Abstract
الانقسام أمر بالغ الأهمية للنمو العضوي والتمايز. عملية ديناميكية للغاية ويتطلب أمرت الأحداث لتحقيق التكثيف السليم لونين، التعلق أنيبيب الحيز الحركي، العزل الصبغي، والانقسام السيتوبلازمي في فترة زمنية صغيرة. أخطاء في عملية حساسة يمكن أن يؤدي إلى الأمراض التي تصيب البشر، بما في ذلك العيوب الخلقية والسرطان. الأساليب التقليدية التحقيق الحالات المرضية الإنقسامية الإنسان غالبا ما تعتمد على أنظمة زراعة الخلايا، التي تفتقر إلى علم وظائف الأعضاء الطبيعي والتنموي / السياق الأنسجة محددة المفيد عند دراسة الأمراض التي تصيب البشر. هذا البروتوكول يتغلب على العديد من العقبات من خلال توفير وسيلة لتصور، مع ارتفاع القرار، وديناميات كروموسوم في النظام الفقاريات، الزرد. هذا البروتوكول سوف بالتفصيل النهج التي يمكن استخدامها للحصول على صور ديناميكية تقسيم الخلايا، والتي تشمل: النسخ في المختبر، وتربية الزرد / جمع ودمج الجنين، والوقت الفاصل بين التصوير. تحسين وmodifيتم استكشاف أيضا ications من هذا البروتوكول. باستخدام H2A.F / Z-EGFP (تسميات لونين) وmCherry-CAAX (تسميات غشاء الخلية) الأجنة حقن الرنا المرسال، الانقسام في AB-النوع البري، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 هو تصور الزرد متحولة. عالية الدقة التصوير الحي في الزرد يسمح احد لمراقبة mitoses متعددة لقياس إحصائيا العيوب الإنقسامية وتوقيت تطور الإنقسامية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ مراقبة الجوانب النوعية التي تحدد العمليات غير لائقة الإنقسامية (أي عيوب congression، missegregation من الكروموسومات، الخ) ونتائج الكروموسومات غير لائق (أي عدم توازن الصبغيات، تعدد الصيغ الصبغية، النويات، وما إلى ذلك). هذا الاختبار يمكن تطبيقها على مراقبة الأنسجة التمايز / التنمية وغير قابلة للاستخدام الزرد متحولة وكلاء الدوائية. تصور كيف عيوب في الانقسام تؤدي إلى السرطان والتنموية اضطرابات سوف كثيراتعزيز التفاهم من التسبب في المرض.
Introduction
الانقسام هو الحاسم الخلوي ضروري عملية النمو، والتمايز، وتجديد في الكائن الحي. على إعداد دقيق وتكرار الحمض النووي في الطور البيني، وكانت سببا في الخلية للقسمة. وبدأت المرحلة الأولى من الانقسام، الطور، من خلال تفعيل السيكلين B / Cdk1. يتميز الطور الأول من التكثيف من مادة الكروماتين في الكروموسومات. يحدث المغلف انهيار النووي في الانتقال بين الطور الأول وطليعة الطور التالي. في طليعة الطور التالي، جسيم مركزي، ومركز نواة للتشكيل المغزل، والبدء في الهجرة إلى أقطاب المعاكس في حين تمتد الأنابيب الدقيقة بحثا عن التعلق الحيز الحركي. عند الإلحاق، والتحويلات لوضع حد على التعلق أنيبيب وقوات التوتر توجيه الكروموسومات تشكيل لوحة الطورية 1. إذا تعلق جميع الكروموسومات بشكل صحيح، اقتنعت حاجز الجمعية المغزل، والمشقوق حلقات cohesin عقد الصبغي شقيقة معا، والأنابيب الدقيقة تقصير لسحب الشقيقةالصبغي إلى أقطاب المعاكس خلال طور الصعود 2،3. المرحلة النهائية، الطور النهائي، ينطوي على استطالة الخلية وإعادة تشكيل الغلاف النووي حول اثنين من نواة جديدة. السيتوبلازمي يكمل عملية الانقسام من خلال فصل السيتوبلازم اثنين من الخلايا الوليدة الجديدة 4-6. تغيير مسارات رئيسية الإنقسامية (أي حاجز الجمعية المغزل، ازدواجية الجسيم المركزي، chromatid الشقيقة التماسك، الخ.) يمكن أن يؤدي إلى اعتقال الطورية، missegregation من الكروموسومات، وعدم الاستقرار الجيني 7-10. في نهاية المطاف، ويمكن عيوب في مسارات السيطرة على الانقسام يسبب اضطرابات النمو والسرطان، مما استلزم تصور الانقسام وعيوبه في العيش، والفقاريات، كائن متعدد الخلايا 10-16.
الأجنة الزرد بمثابة كائن نموذج رائع للتصوير الحية ويرجع ذلك إلى نسيج شفاف، وسهولة حقن مكروي، والتطور السريع. باستخدام الزرد، والهدف العام من هذا المخطوط هووصف وسيلة 5D الحية (أبعاد X، Y، Z، والوقت، والطول الموجي) التصوير من الانقسام 17 (الشكل 1C). استخدام الزرد متحولة خلل في مسارات مختلفة الإنقسامية تدليل على ذلك من مثل هذه العيوب. لهذا البروتوكول، وقد تم اختيار أورورا باء وEsco2 المسوخ لتوضيح هذه العيوب. أورورا B هو كيناز الذي هو جزء من مجمع كروموسوم الركاب (CPC) تشارك في تشكيل المغزل والتعلق أنيبيب. مطلوب أيضا لتشكيل انشقاق ثلم في السيتوبلازمي 18،19. في الزرد، ونقص أورورا B يؤدي إلى عيوب في الحث ثلم، السيتوبلازمي، وكروموسوم الفصل 20. Esco2، من ناحية أخرى، هو أسيتيل التي لا غنى عنها لchromatid الشقيقة التماسك 21،22. ومن acetylates cohesin على الجزء SMC3 من الحلبة وبالتالي استقرار cohesin لضمان الفصل كروموسوم السليم في المرحلة الانتقالية الطورية طور الصعود 23. فقدان Esco2 في الزرد يؤدي إلى التشابترmissegregation romosome، من السابق لأوانه الفصل الكروماتيدات الشقيقة، عدم الاستقرار الجيني، والتي تعتمد على البروتين p53 وموت الخلايا المبرمج مستقلة 24،25. ونظرا لتوفر، auroraB hi1045، وhi2865 esco2 الزرد متحولة (يشار إليها فيما aurB م / م وesco2 م / م، على التوالي) وسوف تستخدم لتوضيح هذه التقنية 25-27.
