Abstract
Mitose is essentieel voor groei en differentiatie organismal. Het proces is zeer dynamisch en vereist besteld gebeurtenissen om een goede chromatine condensatie, microtubule-kinetochoor gehechtheid, chromosoom segregatie en cytokinese bereiken in een klein tijdsbestek. Fouten in het delicate proces kan leiden tot menselijke ziekte, geboorteafwijkingen en kanker. Traditionele benaderingen onderzoek naar menselijke mitotische ziektebeelden zijn vaak afhankelijk van celkweek systemen, die de natuurlijke fysiologie en ontwikkelingsstoornissen / weefsel-specifieke context voordelig ontbreekt bij het bestuderen van ziekten bij de mens. Dit protocol overwint vele hindernissen door het verstrekken van een manier om te visualiseren, met een hoge resolutie, chromosoom dynamiek in een gewervelde systeem, de zebravis. Dit protocol zal detail een aanpak die kan worden gebruikt om dynamische beelden van delende cellen, waaronder verkrijgen: in vitro transcriptie, zebravis fokken / verzamelen, embryo inbedding en time-lapse imaging. Optimalisatie en modifnicatieorganisatie van dit protocol worden ook onderzocht. Met behulp van H2A.F / Z-EGFP (labels chromatine) en mCherry-CAAX (labels celmembraan)-mRNA geïnjecteerde embryo's, mitose in AB wild-type, auroraB hi1045 en esco2 hi2865 mutant zebravis wordt gevisualiseerd. Hoge resolutie live-imaging in de zebravis maakt het mogelijk om meerdere mitoses observeren om statistisch kwantificeren mitotische defecten en de timing van de progressie van de mitose. Bovendien, de observatie van kwalitatieve aspecten die oneigenlijk mitotische processen (dat wil zeggen, congression gebreken, missegregation chromosomen, etc.) en oneigenlijk chromosomale uitkomsten (dwz, aneuploïdie, polyploïdie, micronuclei, etc.) definiëren in acht worden genomen. Deze test kan worden toegepast voor de waarneming van weefseldifferentiatie / ontwikkeling en vatbaar is voor het gebruik van mutante zebravis en farmacologische middelen. Visualisatie van de manier waarop defecten in mitose leiden tot kanker en ontwikkelingsstoornissen zal sterkverbeteren begrip van de pathogenese van de ziekte.
Introduction
Mitose is een kritische cellulaire proces dat cruciaal is voor groei, differentiatie en regeneratie in een levend organisme. Bij nauwkeurige opstelling en replicatie van DNA in interfase wordt de cel klaargemaakt splitsen. De eerste fase van mitose, profase, geïnitieerd door activering van cycline B / Cdk1. Profase wordt gekenmerkt door condensatie van chromatine materiaal in chromosomen. Kernenvelop doorslag optreedt bij de overgang tussen profase en prometaphase. In prometafase, centrosomes, het kiemvormende centrum voor spindle vorming, beginnen te migreren naar tegengestelde polen terwijl de uitbreiding van microtubuli op zoek kinetochoor gehechtheid. Na bevestiging, conversies tot eind-on attachment microtubuli en trekkrachten oriënteren de chromosomen vormen van een metafaseplaat 1. Als alle chromosomen correct zijn aangesloten, wordt de spil montage checkpoint tevreden, cohesin ringen die de zusterchromatiden samen worden gesplitst, en microtubules in te korten om zus te trekkenchromatiden naar tegengestelde polen tijdens anafase 2,3. De eindfase telofase, omvat verlenging van de cel en hervorming van de kern envelop rond de twee nieuwe kernen. Cytokinese het splitsingsproces door het scheiden van het cytoplasma van de twee nieuwe dochtercellen 4-6 voltooid. Wijziging van de belangrijkste mitotische trajecten (dat wil zeggen, assemblage van de spoel checkpoint, centrosome duplicatie, zuster-cohesie, enz.) Kan leiden tot metafase arrestatie, missegregation van de chromosomen en genomische instabiliteit 7-10. Uiteindelijk defecten in trajecten beheersen van mitose kunnen ontwikkelingsstoornissen en kanker, noodzakelijk visualisatie van mitose en de gebreken in een live, gewerveld dier, meercellig organisme 10-16 veroorzaken.
