioner i olika mutant zebrafisk är fördelaktig jämfört med genetiska korsningar. I situationer där mitotisk analys ärkrävs i tre dagar efter befruktningen (DPF) eller senare embryon skulle transgena djur vara nödvändigt på grund av halveringstiden av RNA i detta snabbt växande organism.
Andra fluorescerande proteiner för att visualisera mitos är mottagliga för detta protokoll. Till exempel, är H2B-GFP-mRNA ett alternativ till H2A.F / Z-EGFP för kromatin, och tillhandahåller liknande märkning. Andra fluorescerande-märkta proteiner som kan användas i denna teknik inkluderar POM121, centrin, EB1, Hec1 och EMTB som skulle göra det möjligt för levande i embryo avbildning av kärnhöljet, centrioler, plus-end mikrotubuli kinetokoren och mikrotubuli, respektive 32,47-51.
Detta protokoll har flera viktiga imaging steg som måste utföras för att uppnå bästa resultat: 1) Se till att optimera mRNA kvalitet och koncentration för att ge den ljus fluorescens och ingen toxicitet som möjligt. Ju mer fluorescens kommer att leda till mindre laserexponering och därför mindre photobleaching och fototoxicitet. 2) Embryot måste helt bedövad och säker i agar. Mindre rörelser kommer att förändra resultaten och kan förstöra experimentet. 3) agarkoncentration måste vara lämplig för det skede av embryot önskas avbildas. Vid 24 HPF och vidare är 1% låg smältpunkt agaros lämplig. Om avbildning vid 12 HPF eller tidigare, bör en 0,3% -ig lösning användas 39. 4) The ROI i embryot bör vara så nära täckglas som möjligt. Detta steg begränsar inte en avbildning svansen. Ögon, hud, ryggregionen, äggula, och fin gånger är exempel på andra områden som kan använda detta protokoll.
Tid är den avgörande faktorn som skiljer detta protokoll från avbildning fasta embryon eller vävnader. När du ställer in Z-stack, Z-intervall, time-lapse intervallet, och Time-lapse varaktighet, är det viktigt att hålla i minnet samband med experimentet (Figur 1C). En vild-typ celldelning vanligtvis varar ca 25 minuter vid 24 HPF. i thär exempel har en 2 pm Z-intervall som täcker 40 pm av vävnad i en Z-stack, med en två minuters tidsintervall för två timmar visat sig vara effektiv. Vidare, i embryon med defekt mitos, celler i en mitotiska arrestering kommer sannolikt att vara närvarande, drastiskt öka celldelnings gånger. Att förvärva flera fulla avdelningar bör tidsvaraktigheten ökas, det vill säga från två timmar till fyra timmar. En längre förvärvstid kommer att utsätta provet till mer lasereffekt och öka risken för fotoblekning och fototoxicitet. I detta fall bör ökas tidsintervallet mellan varje Z-stack. Dynamiska kromosomförändringar kommer att offras genom att öka tidsintervallet mellan Z-stackar, men tidslängden vinns. Detta är nödvändigt när avbildning celldelningar som kan pågå under två timmar.
Även om det inte var direkt diskuterats, kan detta protokoll optimeras för att erhålla en högre upplösning i Z-planet för att mer exakt visualisera individuell kromosom mobättringar. Till exempel, i figur 4A två missegregated kromosomer observeras. Kromosomen till höger (noterat den tjocka pilen) är initialt ljus och i fokus men dämpas under de senaste ramarna. Med en 2 ^ m Z-intervall, faller uncongressed kromosomen in mellan Z-intervall. Fånga minuten rörelser och singulära kromosomhändelser kan åstadkommas genom att öka upplösningen i Z-planet. För att göra detta, zooma in på en enskild cell hjälp A1 Scan Area. När du ställer upp Z-stack parametrar, använda en mindre Z-intervallavståndet. Ett rekommenderat intervall är 0,5-1 um. Dessutom kommer att minska tidsintervallet mellan varje Z stapel skapa mjukare övergångar mellan varje tidsram, dvs, från två min till 30 sek - 1 min. En varning för att denna typ av avbildning är den begränsade Z-djup som kan uppnås. På grund av den mindre Z-intervall och tidsintervallet, kommer mer vävnad att utsättas för de lasrar i en mindre tidsram. Att övervinna detta, smAller varaktighet kan användas; men detta är också beroende av hur lång tid forskaren skulle vilja fånga divisioner.
En analogi som kan hjälpa till med dessa ändringar är att tänka på en Z-stack som ett dragspel. Avståndet mellan varje veck hos bälgen är Z-intervallet och den Z-djupet representeras av längden på dragspelet. I ett fall där man inte vill samla mer laserexponering till provet, som dragspel sträckor (ökar Z-djup), ska avståndet mellan vecken i bälgen (Z-intervall) ökar också. Inversen är sant i det såsom dragspels kontrakt, minskar Z-djup. Vecken hos bälgen kontrakt också, vilket motsvarar en minskning i Z-intervall. Denna analogi kan tillämpas på fasta och levande prov. Komplexiteten ökar i detta protokoll när tiden läggs till ekvationen. Det finns en ändlig mängd tid att dragspelaren kan förlänga eller dra samman dragspelet. denna reprets tidsintervallet. För att täcka mer distans (Z-djup) tidsintervallet måste öka. Samt, för att höra mer musik, måste man lyssna efter en längre tid (tidslängd) När det gäller detta protokoll, för att bevittna fler celldelningar, måste tidslängden ökar. En blandning faktor att tänka på är att ju mer musik som spelas, desto mer trött dragspelare. Detta är analogt med den slutliga dimensionen, fluorescens. Ju mer laserexponering provet ges, desto mer fotoblekning och fototoxicitet (trötthet) ett problem.
Sammanfattningsvis, detta protokoll detaljer en metod för att visualisera mitos i en levande zebrafisk embryo som gäller för olika analyser; 1) division nummer 2) division tid 3) division öde och 4) högupplösta kromatin dynamik. Flera möjligheter att visualisera mitotiska komponenter i storleksordningen från mikrotubuli-kinetochore bilagor till centriol dynamik kan tillämpas. Kombinerar förmågan attimaging mitos in vivo med de senaste framstegen inom genomet redigering i zebrafisk kommer att göra det lätt att generera mutanter i olika aspekter av mitos för att modellera den mänskliga sjukdomen i ett ryggradsdjur organism 25,26,52-56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N.
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A.
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J.
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