وقد مكن اقتران متحد البؤر المجهري مع الآلات خلية فلوري الموسومة الباحثين إلى تصور لونين وغشاء الخلية ديناميات خلال الانقسام 25،28،29. تاريخيا استخدمت الهستونات الفلورسنت الموسومة إلى تصور لونين. الهستونات هي البروتينات النووية مكونة من أربعة أزواج مختلفة (H2A، H2B، H3، H4 و) التي هي المسؤولة عن هيكل جسيم نووي أن يؤلف الكروموسومات 30. في حين H2B يمكن القول إن هيستون الأكثر استخداما لالبروتينات الفلورية فيوقد ثبت الماوس وزراعة الخلايا، واستخدام هيستون 2A، Z الأسرة (H2A.F / Z) تماما للاستخدام في الزرد 31،32. كونكانافالين ألف والكازين كيناز 1-جاما على سبيل المثال، تعريب لغشاء الخلية، وقد أظهرت سابقا فعالا في تصور غشاء الخلية في قنافذ البحر وذبابة الفاكهة 33،34. وقد أظهرت دراسات أخرى أن CAAX بروتين فلوري الموسومة تسميات غشاء الخلية وكان ناجحا في الزرد 31. CAAX هو الحافز معترف بها من قبل الأنزيمات المعدلة بعد متعدية مثل farnesyltransferases وgeranylgeranyltransferases. تعديلات من قبل هذه الانزيمات تسبب البروتينات التي تساعدهن على غشاء المرتبطة بها، وبالتالي وصفها غشاء الخلية 35.
بسبب الاستخدام السابق في الزرد، واختار هذا البروتوكول لاستخدام H2A.F / Z وCAAX لتسمية لونين وغشاء الخلية. وتطبيق هذه الطريقة تسمح للباحث لمراقبة الانقسام على مستوى الخلية الفردية لمراقبة كروموسوم فرديديناميكية، وكذلك في وقت واحد يراقب الانقسامات الخلوية المتعددة التي قد تؤثر على تمايز الأنسجة والتنمية. هذه المادة سوف تركز على تصوير ديناميات فصل الكروموسومات خلال الانقسام على مستوى الخلية الفردية. ضمن هذه المخطوطة، والقدرة على مراقبة عدة أقسام الإنقسامية، حساب الوقت الانقسام، وفك الظواهر الإنقسامية سيتم توضيح ومناقشتها. باستخدام هذه المعايير، من الناحية الفسيولوجية البيانات ذات الصلة يمكن جمعها وتطبيقها على عدة ولايات المرض تتأثر العيوب الإنقسامية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. النسخ في المختبر
- خطي pCS2-H2A.F / Z-EGFP و / أو ناقلات pCS2-mCherry-CAAX من تقييد نوتي هضم انزيم 31. باستخدام الحمض النووي الريبي في عدة نسخ في المختبر، وتوليد 5 "المنتجات مرنا توج من كل قالب، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- تنقية مرنا توج باستخدام طقم تنقية. اتبع تعليمات الشركة الصانعة. أزل مع ريبونوكلياز خالية H 2 O.
- تحديد تركيز الحمض النووي الريبي الامتصاصية في 260 نانومتر باستخدام مطياف. (OD 260 س تخفيف × 40 ميكروغرام / مل).
- تخفيف الحمض النووي الريبي إلى 100 نانوغرام / ميكرولتر لكل H H2A.F / Z-EGFP وmCherry-CAAX مع ريبونوكلياز خالية من 2 O. إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي منخفض جدا، سوف تتضاءل مضان أو غائبة. سوف عينات أكثر إشراقا يقلل من المخاوف بشأن الضيائية وphotobleaching من. من ناحية أخرى، يمكن أن الكثير من RNA أن تكون سامة و / أو يسبب من آثار الهدف.
ملاحظة: تخزين المتبقيةمرنا تنقيته في الثلاجة -80 درجة مئوية.
2. تربية اسماك الزرد، وجمع الأجنة، ومرنا حقن 36-38
- تجميع الدبابات تربية بحاجز لفصل خزان إلى منطقتين وملء كل خزان تربية بالماء نظام تربية الأحياء المائية المستخدمة في منشأة الزرد.
- من أجل منع تكاثر في وقت غير مناسب، ووضع اثنين من ذكور السمك على جانب واحد من الجدار وسمكتين الإناث على الجانب الآخر الليل قبل التزاوج.
- في اليوم التالي، ذوبان الجليد الخليط مرنا معدة مسبقا على الجليد. استبدال المياه في خزانات تربية بالماء نظام تربية الأحياء المائية العذبة وإزالة الحواجز. على الفور بعد سحب الحواجز، الحارة لحقن القالب إلى 28.5 درجة مئوية، وإعداد المعدات ل microinjection.
ملاحظة: للحصول على معلومات حول قوالب حقن، يرجى الرجوع إلى غيرلاخ 36. - جمع البيض كل 10 - 15 دقيقة باستخدام مصفاة الشاي وشطف البيض إلى 100 × 15 ملم طبق بيتري نظيفة مع البريد3 الأزرق (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4، 10 -5٪ الميثيلين الأزرق). يستخدم E3 الأزرق لمنع نمو الفطريات وضمان التنمية السليمة للأسماك اليرقات. لمزيد من المعلومات عن التزاوج وجمع الأجنة، راجع غيرلاخ 36 و 37 Porazinkski.