Zebravis embryo's dienen als een grote modelorganisme voor live-imaging als gevolg van de transparante weefsel, het gemak van micro-injectie, en een snelle ontwikkeling. Met behulp van de zebravis, de algemene doelstelling van dit manuscript is ombeschrijven een werkwijze voor levende 5D (afmetingen X, Y, Z, tijd en golflengte) beeldvorming van mitose 17 (figuur 1C). Het gebruik van mutante zebravis defectief in verschillende mitotische paden tonen de gevolgen van dergelijke defecten. Voor dit protocol, werden Aurora B en Esco2 mutanten gekozen om deze gebreken te illustreren. Aurora B is een kinase die deel uitmaakt van het chromosoom passagier complex (CPC) betrokken bij de vorming en spindel microtubuli bevestiging. Het is ook vereist voor splitsing furrow formatie in cytokinese 18,19. In de zebravis, Aurora B-deficiëntie leidt tot defecten in vore inductie, cytokinese, en chromosoom segregatie 20. Esco2, daarentegen, is een acetyltransferase dat essentieel is voor zuster-cohesie 21,22. Het acetyleert cohesin op de SMC3 gedeelte van de ring dus cohesin stabiliseren om een goede chromosoom segregatie te verzekeren bij de metafase-anafase transitie 23. Verlies van Esco2 in de zebravis leidt tot chromosome missegregation, voortijdige zusterchromatide scheiding, genomische instabiliteit, en p53-afhankelijke en onafhankelijke apoptose 24,25. Door de beschikbaarheid, auroraB hi1045 en esco2 hi2865 mutante zebravis (hierna aurB m / m en esco2 m / m, respectievelijk) gebruikt deze techniek 25-27 illustreren.
Koppeling confocale microscopie met TL-gelabelde cel machines heeft de onderzoekers in staat om te visualiseren chromatine en celmembraan dynamiek tijdens de mitose 25,28,29. Fluorescent-gemerkte histonen van oudsher gebruikt om chromatine te visualiseren. Histonen kerneiwitten uit vier paren (H2A, H2B, H3 en H4) die van het nucleosoom structuur die chromosomen 30 samenstelt zijn. Terwijl H2B is misschien wel de meest gebruikte histone voor fluorescerende eiwitten inmuis en celkweek, het gebruik van histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) heeft goed gebleken voor gebruik in de zebravis 31,32. Concanavaline A en caseïne kinase 1-gamma bijvoorbeeld lokaliseren aan het celmembraan en eerder zijn effectief in het visualiseren van de celmembraan in zee-egels en Drosophila 33,34 weergegeven. Andere studies hebben aangetoond dat de CAAX fluorescerend gemerkt eiwit labelt de celmembraan en succesvol in zebravis 31 was. CAAX is een motief dat door post-translationeel modificerende enzymen zoals farnesyltransferases en geranylgeranyltransferases wordt herkend. Wijzigingen van deze enzymen veroorzaken eiwitten membraangebonden lopen, waarbij het labelen van de celmembraan 35.
Door de voorgebruik met zebravis dit protocol kozen H2A.F / Z en CAAX om chromatine en het celmembraan label. Toepassing van deze methode kan de onderzoeker mitose controleren op individueel celniveau individuele chromosoom observerendynamiek, evenals gelijktijdig volgen meerdere celdelingen die invloed weefseldifferentiatie en ontwikkeling. Dit artikel zal zich richten op de beeldvorming van de dynamiek van chromosoom segregatie tijdens de mitose op het individuele celniveau. Binnen dit manuscript wordt de mogelijkheid om meerdere mitotische delingen waarnemen, berekenen divisie tijd, en het ontcijferen van de mitotische fenotypes worden geïllustreerd en besproken. Door deze parameters, fysiologisch relevante gegevens kunnen worden verzameld en toegepast op verscheidene ziektetoestanden die door mitotische afwijkingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro transcriptie
- Lineariseren pCS2-H2A.F / Z-EGFP en / of pCS2-mCherry CAAX-vectoren door NotI restrictie-enzym digest 31. Gebruik van een RNA in vitro transcriptie kit genereren 5 'afgedekte mRNA uit elke sjabloon, volgens het protocol van de fabrikant.
- Zuiver het capped mRNA met een zuiveringskit. Volg de instructies van de fabrikant. Elueer met RNase-vrij H2O
- Het gehalte aan RNA door absorptie bij 260 nm met een spectrofotometer. (OD 260 x verdunningsfactor x 40 gg / ml).
- Verdun het RNA 100 ng / ul per H2A.F / Z-EGFP en mCherry-CAAX met RNase-vrij H2O Als de RNA-concentratie te laag is, zal de fluorescentie verminderd of afwezig zijn. Brighter monsters zal de bezorgdheid over fototoxiciteit en fotobleken verminderen. Anderzijds kan teveel RNA toxisch zijn en / of kan uit doelwit effecten.
Opmerking: Bewaar de overgeblevengezuiverde mRNA in -80 ° C vriezer.
2. zebravis Breeding, Embryo Collection, en mRNA Injection 36-38
- Monteer kweekbakken met een barrière om de tank te scheiden in twee regio's en vul elk kweekbak met aquacultuur systeem water dat gebruikt wordt in de zebravis faciliteit.