- تضمين نظمت خلية واحدة الأجنة في قالب حقن حرارة وحقن الحمض النووي الريبي في صفار البيض في المبلغ المطلوب من الأجنة (الشكل 1A). حساب للموت الجنين الطبيعي والأجنة غير مخصبة عن طريق إجراء الحقن الجنينية على 15٪ أكثر الأجنة من اللازم للتجربة. للحصول على تفاصيل إضافية عن Microinjection من الأجنة الزرد، يرجى الرجوع إلى غيرلاخ 36 و 37 Porazinkski.
ملاحظة: للحصول على الاستخدام لأول مرة من مرنا، إجراء تحليل للجرعة منحنى لتحديد الجرعة المثالية لمضان وقدرتها على البقاء (كما هو موضح أي عيوب التنموية الإجمالية تصل إلى 5 DPF) قبل إجراء التصوير 5D. 150 - 200 نانوغرام / ميكرولترتحقن الأجنة في كثير من الأحيان على تركيز الأمثل، وبالتالي فإنه هو نقطة انطلاق جيدة لتركيز النهائي. - استخراج بعناية الأجنة المحقونة من القالب باستخدام المعدلة 9 "زجاج باستور ماصة. لتعديل ماصة، تذوب نهاية باستخدام موقد بنسن حتى تشكل الكرة.
- وضع الأجنة المحقونة في طبق بيتري 100 × 15 ملم في E3 الأزرق ومنزل في 28.5 درجة مئوية الحاضنة.
- ستة ساعة بعد الحقن، وإزالة أي أجنة ميتة أو غير مخصبة من لوحات وإضافة نظيفة E3 الأزرق. منزل الأجنة في 28.5 درجة مئوية.
3. إعداد والتضمين من لايف الزرد الأجنة للتصوير (الشكل 1B)
- اثنين من ساعة قبل التصوير، وشاشة الأجنة حقن لGFP باستخدام المجهر الفلورسنت تشريح. وضع الأجنة، معربا عن GFP الخضراء الزاهية في جديد 100 × 15 ملم طبق بيتري مع E3 الأزرق.
- تغلي حل سهم من 1٪ انخفاض الاغاروز تذوب بإضافة 1 غرام من ذوبان منخفضة الاغاروز إلى 100 مل من E3 الأزرق. بعد استخدام الاغاروز، تغطية قارورة مع رقائق الألومنيوم. يبقى الحل الأسهم مفيد لمدة تصل إلى شهر واحد.
- قسامة 3 مل من آغار ذاب في أنبوب ثقافة 17 × 100 ملم. إبقاء الحارة الاغاروز عن طريق وضع أنبوب الثقافة في 42 ° C حمام الماء لتصبح جاهزة للاستخدام. يعد حل 15 ملم تريكين في الماء منزوع الأيونات لتخدير الأجنة الزرد 36.
ملاحظة: إذا كان المطلوب تصوير في نقطة زمنية سابقة، يمكن انخفض تركيز أجار ما يصل الى 0.3٪ 39. - تقديم 15 ملي تريكين والأجنة فرزهم، وانخفاض الاغاروز ذوبان، E3 الأزرق، و35 ملم الزجاج ساترة طبق ثقافة أسفل إلى مجهر الضوء تشريح. إزالة بعناية المشيماء الجنين مع # 5 ملاقط. هل هذا لمدة ثلاثة أجنة.
- وضع الأجنة dechorionated في وعاء منفصل ليتم تخدير. وكثيرا ما يستخدم غطاء الطبق ساترة القاع لهذا الغرض. باستخدام ماصة نقل، إضافة ثلاث قطرات (حوالي 150 ميكرولتر)من 15 ملي تريكين على طبق من 5 مل E3 الأزرق (في حالة استخدام غطاء ساترة طبق السفلي) أو حتى الأجنة تم تخدير بما فيه الكفاية. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة 3-4 قطرات (حوالي 150 - 200 ميكرولتر) من 15 ملي حل تريكين إلى 1٪ أنبوب الاغاروز ذاب.
- باستخدام ماصة P200 مع 1 سم من طرف ماصة قطع. نقل الأجنة تخدير على طبق القاع ساترة. إزالة أي E3 الأزرق الزائد: حل تريكين.
- ببطء إضافة 5-10 ميكرولتر من الاسعار المنخفضة للذوبان الاغاروز: حل تريكين على الأجنة، والحفاظ على كل قطرة منفصل لضمان الأجنة لا ينجرف عن طريق الخطأ بالقرب من بعضها البعض.
تحذير: إذا كان الاغاروز دافئة جدا، فإنه سوف يضر الجنين. درجة حرارة جيدة للحفاظ على أجار في غير 42 درجة مئوية. - باستخدام 21 G 1 ½ إبرة، توجيه بلطف الجنين في الاغاروز إلى الموضع المطلوب. عند استخدام مجهر مقلوب للتصوير مرور الزمن، توجيه المنطقة ذات الاهتمام (ROI) أقرب إلى ساترة وقت possibجنيه.
ملاحظة: لأغراض عامة، ومنطقة ذيل تقدم سهولة التوجيه وضوح بسبب رقيقة نسبيا الأنسجة (الشكل 1A). الأنسجة الأخرى، مثل الطبقة الظهارية المحيطة صفار البيض وزعنفة طيات، ويمكن استخدامها 28،29. هذه الأنسجة توفر وضوح، ولكن هذه المناطق ليست سوى عدد قليل من طبقات الخلايا سميكة. لغرض هذا البروتوكول، فإنه من المفيد لصورة المنطقة الذيل للحصول على أكبر عدد ممكن من انقسامات الخلية ممكن. - السماح لدقائق قليلة لتجميد جزئي للأجار. استخدام إبرة لكسر بعيدا قطعة صغيرة من أجار لاختبار التصلب لها. عندما قطعة من أجار يمكن سحبها بعيدا عن الهبوط، انتقل إلى الخطوة التالية.
- تغطية ساترة كامل مع انخفاض أجار ذوبان تشكيل القبة على الأجنة المضمنة. السماح للأجار ليصلب قبل أن ينتقل إلى صحن للتصوير متحد البؤر (الشكل 1A).
- أثناء عملية التصلب أجار (يأخذ حوالي 10 دقيقة)، وإعداد 3 مل سحل و E3 الأزرق مع خمس قطرات من (حوالي 250 ميكرولتر) 15 ملي تريكين لتوضع على الأجنة جزءا لا يتجزأ من خلال التصوير.
4. 5D متحد البؤر التصوير من لايف الزرد الأجنة 40،41
ملاحظة: انظر أريجا 40 و 41 اوبراين للحصول على تفاصيل حول كيفية تنفيذ 5D التصوير باستخدام أنظمة متحد البؤر الأخرى. لZ-الفاصلة، Z المكدس، Z-العمق، الفاصل الزمني، وتعريفات 5D انظر الشكل 1C.
- فتح برامج التصوير وتعيين المجهر ل60X NA 1.4 عدسة الهدف. تطبيق زيت الغمر إلى عدسة موضوعية ووضع الطبق الثقافة في حامل الشرائح على المسرح المجهر. باستخدام وحدة تحكم محور ومركز جنين الفائدة فوق عدسة موضوعية وتقديم عدسة الهدف التصاعدي لتلبية الطبق الثقافة.
- انقر على أيقونة العين قطعة والتحول إلى مرشح GFP على المجهر. التركيز على العائد على الاستثمار. التركيز على الأنسجة الأقرب إلى ساترة وسffer أفضل نتائج التصوير.
- إزالة التعشيق. اختيار القنوات GFP وmCherry (قبل مجموعة موجات في مجال البرمجيات) وتعيين خط الخيار إلى وضعها الطبيعي في المتوسط.
- استخدام "التحكم عرض / شراء / A1 مسح منطقة" الأمر لفتح أداة A1 مسح المنطقة.
- بدء المسح الضوئي. باستخدام وحدة تحكم محور، وضع الجنين بحيث يتم تعبئة منطقة المسح الضوئي مع أكبر قدر من الزرد وقت ممكن. قوة الليزر ليست في حاجة إلى أن يكون الأمثل في هذه النقطة. خفض قوة الليزر لتجنب photobleaching من غير الضروري.
- استخدام "التحكم عرض / شراء / شراء ND" الأمر لفتح لوحة التحكم اكتساب ND.
- بدء المسح الضوئي لتعيين المعلمات Z-المكدس. تعيين الحد الأعلى Z كومة إلى حيث الخلايا ليست في التركيز والحد الأدنى إلى حيث الخلايا لم تعد مرئية. السماح لمساحة 3 ميكرون فوق عينة للنمو وحركة الخلية، التي قد توسع في مجال التصوير. ض المكدس للالأرقام الواردة في هذا المواليةغطت tocol لZ-عمق 40 ميكرون في ذيل الجنين.
- تعيين حجم الخطوة زي الفاصل إلى 2 ميكرون. في المتوسط، خلية هي 10 ميكرون في القطر. ول2 ميكرون سوف تنتج خمس فترات خلال تصوير البيانات ليتم تحليلها لكل خلية.
ملاحظة: عمق للصورة التي يمكن الحصول عليها تعتمد على الفاصل الزمني Z. وضحى Z قرار للحصول على عمق الشامل في البعد Z من أجل صورة عن العديد من الخلايا التي تمر الانقسام ممكن (كبير Z-العمق). معكوس هو الصحيح، في ذلك، من خلال خفض حجم الخطوة، واكتسبت Z القرار، في حين يتم التضحية Z عمق (صغير Z-العمق). - ضبط قوة صورة ليزر، ذات الجهد العالي، ومستويات تعويض. لالتجارب أثبتت في هذا البروتوكول، واستخدام القوة ليزر التالية، ذات الجهد العالي، ومستويات المحددة على الصعيدين المقابلة، على التوالي، للقناة GFP تعويض. 2-5، 120-140، و-9 إلى -11. للقناة mCherry، واستخدام القوة ليزر التالية، ذات الجهد العالي، ومستويات، على التوالي تعويض. 3-6، 120-140، و-3 ل-8. مرة واحدة يتم تعيين المعلمات، اغلاق الفحص لمنع التعرض ليزر غير الضرورية التي قد تسبب الضيائية وphotobleaching من العينة.
- حدد رمز المتوسط خط 2X. "لا المتوسط" تنتج صورة مشوشة في حين أن "خط 4X المتوسط" يزيد بشكل كبير من وقت الفحص. استخدام المتوسط خط 2X يوفر أفضل جودة الصورة ووقت أسرع المسح الضوئي.
- تحديد الفاصل الزمني والمدة الزمنية المناسبة اللازمة للتجربة. لالانقسامات من النوع البري، فترات زمنية لمدة دقيقتين لمدة 2 ساعة هو أفضل لتحديد مدة الإنقسامية (المستخدمة في أرقام 1، 2، 3A، و3B). الانقسامات التي تنشط حاجز الجمعية المغزل لمدة أطول من 30 دقيقة هي أكثر ملاءمة لمدة خمس فترات دقيقة لمدة أربعة ساعة من أجل الحفاظ على مضان كما هو موضح في الشكل 3C.
- ضع علامة في المربع "حفظ إلى ملف" واسم الملف لحفظ الملف تلقائيا كما يتم الحصول عليه. الاختيار المزدوج جميع سنويايتم تعيين rameters بشكل صحيح وضرب "بدء تشغيل".