- Om voortijdige kweken voor het fokken voorkomen, de nacht plaats twee mannetjesvissen aan één zijde van de barrière en twee vrouwelijke vissen aan de andere kant.
- De volgende dag ontdooien de eerder bereide mRNA mengsel op ijs. Vervang het water in de fokkerij tanks met verse aquacultuur systeem water en verwijder de barrières. Onmiddellijk na de barrières worden getrokken, verwarm een spuitgietmatrijs tot 28,5 ° C en het opzetten van de uitrusting voor micro-injectie.
Opmerking: Voor informatie over injectie matrijzen, verwijzen wij u naar Gerlach 36. - Eieren verzamelen om de 10 - 15 min met behulp van een theezeefje en spoel de eieren in een schone 100 x 15 mm petrischaal met E3 Blue (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% methyleenblauw). E3 Blue wordt gebruikt om schimmelgroei te voorkomen en te zorgen voor een goede ontwikkeling van larvale vis. Voor meer informatie over voortplanting en embryo's worden verzameld, verwijzen naar Gerlach 36 en Porazinkski 37.
- Embed eencellige embryo opgevoerd in een voorverwarmde spuitgietmatrijs en spuit het RNA in de dooier in de gewenste hoeveelheid embryo (figuur 1A). Account voor natuurlijke embryonale sterfte en onbevruchte embryo's door het uitvoeren van embryonale injecties op 15% meer embryo's dan nodig is voor het experiment. Voor aanvullende informatie over de micro-injectie van de zebravis embryo's, verwijzen wij u naar Gerlach 36 en Porazinkski 37.
LET OP: Voor het eerste gebruik van mRNA, het uitvoeren van een dosis-curve analyse om de optimale dosering voor fluorescentie en levensvatbaarheid (gedefinieerd als geen grove defecten in de ontwikkeling tot 5 DPF) voorafgaand aan het uitvoeren 5D beeldvorming te bepalen. 150-200 ng / ulgeïnjecteerd in embryo's is vaak de optimale concentratie, daarom is het een goed uitgangspunt voor de uiteindelijke concentratie. - Zorgvuldig te extraheren de geïnjecteerde embryo's uit de mal met behulp van een gemodificeerde 9 "glazen Pasteur pipet. Om de pipet te wijzigen, smelt het einde met behulp van een bunsenbrander totdat het een bal vormt.
- Plaats de geïnjecteerde embryo's in een 100 x 15 mm petrischaal in E3 Blue en huis in een 28,5 ° C incubator.
- Zes uur na de injectie, verwijder alle dode of onbevruchte embryo's uit de platen en voeg schoon E3 Blue. Het huis van de embryo's bij 28,5 ° C.
3. Voorbereiding and Embedding Live zebravis embryo's for Imaging (Figuur 1B)
- Twee uur voor beeldvorming, scherm de geïnjecteerde embryo's voor GFP met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop. Plaats helder groen-GFP tot expressie embryo's in een nieuwe 100 x 15 mm petrischaal met E3 Blue.
- Kook een voorraad oplossing van 1% low melt agarose door het toevoegen van 1 g low melt agarose tot 100 ml van de E3 Blue. Na gebruik van de agarose, hebben betrekking op de kolf in aluminiumfolie. De voorraad oplossing blijft nuttig voor maximaal een maand.
- Aliquot 3 ml van het gesmolten agar in een cultuur buis 17 x 100 mm. Houd de agarose warm door de cultuurbuis in een 42 ° C waterbad tot aan gebruik. Bereid een 15 mM tricaïne oplossing in gedemineraliseerd water om de zebravis embryo's 36 verdoven.
OPMERKING: Indien beeldvorming in eerdere tijdstippen gewenst, kan de concentratie van agar verminderd zo laag als 0,3% 39. - Breng de 15 mM tricaïne, gescreend embryo's, low melt agarose, E3 Blue, en een 35 mm glazen dekglaasje bodem cultuur schotel naar een dissectie lichtmicroscoop. verwijderen chorion de embryo's zorgvuldig met # 5 pincet. Doe dit voor drie embryo's.
- Plaats de dechorionated embryo in een afzonderlijke container worden verdoofd. Het deksel van het dekglaasje onderste schaal wordt vaak gebruikt voor dit doel. Met behulp van een overdracht pipet, drie druppels (ongeveer 150 pl)van 15 mM tricaïne de schaal van 5 ml E3 blauw (bij gebruik van het deksel van het dekglaasje onderste schaal) of tot embryo voldoende zijn verdoofd. Bovendien, voeg 3-4 druppels (ongeveer 150-200 pl) van 15 mM tricaïne oplossing van de 1% gesmolten agarose buis.