- بعد الاستحواذ الكامل، لعرض ملف في شكل ثلاثي الأبعاد، انقر على أيقونة عتبة حجم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل (2) القدرة على مراقبة العديد من الانقسامات الخلوية باستخدام طريقة عرض حقل واسع من AB البرية من نوع الذيل الزرد. يتم تصوير أكثر من سبع خلايا الإنقسامية في إطار زمني 14 دقيقة (فيلم 1). خلال العامين ساعة الوقت طبعا، تم القبض على أكثر من 40 أحداث الإنقسامية. في المتوسط، لوحظت 50 تقسيم الخلايا في AB و 30 تقسيم الخلايا في أور ب الأجنة م / م (الشكل 2B). لحساب عدد الخلايا المصورة، نسبة الخلايا الإنقسامية إلى عدد من الخلايا المصورة تم حساب (الشكل 2C). وتشير هذه البيانات إلى أن ليس هناك عدد أقل من خلايا يمر الانقسام في أور ب الأجنة م / م (الشكل 2B) ولكن بأعداد أقل من الخلايا التي يجري تصويرها. إن القدرة على اكتساب عددا ملحوظا من إقامة مثل هذه الفعاليات تساعد في السلطة الإحصائية.
-together.within الصفحات = "1"> يوسع الشكل (3) على هذه التقنية لتشمل قياس مدة الإنقسامية. مرة واحدة يتم الحصول على جلسة مرور الزمن، خلية فردية يمكن تحليل المدة التي أمضاها في الانقسام لقرار ملائم باستخدام أداة التكبير (الشكل 3A، B). يتم احتساب مدة الإنقسامية يدويا عن طريق عد الكيفية التي تأخذ الكثير من فترات زمنية تصل انقسام الخلايا واحدة. ثم يتم ضرب عدد فترات زمنية قبل فترة من الزمن بين كل Z-المكدس. على سبيل المثال، في الشكل 3C، استغرق تقسيم حتى 12 فترات زمنية، وكان الفاصل الزمني بين كل Z كومة 2 دقيقة. وبالتالي، فإن تقسيم الوقت لهذه الخلية 24 دقيقة. متوسط AB الوقت البرية من نوع التقسيم هو 25 دقيقة و 58 دقيقة لaurB م / م (الشكل 3B). زمن الانقسام لفترة طويلة كما رأينا في aurB م / تشير م أن حاجز الجمعية المغزل لم يكن راضيا بسبب بقرات الخاطئةمرفقات tochore 1،2. إلقاء نظرة فاحصة على التكبير في البرية من نوع الأجنة، كل مرحلة الإنقسامية يمكن تمييزها (الشكل 3C، فيلم 2). وبالإضافة إلى ذلك، عيوب الإنقسامية يمكن ملاحظتها في aurB م / م الجنين والتي تشمل اعتقال الإنقسامية وفشلت السيتوبلازمي مما أدى إلى خلية binucleated وتشكيل لاحق من فئران (الشكل 3D، فيلم 3). هذا التكبير في التحليل تظهر العيوب الإنقسامية يدعم زيادة تقسيم الوقت المكتسبة في الشكل 3B.
مختلف غيرها من العيوب متنوعة الإنقسامية ومصير الخلايا التي يمكن مواجهتها واستكشافها في الشكل (4). هو موضح في esco2 + / م وesco2 الأجنة م / م. في الجنين esco2 + / م، ويتم التقاط الحركات كروموسوم الخاطئة ويمكن تعريفها بأنها خلل congressionالصورة. تحدث العيوب Congression عند إجراء إرفاق ملفات أنيبيب غير لائقة. وهذه العيوب يسبب فشل الكروموسومات إلى الهجرة نحو لوحة الطورية. يقترن الصبغي الشقيقة، يمكن تحديدها بشكل خاص في دقيقة 20 و 46، التي لم congressed نحو لوحة الطورية يمكن ملاحظة أولا في الدقيقة 14. طور الصعود بداية يفصل الصبغي شقيقة الانحياز في لوحة الطورية وكذلك الصبغي شقيقة يقترن إلى اليمين، لوحظ في الدقيقة 50. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ تشكيل النواة الصغرى ممكن تبقى هذه الصبغي شقيقة فصل معزولة خارج النواة (T = 50، الشكل 4A، فيلم 4). في الشكل 4B، هو تصور تقسيم متعدد الأقطاب (فيلم 5). وغالبا ما تحدث انقسامات متعددة الأقطاب المقرر أن التضخيم الجسيم المركزي، ولكن قد تحدث من خلال وسائل أخرى 42. في الشكل 4C، وهو م / خلية esco2 م توضح في البداية أخت من السابق لأوانه كروماتيدي separatأيون ودوران المغزل 9،43،44. مصير خلية أخرى أثبتت في هذه اللوحة هو جسر طور الصعود الذي إرفاق ملفات merotelic دون حل هي 45،46. جسر طور الصعود يمكن أن ينظر أولا في الدقيقة 62. ويبدو أن لونين إلى قبل الأوان decondense بينما الخلية يمر الانقسام السيتوبلازمي. كما يحدث الانقسام السيتوبلازمي، ثلم الانقسام يفتئت على الكروموسومات decondensed و، كما يحدث إنقطاع مفاجئ، يسحب مادة الكروماتين لتشكيل جسر طور الصعود (الشكل 4C، الفيلم 6). وإن لم يكن هو موضح هنا، من أجل تحديد مصير الخلوية، وتسجيل كل الانقسامات الإنقسامية في كل إطار ونوع من مصير خلية أنها تظهر. تقسيم عدد من الخلايا في كل مصير من قبل عدد من الانقسامات المسجلة وضرب من قبل 100 لحساب النسبة المئوية مصير الخلية.
الشكل 1: رسومات بروتوكول مخطط تفصيلي. (ا) (ب) رسم تخطيطي لعملية الجنين التضمين. يجب dechorionated الأجنة وحقن تخدير. ثم يتم نقل الأجنة إلى صحن ساترة القاع وتتم إزالة الزائد E3 الأزرق. يستخدم منخفض أجار تذوب في إنشاء القباب منفصلة تغطي كل جنين. توجيه الأجنة حتى الذيل هو الأقرب إلى ساترة. الانتظار لمدة دقيقة قبل أن يضيف أجار تغطية ساترة بأكملها. انتظر حتى يتم طدت أجار قبل أن ينتقل إلى صورة. (C) رسم تخطيطي لتحديد شروط Z-الفاصلة، Z المكدس، Z-العمق، الفاصل الزمني، المدة الزمنية و5D التي يتم استخدامها في البروتوكول والمناقشة. ويعرف Z-الفاصلة والمسافة بين كل صورة كما يتحرك المجهر أعمق في عينة لإنشاء Z-المكدس. Z-المكدس جميع الصور التي التقطت من خلالعينة في تعريف Z-الفاصلة. المسافة المقطوعة في Z كومة تحدد Z-العمق. الفاصل الزمني هو مقدار الوقت بين Z كومة واحدة والقادم Z المكدس لخلق صورة مرور الزمن. المدة الزمنية هو المبلغ الإجمالي من الوقت المستخدم إلى الصورة. ويعرف 5D كما أبعاد X، Y، Z، والوقت، وانبعاث الفلورسنت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الوقت الفاصل بين التصوير يلتقط الأحداث الإستوائي متعددة في الأجنة الزرد لايف. (A) اللقطات الوقت الفاصل بين من تجربة التصغير في AB النوع البري، 24 HPF الزرد تظهر عدة أحداث الإنقسامية. تشير العلامات النجمية نحو سبع خلايا في الانقسام. ر = الوقت المنقضي في دقيقة. شريط مقياس = 5 ميكرون. (ب) عدد م الإنقساميةLLS لوحظ في AB وaurB م / م ذيول الزرد في 24 HPF. يعني ± الحادي والعشرين. ديف.، ن = 3 أجنة / النمط الجيني. (C) ونسبة الخلايا الإنقسامية في العدد الكلي للخلايا في AB وaurB م / م ذيول الزرد في 24 HPF. يعني ± الحادي والعشرين. ديف.، ن = 3 أجنة / النمط الجيني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. خلية فردية تحليل يلتقط كل مرحلة الميتوزى ومدة الإستوائي. (أ) خلية مختارة من وجهة نظر حقل واسع من AB النوع البري، 24 HPF الزرد الجنين هو مبين في الشكل 2A. ويلاحظ (ب) وقت شعبة AB وaurB م / م الخلايا وتحسب من استنتاج الف الغلاف النوويakdown (نب) في الملاحظة الأولى من لونين مكثف في خلية لتشكيل خليتين ابنة الجديدة. ن = 3 أجنة / الوراثي، ن = 66 الشعبتين لAB، ن = 29 الشعبتين لaurB م / م ***، ف قيمة <يتم اقتصاص 0.001. (C) AB خلية من النوع البري لتصور تطور المرحلة من خلال الانقسام . ر = دقيقة. شريط مقياس = 5 ميكرون. (D) aurB م / م يتم اقتصاص خلية لتصور تطور الإنقسامية من خلال الانقسام الذي يتضمن اعتقال الإنقسامية مما أدى إلى فشل السيتوبلازمي وتشكيل النويات. وتشير السهام نحو النويات. ر = الوقت المنقضي في دقيقة. مقياس شريط = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4).واحد خلايا الحية التصوير يلتقط العيوب الإستوائي متعددة ترتبط كروموسوم الفصل والشعبة في الميتوزى المسخ الزرد. (أ) صورة من خلية تمر العيوب congression في الجنين esco2 + / م اقتصاص. السهم رقيقة يراقب كروموسوم اليسرى التي يتم سحبها مرة أخرى إلى لوحة الطورية. السهم سميكة يراقب كروموسوم الصحيح أن لا يتم سحبها مرة أخرى إلى لوحة الطورية والاستدلال لتشكيل النواة الصغرى. يظهر السهم المزدوج فصل كروموسوم الصحيح الذي لم المؤتمر في بداية طور الصعود. إدراجات تظهر التكبير في وجهات النظر من الكروموسومات التي فشلت في المؤتمر. تم اقتصاص الأشكال وسطوع تعزيز لتحسين التصور. تمت إزالة CAAX مضان لتصور الكروموسومات بشكل أكثر سهولة. شريط مقياس = 5 ميكرون. (ب) صورة من خلية اقتصاص تمر اعتقال الإنقسامية أن يؤدي إلى تقسيم متعدد الأقطاب في esco2 + / م الجنين. شريط مقياس = 5 ميكرون. (ج) والصورة التي تم قصها من خلية تمر التعب التماسك مما أدى إلى تشكيل جسر طور الصعود يراها موضوع مثل سحب بين اثنين من نوى لاحظ الأقواس. شريط مقياس = 5 ميكرون. ر = الوقت المنقضي في دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1. انقسامات الخلية متعددة يمكن تصور في وجهة نظر واسعة للجنين الزرد حقن من النوع البري (انقر بالزر الأيمن للتحميل).
يمكن بسهولة تصور فيلم 2. مراحل الانقسام في البرية من نوع الجنين الزرد (ص آيت انقر للتحميل). ويستدل انهيار المغلف النووي بظهور عدم انتظام نواة والعائدات نحو congression من الصبغي شقيقة لتشكيل لوحة الطورية . يحدث الفصل بين دقيقة وينتج خليتين ابنة الجديدة.