- Met behulp van een p200 pipet met 1 cm van de pipet tip afgesneden; overdracht van de narcose embryo's naar de-dekglaasje bodem schotel. Verwijder overtollig E3 Blue: tricaïne oplossing.
- Voeg langzaam 5-10 pl laag smeltpunt agarose: tricaïne oplossing via embryo's, waarbij elke druppel apart te zorgen voor de embryo's niet per ongeluk dicht drift elkaar.
Waarschuwing: Als de agarose te warm, zal het embryo aantasten. Een goede temperatuur de agar te handhaven op 42 ° C is. - Onder toepassing van een 21 G 1 ½ naald voorzichtig oriënteren het embryo in de agarose in de gewenste positie. Bij gebruik van een omgekeerde microscoop voor time-lapse imaging, oriënteren het interessegebied (ROI) zo dicht mogelijk bij het dekglaasje possible.
Opmerking: Voor algemene doeleinden, het staartgebied vereenvoudigd het oriëntatie en duidelijkheid door de relatief dunne weefsel (Figuur 1A). Andere weefsels, zoals de epitheellaag rond de dooier en vin vouwen, kan worden gebruikt 28,29. Deze weefsels bieden grote helderheid, maar deze gebieden zijn slechts een paar cellagen dik. Ten behoeve van dit protocol is het gunstig om het beeld staartgebied zoveel celdelingen mogelijk te verwerven. - Laat een paar minuten voor de gedeeltelijke stolling van de agar. Gebruik de naald om elkaar te breken een klein stukje agar om zijn stolling te testen. Wanneer een stuk agar weg van de daling kan worden getrokken, gaat u door naar de volgende stap.
- Bedek de hele dekglaasje met een lage melt agar vorming van een koepel over de embedded embryo's. Laat de agar te stollen alvorens het gerecht voor confocale beeldvorming (Figuur 1A).
- Tijdens (duurt ongeveer 10 min) de agar stollingsproces, voor te bereiden 3 ml of E3 blauwe oplossing met vijf druppels (ongeveer 250 ui) 15 mM tricaïne via ingesloten embryo's geplaatst tijdens beeldvorming.
4. 5D Confocale beeldvorming van live zebravis embryo's 40,41
OPMERKING: Zie Ariga 40 en O'Brien 41 voor meer informatie over het 5D beeldvorming uit te voeren met behulp van andere confocale systemen. Voor Z-interval, Z-stack, Z-diepte, tijd interval, en 5D definities zie figuur 1C.
- Open de imaging software en zet de microscoop om 60X NA 1.4 objectief. Solliciteer immersie olie aan de doelstelling lens en plaats de cultuur schotel in de dia houder op de microscoop podium. Met de asbesturing Centreer de embryo plaats boven de objectieflens en breng de objectieflens omhoog om de kweekschaal voldoen.
- Klik op het oog stuk en over te schakelen naar het GFP-filter op de microscoop. Focus op de ROI. Focussen op het weefsel dichtst bij het dekglaasje zal offer de beste beeldvormende resultaten.
- Verwijder de interlock. Selecteer de GFP en mCherry kanalen (vooraf ingestelde golflengten in software) en zet de lijn van gemiddeld optie om normaal.
- Gebruik "View / Acquisition Controls / A1 Scan Area" commando om het gereedschap A1 Scangebied openen.
- Te beginnen met scannen. Met de as controller plaatst het embryo waardoor het scangebied is gevuld met zoveel van de zebravis mogelijk. Het laservermogen hoeft niet optimaal op dit moment te zijn. Verlaag het laservermogen om onnodige fotobleken te voorkomen.
- Gebruik de "View / Acquisition Controls / ND overname" commando om de ND overname bedieningspaneel te openen.
- Beginnen met scannen naar de Z-stack parameters. Stel de Z-stack bovengrens waarbij de cellen niet in focus en ondergrens waarbij cellen niet meer toegankelijk. Zorgen voor een 3 urn ruimte boven het monster voor groei en cel beweging, die kan uitzetten in het beeldveld. De Z-stack voor de in deze pro cijferstocol onder een Z-diepte van 40 urn in het embryo staart.
- Stel de Z-interval stapgrootte tot 2 urn. Gemiddeld een cel 10 micrometer in doorsnede; derhalve 2 urn produceert vijf intervallen van beeldgegevens te analyseren voor elke cel.