فيلم 3. تصوير مباشر من aurB م / م الجنين يكشف كروموسوم ملكة جمالegregation، فشل السيتوبلازمي، وتشكيل النويات (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). ويستدل انهيار المغلف النووي بظهور عدم انتظام النواة، الكروموسومات مبعثر إلى أقطاب المعاكس غير قادرة على تشكيل لوحة الطورية المناسبة، والشروع في تناوب على محور يمتد الانقسام الوقت للخلية. لا يحدث الانقسام السيتوبلازمي مما أدى إلى خلية 4N والنويات المتعددة.
ويلاحظ فيلم 4. عيوب Congression في جنين esco2 + / م (انقر بالزر الأيمن للتحميل). ويستدل انهيار المغلف النووي بظهور عدم انتظام النواة. بعد أن يتم تشكيل لوحة الطورية، وعدد قليل ومؤشراتالصبغيات المفردة مبعثر إلى جانبي. يتم سحبها واحد كروموسوم فردي قبالة إلى اليسار في النهاية إلى لوحة الطورية في حين أن كروموسوم إلى اليمين لا يزال خارج لوحة الطورية ويمكن أن ينظر إلى فصل الكروماتيدات الشقيقة في بداية طور الصعود. الخلية يسلك وقت تقسيم لفترة طويلة ولكن الانقسامات في نهاية المطاف مع تشكيل النواة الصغرى المحتملين.
فيلم 5. لوحظ انقسام متعدد الأقطاب في esco2 + / م الجنين (انقر بالزر الأيمن للتحميل). ويستدل انهيار المغلف النووي بظهور عدم انتظام نواة ثم دمج الكروموسومات لتشكيل indicativ Y-شكل(ه) من أقطاب 3 المغزل. الخلية يسلك وقت تقسيم لفترة طويلة ولكن يقسم في نهاية المطاف إلى 3 خلايا ابنة.
فيلم 6. أخت من السابق لأوانه لوحظ الفصل كروماتيدي وتشكيل جسر طور الصعود في esco2 م / م الجنين (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). ويستدل انهيار المغلف النووي بظهور عدم انتظام نواة ثم الكروموسومات مبعثر في جميع أنحاء الخلية غير قادرة على تشكيل لوحة الطورية المناسبة. لونين decondenses قبل الانقسام السيتوبلازمي وكما تنقسم فيها الخلية، ويخلق جسر طور الصعود بين خليتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام هذا الأسلوب يسمح احد لاستنتاج انهيار النووي المغلف، وتشكيل لوحة الطورية بواسطة إرفاق ملفات-أنيبيب الحيز الحركي، والفصل بين الصبغي الشقيقة لتشكيل لجنتين خلايا جديدة في الجسم الحي وبطريقة تعتمد على الوقت. القدرة على مراقبة الانقسام في الزرد هو مفيد على عينات الثابتة وأنظمة زراعة الخلايا ليتم تصوير الخلايا في علم وظائف الأعضاء الطبيعي، والأنسجة شفافة والذي يسمح لالبروتينات الفلورية لاستخدامها، وتطوير سريع نسبيا، والوقت الفاصل بين التصوير يمكن الحصول عليها. ويقتصر استخدام الزرد الكبار لهذا البروتوكول نظرا لمحدودية Z-العمق التي يمكن الحصول عليها بسبب الأنسجة سمكا ليس هذا هو الجلد أو العينين. بينما الحيوانات المعدلة وراثيا معربا عن H2A.F / Z-EGFP وmCherry-CAAX يمكن أن تستخدم لنفس الغرض، وتعدد وسهولة حقن مرنا في الزرد متحولة مختلف هو مفيد على الصلبان الوراثية. في الحالات التي يكون فيها تحليل الإنقسامية هومطلوب في ثلاثة أيام بعد الإخصاب (DPF) أو الأجنة في وقت لاحق، فإن الحيوانات المعدلة وراثيا تكون ضرورية بسبب نصف العمر من الحمض النووي الريبي في هذا الحي التي تشهد نموا سريعا.
البروتينات الفلورية أخرى لتصور الانقسام قابلة في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، H2B-GFP مرنا هو بديل لH2A.F / Z-EGFP لونين، ويوفر وضع العلامات مماثل. البروتينات الفلورية الموسومة الأخرى التي يمكن أن تستخدم في هذه التقنية تشمل POM121، centrin، EB1، Hec1، وEMTB التي من شأنها أن تسمح ليعيش التصوير في جنين من الأنابيب الدقيقة الغلاف النووي، مريكز، بالإضافة إلى نهاية، الحيز الحركي، والأنابيب الدقيقة، على التوالي 32،47-51.
هذا البروتوكول لديه العديد من الخطوات التصوير الأساسية التي يجب أن يتم تنفيذ لتحقيق نتائج جيدة: 1) تأكد لتحسين نوعية مرنا والتركيز لانتاج ألمع مضان وعدم سمية ممكن. والمزيد من مضان يؤدي إلى الإقلال من التعرض ليزر، وبالتالي، أقل photobleaتشينغ والضيائية. 2) الجنين يجب تخدير كامل وآمن في أجار. والحركات الطفيفة يغير النتائج ويمكن أن تدمر التجربة. 3) يجب أن يكون تركيز أجار المناسب للمرحلة الجنين المراد تصويرها. في 24 HPF وأبعد من ذلك، 1٪ تذوب منخفض الاغاروز مناسب. إذا التصوير في 12 HPF أو في وقت سابق، يجب استخدام الحل الاغاروز 0.3٪ 39. 4) يجب أن يكون العائد على الاستثمار في جنين أقرب إلى ساترة وقت ممكن. هذه الخطوة لا يحد واحد لتصوير الذيل. عيون والجلد والمنطقة الظهرية، صفار البيض، وأضعاف الزعانف هي أمثلة من المجالات الأخرى التي يمكن أن تستخدم هذا البروتوكول.