OPMERKING: De diepte van de afbeelding kunnen worden verkregen afhankelijk van de Z interval. Z-resolutie wordt opgeofferd aan de totale diepte in de Z-dimensie te krijgen met het oog op het zo veel cellen ondergaan mitose mogelijk (grote Z-diepte). Het omgekeerde is waar, in dat, door de stap omvang afneemt, Z resolutie wordt verkregen, terwijl Z diepte wordt opgeofferd (kleine Z-diepte). - Pas de afbeelding laservermogen, HV, en offset niveaus. Voor de experimenten toonden in dit protocol, gebruikt u de volgende laservermogen, HV, en offset in te stellen op de overeenkomstige niveaus, respectievelijk voor het GFP-kanaal; 2-5, 120-140 en -9 tot -11. Voor de mCherry kanaal, gebruikt u de volgende laservermogen, HV, en offset niveaus, respectievelijk; 3-6, 120-140 en -3 naar-8. Zodra de parameters zijn ingesteld, schakelt u de scan om onnodige laser blootstelling die fototoxiciteit en fotobleken van het monster kan veroorzaken te voorkomen.
- Selecteer de middeling icoon 2x lijn. "No middeling" produceert een korrelige afbeelding terwijl "4x lijn van gemiddeld" drastisch verhoogt de scantijd. Het gebruik van 2x lijn middeling biedt de beste beeldkwaliteit en de snelste scantijd.
- Selecteer de juiste tijd interval en de tijdsduur die nodig is voor het experiment. Voor wildtype divisies, twee-minuten intervallen gedurende 2 uur is het beste voor het bepalen mitotische duur (gebruikt in figuren 1, 2, 3A en 3B). Scheidingen die de spileenheid checkpoint activeren langer dan 30 minuten zijn meer geschikt voor vijf minuten herhaald gedurende vier uur om fluorescentie te behouden zoals getoond in Figuur 3C.
- Vink het vakje "opslaan naar bestand" en de naam van het bestand om het bestand automatisch op te slaan als het wordt overgenomen. Double check alle parameters correct zijn ingesteld en druk op "start run".
- Na de overname is voltooid, wordt het bestand in een driedimensionaal formaat bekijken, klik op het icoon volume drempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont het vermogen om vele celdelingen behulp van een breed gezichtsveld van een AB wild-type zebravis staart observeren. Meer dan zeven mitotische cellen worden afgebeeld in een 14 min tijdsbestek (Film 1). Binnen de twee hr tijdsverloop, werden meer dan 40 mitotische gebeurtenissen vastgelegd. Gemiddeld werden 50 delende cellen waargenomen in de AB en 30 delende cellen in aur B m / m embryo (figuur 2B). Ter compensatie van de aantal cellen afgebeeld, de verhouding van mitotische cellen afgebeeld aantal cellen werd berekend (Figuur 2C). Deze gegevens suggereren dat er geen lager aantal cellen gaan door mitose in de aur B m / m embryo (figuur 2B) maar minder aantallen cellen worden afgebeeld. Het vermogen om een statistisch significant aantal gebeurtenissen zoals deze te verkrijgen zal helpen bij statistisch.
Figuur 3 een uitbreiding van deze techniek kwantificeren mitotische duur op te nemen. Zodra een time-lapse sessie wordt verkregen, kan een afzonderlijke cel worden geanalyseerd op tijd in mitose voldoende resolutie door het zoomgereedschap (figuur 3A, B). Mitotische duur wordt handmatig berekend door te tellen hoeveel tijdsintervallen nemen een celdeling. Het aantal tijdsintervallen wordt vervolgens vermenigvuldigd met de tijd tussen elke Z-stack. Bijvoorbeeld, in figuur 3C, de verdeling nam 12 tijdsintervallen en de tijd tussen elke Z-stack was 2 min. Daarom is de tijd divisie deze cel was 24 min. De gemiddelde AB wildtype divisie bedraagt 25 min en 58 min voor aurB m / m (Figuur 3B). Een langdurige divisie tijd gezien in de aurB m / m stelt de spileenheid checkpoint niet is voldaan gevolg van verkeerde kinetochore bijlagen 1,2. Het nemen van een kijkje op de ingezoomd wild-type embryo's, kan elke mitotische fase worden onderscheiden (figuur 3C, Movie 2). Daarnaast kunnen mitotische defecten worden waargenomen in de aurB m / m embryo dat mitose omvatten en mislukte cytokinese resulteert in een tweekernige cel en daaropvolgende vorming van micronucleus (Figuur 3D, Film 3). Dit ingezoomd analyse blijkt mitotische defecten steunt het toegenomen divisie tijd verworven in figuur 3B.
Diverse andere diverse mitotische afwijkingen en celtypes die zich kunnen voordoen zijn onderzocht in figuur 4; gedemonstreerd in de esco2 + / m en esco2 m / m embryo. Per esco2 + / m embryo, worden onjuiste chromosoom bewegingen opgevangen en kan worden gedefinieerd als defect congressions. Congression gebreken voordoen wanneer oneigenlijk microtubule bijlagen worden gemaakt. Deze defecten veroorzaken falen van de chromosomen te migreren naar de metafase plaat. Gepaarde zusterchromatiden, vooral identificeerbaar waren min 20 en 46, die niet congressed naar de metafase plaat eerst worden waargenomen bij min 14 Anaphase begin scheidt de zusterchromatiden uitgelijnd langs de metafase plaat en de gepaarde zusterchromatiden rechts, waargenomen bij minuut 50. Daarnaast is het mogelijk micronucleïvorming waargenomen als deze gescheiden zusterchromatiden buiten de kern (T = 50, figuur 4A, Movie 4) blijven geïsoleerd. In figuur 4B wordt een multipolaire verdeling gevisualiseerd (Film 5). Meerpolige verdelingen komen vaak door centrosome amplificatie, maar kan optreden door andere middelen 42. In figuur 4C, een esco2 m / m cel toont aanvankelijk premature zusterchromatidenuitwisseling separation en spil 9,43,44. Een ander lot van de cel aangetoond in dit paneel is een anafase brug waar merotelic bijlagen zijn onopgelost 45,46. De anafase brug kan voor het eerst te zien op minuut 62. De chromatine lijkt voortijdig decondenseren terwijl de cel wordt cytokinese ondergaat. Zoals cytokinese optreedt, de splitsing vore treft de decondensed chromosomen en afsnijding zoals optreedt, trekt de chromatine materiaal een anafase brug (Figuur 4C, Film 6) te vormen. Hoewel hier niet getoond, teneinde de cellulaire lot kwantificeren, geven alle mitotische delingen in elk frame en het celtype lot ze vertonen. Verdeel het aantal cellen in elke lot van het totale aantal verdelingen geregistreerd en vermenigvuldigen met 100 om het percentage te berekenen lot van de cel.
Figuur 1: Protocol Tekeningen Outline. (EEN) (B) Schematische tekening van het embryo inbedding proces. De geïnjecteerde embryo's moeten worden dechorionated en verdoofd. Embryo's worden vervolgens overgebracht naar het dekglaasje-onderste schaal en overmaat E3 Blue verwijderd. Lage smelt agar wordt gebruikt om afzonderlijke koepels die elk embryo te creëren. Waar zich het embryo, zodat de staart dichtst bij het dekglaasje. Wacht twee minuten voor het toevoegen van agar die het hele dekglaasje. Wacht tot de agar is gestold voordat hij naar beeld. (C) Schematische tekening aan de voorwaarden Z-interval, Z-stack, Z-diepte, tijdinterval, tijdsduur en 5D die worden gebruikt in het protocol en discussie definiëren. Z-interval is gedefinieerd als de afstand tussen de afbeeldingen door de microscoop beweegt dieper in de monsterhouder een Z-stack maken. Z-stack is allemaal van de genomen door middel van een fotomonster bij de bepaalde z-interval. De afstand in een Z-stack definieert de Z-diepte. Tijdsinterval de tijd tussen een Z-stack en de volgende Z-stack beeld time-lapse creëren. Tijdsduur is de totale hoeveelheid tijd die wordt gebruikt om de afbeelding. 5D wordt gedefinieerd als de afmetingen X, Y, Z, tijd en fluorescentie-emissie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Time-Lapse Imaging Vangt Multiple Mitotische Evenementen in een live zebravis embryo. (A) Time-lapse stills uit een uitgezoomd experiment in een AB wild-type, 24 HPF zebravis toont meerdere mitotische gebeurtenissen. Sterretjes wijzen op zeven cellen in mitose. t = tijd verstreken min. Schaal bar = 5 micrometer. (B) Het aantal mitotische ceLLS waargenomen in AB en aurB m / m zebravis staarten bij 24 HPF. Gemiddelde ± st. dev., n = 3 embryo / genotype. (C) De verhouding van mitotische cellen per totale aantal cellen in de AB en aurB m / m zebravis staarten bij 24 HPF. Gemiddelde ± st. dev., n = 3 embryo / genotype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Individuele Cell Analyse Legt Elke mitotische fase en mitotische Duur. (A) Een cel gekozen uit de brede gezichtsveld van AB wildtype, 24 HPF zebravis embryo figuur 2A. (B) Divisie tijd wordt genomen voor AB en aurB m / m cellen en berekend op basis van het afleiden