الوقت هو العامل الحاسم الذي يفصل بين هذا البروتوكول من التصوير الثابت الأجنة أو الأنسجة. عند إعداد Z المكدس، Z-الفاصل، الفاصل الزمني الفاصل بين، ومدة مرور الزمن، من المهم أن نأخذ في الاعتبار سياق التجربة (الشكل 1C). وانقسام الخلايا من النوع البري عادة ما تستغرق حوالي 25 دقيقة في 24 HPF. في الهو سبيل المثال، أثبت 2 ميكرومتر Z-الفاصلة تغطي 40 ميكرون من الأنسجة في Z المكدس، مع فاصل زمني لمدة دقيقتين لمدة ساعة فعالة. وعلاوة على ذلك، في الأجنة مع الانقسام المعيب، والخلايا في اعتقال الإنقسامية من المرجح أن تكون موجودة، وزيادة جذريا مرات انقسام الخلايا. للحصول على الانقسامات كاملة متعددة، ينبغي زيادة المدة الزمنية، أي من 2 ساعة إلى 4 ساعات. واكتساب الوقت الطويل سوف تعرض العينة لمزيد من السلطة ليزر وتزيد من خطر photobleaching من والضيائية. في هذه الحالة، ينبغي زيادة الفاصل الزمني بين كل Z-المكدس. سيتم التضحية الحركات كروموسوم الحيوية عن طريق زيادة الفاصل الزمني بين Z-المداخن، ولكن اكتساب المدة الزمنية. وهذا أمر ضروري عند التصوير الانقسامات الخلوية التي قد تستمر أكثر من ساعة.
على الرغم من لم تناقش بشكل مباشر، وهذا البروتوكول يمكن أن يكون الأمثل للحصول على صورة دقة أعلى في Z-الطائرة إلى تصور أكثر دقة الفردية مو كروموسومvements. على سبيل المثال، في الشكل 4A لوحظ اثنين من الكروموزومات missegregated. الكروموسوم إلى اليمين (لاحظ السهم سميكة) هو مشرق في البداية وتحت المجهر ولكن يخفت في الأطر القليلة الماضية. مع 2 ميكرومتر Z-الفاصلة، الكروموسوم uncongressed يقع في بين Z-الفاصلة. التقاط حركات دقيقة والأحداث كروموسوم فريدة ويمكن تحقيق ذلك عن طريق زيادة الدقة في الطائرة Z. للقيام بذلك، في التكبير على خلية فردية باستخدام أداة A1 مسح المنطقة. عند إعداد معلمات كومة Z، استخدم مسافة أصغر زي الفاصل. مجموعة الموصى بها هي 0،5-1 ميكرون. وبالإضافة إلى ذلك، خفض الفاصل الزمني بين كل كومة Z سيخلق تنقل أكثر سلاسة بين كل فترة زمنية، أي من اثنين من دقيقة إلى 30 ثانية - 1 دقيقة. التحذير واحدة لهذا النوع من التصوير هو محدود Z-العمق التي يمكن تحقيقها. ويرجع ذلك إلى أصغر Z-الفاصل والفاصل الزمني، سوف يتعرض المزيد من الأنسجة لأشعة الليزر في إطار زمني أصغر. للتغلب على هذا، SMألير المدة الزمنية يمكن استخدامها. ولكن هذا يعتمد أيضا على مدى فترة طويلة الباحث يرغب في التقاط الانقسامات.
وقياسا على ذلك يمكن أن يساعد مع هذه التعديلات هو التفكير في Z كومة كما الأكورديون. المسافة بين كل طوى من الكير هو Z-الفاصلة وتمثل العمق Z من طول الأكورديون. في المثال حيث أن المرء لا ترغب في أن تتراكم أي التعرض أكثر ليزر للعينة، فيما يمتد الأكورديون (يزيد Z-العمق)، يجب أن المسافة بين الطيات من الكير (Z-فاصل) زيادة أيضا. معكوس هو الصحيح في ذلك مثل عقود الأكورديون، يقلل من Z-العمق. الطيات العقد منفاخ كذلك، الموافق انخفاض في Z-الفاصلة. هذا القياس يمكن تطبيقها على عينات الثابتة والحية. يتم زيادة التعقيد في هذا البروتوكول عندما يضاف الوقت للمعادلة. هناك كمية محدودة من الوقت الذي الأكورديون يمكن أن تمتد أو التعاقد الأكورديون. هذا تمثيلا ونهاية الخبر الفاصل الزمني. من أجل تغطية أكثر من بعد (Z-العمق) يجب أن الفاصل الزمني زيادة. كذلك، من أجل الاستماع إلى الموسيقى، لا بد من الاستماع لفترة أطول من الوقت (المدة الزمنية) ووفقا لهذا البروتوكول، من أجل أن يشهد المزيد من الانقسامات الخلوية، يجب أن المدة الزمنية زيادة. وثمة عامل يضاعف أن نأخذ في الاعتبار هو أن المزيد من الموسيقى التي لعبت، والمزيد من التعب والأكورديون. هذا هو مماثل إلى البعد النهائي، مضان. تعرض أكثر من ليزر يتم إعطاء عينة، والمزيد من photobleaching من والضيائية (التعب) يصبح قضية.
وباختصار، تفاصيل هذا البروتوكول طريقة لتصور الانقسام في جنين الزرد يعيش ينطبق على تحليلات مختلفة؛ 1) تقسيم عدد 2) تقسيم الوقت 3) مصير الانقسام و4) عالية الدقة ديناميكية لونين. إمكانيات متعددة لتصور مكونات الإنقسامية تتراوح من المرفقات-أنيبيب الحيز الحركي لالمركزيه ديناميات يمكن تطبيقها. الجمع بين قدرةوالانقسام التصوير في الجسم الحي مع التطورات الحديثة في تحرير الجينوم في الزرد تجعل من السهل لتوليد المسوخ في مختلف جوانب الانقسام لنموذج الأمراض التي تصيب البشر في كائن فقاري 25،26،52-56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N.
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A.
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J.
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