van de nucleaire envelop breakdown (NEB) bij de eerste waarneming van gecondenseerde chromatine in een cel om vorming van twee nieuwe dochtercellen. n = 3 embryo / genotype, n = 66 afdelingen voor AB, n = 29 divisies voor aurB m / m, *** p-waarde <0,001. (C) AB wild-type cel wordt bijgesneden om de fase progressie door middel van mitose visualiseren . t = min. Schaal bar = 5 micrometer. (D) aurB m / m cel wordt bijgesneden tot progressie van de mitose door middel van mitose die mitotische arrestatie leidt tot cytokinese mislukking en de vorming van micronuclei omvat visualiseren. Pijlen wijzen in de richting van de micronuclei. t = tijd verstreken min. Schaal bar = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4.Single Cell Live-Imaging Legt Multiple Mitotische Gebreken in verband gebracht met Chromosome Segregatie en afdelingshoofd bij Mitotische Mutant Zebravis. (A) Een bijgesneden afbeelding van een cel ondergaat congression defecten in een esco2 + / m embryo. De dunne pijl bewaakt de linker chromosoom die terug wordt getrokken in de metafase plaat. De dikke pijl bewaakt de juiste chromosoom dat niet terug is getrokken in de metafaseplaat en afgeleid van een micronucleustest vormen. De dubbele pijl toont de scheiding van de juiste chromosoom dat niet deden congres in anafase begin. Inzetstukken tonen ingezoomd uitzicht op de chromosomen die niet aan het congres. Inzetstukken werden bijgesneden en de helderheid verbeterd voor een betere visualisatie. CAAX fluorescentie werd verwijderd om de chromosomen gemakkelijker te visualiseren. Schaal bar = 5 urn. (B) Een bijgesneden beeld van een cel mitose die resulteert in een multipolaire verdeling per esco2 ondergaan + / M embryo. Schaal bar = 5 urn. (C) Een bijgesneden beeld van een cel ondergaat vermoeidheid cohesie resulteert in anafase brugvorming gezien door de draadvormige trekken tussen de twee kernen aangeduid door de beugels. Schaal bar = 5 micrometer. t = verstreken tijd in min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1. Meerdere celdelingen kunnen worden gevisualiseerd in een weids uitzicht van een ingespoten wild-type zebravis embryo (klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Movie 2. Fasen van de mitose kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in een wild-type zebravis embryo (r echts klik om te downloaden). Kern envelop uitsplitsing is afgeleid door de onregelmatige verschijning van de kern en opbrengsten in de richting van congression van de zusterchromatiden een metafaseplaat vormen . Nauwkeurige scheiding optreedt en levert twee nieuwe dochtercellen.
Movie 3. Live-beeldvorming van aurB m / m embryo onthult chromosoom missenegregation, mislukte cytokinese, en de vorming van micronuclei (klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Kern envelop uitsplitsing is afgeleid door de onregelmatige verschijning van de kern, chromosomen verstrooien tegengestelde polen niet in staat om een goede metafaseplaat te vormen, en ga om te draaien op as die zich uitstrekt van de divisie tijd van de cel. Cytokinese treedt niet resulteert in een 4N cel en meerdere micronuclei.
Movie 4. Congression gebreken worden geconstateerd in een esco2 + / m embryo (klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Kern envelop uitsplitsing is afgeleid door de onregelmatige verschijning van de kern. Nadat de metafase plaat wordt gevormd, een paar indiindividuele chromosomen verstrooien naar beide kanten. Een individuele chromosoom weg aan de linkerkant is uiteindelijk terug getrokken in de metafaseplaat terwijl het chromosoom aan de rechterkant buitenkant van de metafaseplaat blijft en kan worden gezien scheiden zusterchromatiden bij het begin van anafase. De cel vertoont een verlengde divisie tijd, maar uiteindelijk verdeelt met potentiële micronucleïvorming.
Movie 5. Multi-polar divisie wordt waargenomen in een esco2 + / m embryo (klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Kern envelop uitsplitsing is afgeleid door de onregelmatige verschijning van de kern en vervolgens chromosomen fuseren tot een Y-vorm indicativ vormene van 3-spindle polen. De cel vertoont een verlengde divisie tijd, maar uiteindelijk verdeelt in 3 dochtercellen.
Movie 6. Voortijdige zusterchromatidenuitwisseling scheiding en de vorming anafase brug worden waargenomen in een esco2 m / m embryo (klik met de rechtermuisknop om te downloaden). Kern envelop uitsplitsing is afgeleid door de onregelmatige verschijning van de kern en vervolgens chromosomen verspreiden over de hele cel niet in staat om een te vormen juiste metafaseplaat. De chromatine decondenses voorafgaand aan cytokinese en als de cel deelt, creëert een anafase brug tussen de twee cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebruik van deze werkwijze kan men kernenvelop afbraak vorming van metafase plaat van microtubule-kinetochore attachments en scheiding van zusterchromatiden afleiden twee nieuwe cellen in vivo en in een tijdsafhankelijke wijze te vormen. Het vermogen om mitose observeren zebravis is voordelig ten opzichte van vaste monsters en celkweek systemen omdat de cellen worden afgebeeld in de natuurlijke fysiologie, het weefsel is transparant waardoor voor fluorescerende eiwitten voor gebruik, ontwikkelen zij relatief snelle en time-lapse imaging kunnen worden verworven. Gebruik van volwassen zebravis voor dit protocol wordt beperkt door de beperkte Z-diepte die verschuldigd kunnen worden aangevuld om te dikker weefsel dat niet de huid of ogen. Terwijl transgene dieren tot expressie H2A.F / Z-EGFP en mCherry-CAAX kan worden gebruikt voor hetzelfde doel, de veelzijdigheid en het mRNA injecties in verschillende mutante zebravis is voordelig ten opzichte van genetische kruisingen. In situaties waarin mitotische analysevereist drie dagen na de bevruchting (DPF) of hoger embryo, zouden transgene dieren noodzakelijk vanwege de halfwaardetijd van RNA in deze snel ontwikkelende organisme.
Andere fluorescerende eiwitten voor het visualiseren van mitose vatbaar zijn voor dit protocol. Bijvoorbeeld, H2B-GFP-mRNA is een alternatief voor H2A.F / Z-EGFP voor chromatine en gelijksoortige kenmerken. Andere fluorescerend gemerkte eiwitten die kunnen worden gebruikt in deze techniek omvatten POM121, centrin, Eb1, Hec1 en EMTB respectievelijk mogelijk zou maken live-embryo beeldvorming van de nucleaire envelop, centrioles, plus-end microtubuli kinetochore en microtubuli 32,47-51.
Dit protocol heeft een aantal belangrijke imaging stappen die moeten worden uitgevoerd om de kwaliteit resultaten te bereiken: 1) Zorg ervoor dat het mRNA kwaliteit en concentratie optimaliseren om de helderste fluorescentie en geen toxiciteit mogelijk opleveren. Hoe meer fluorescentie zal leiden tot minder laser belichting en daardoor minder photobleaching en fototoxiciteit. 2) Het embryo moet volledig worden verdoofd en veilig in de agar. Minor bewegingen zal veranderen de resultaten en kon het experiment verpesten. 3) De agar concentratie moet geschikt zijn voor het stadium van het embryo de gewenste af te beelden. Op 24 HPF en verder, 1% laag smeltpunt agarose geschikt is. Als beeldvorming bij 12 HPF of eerder, zou een 0,3% agarose-oplossing worden gebruikt 39. 4) De ROI in het embryo moet zo dicht mogelijk bij het dekglaasje mogelijk zijn. Deze stap hoeft men niet te beperken tot de staart beeldvorming. De ogen, huid, dorsale regio, dooier, en fin vouw zijn voorbeelden van andere gebieden die dit protocol kan gebruiken.
Tijd is de bepalende factor die dit protocol van imaging vaste embryo's of weefsels scheidt. Bij het opzetten van de Z-stack, Z-interval, time-lapse interval, en duur time-lapse, is het belangrijk om in gedachten te houden het kader van het experiment (figuur 1C). Een wildtype celdeling duurt gewoonlijk ongeveer 25 minuten bij 24 HPF. in this Zo is een 2 urn Z-interval die 40 urn van weefsel in een Z-stack, met een twee minuten tijdsinterval gedurende twee uur effectief gebleken. Verder wordt in embryo's met defecte mitose cellen in mitose zal waarschijnlijk aanwezig zijn, drastisch verhogen celdeling keer. Als u meerdere volledige divisies te verwerven, moet de tijdsduur worden verhoogd, dat wil zeggen, van 2 uur tot 4 uur. Een langere acquisitietijd wordt het monster meer laservermogen blootleggen en het risico van fotobleken en fototoxiciteit. In dit geval moet het tijdsinterval tussen elke Z-stack worden verhoogd. Chromosoom dynamische bewegingen worden opgeofferd door verhoging van het tijdsinterval tussen Z-stacks, maar tijdsduur wordt verkregen. Dit is nodig bij beeldvorming celdelingen dat meer dan twee uur kan duren.
Hoewel het niet rechtstreeks besproken kan dit protocol worden geoptimaliseerd om een hogere resolutie in het Z-vlak te verkrijgen om nauwkeuriger te visualiseren individuele chromosoom movements. Bijvoorbeeld, in figuur 4A twee missegregated chromosomen worden waargenomen. Het chromosoom naar rechts (opgemerkt door de dikke pijl) is in eerste instantie licht en in focus, maar verduistert in de laatste paar frames. Met een 2 urn Z-interval, de uncongressed chromosoom valt tussen de Z-interval. Het vastleggen minuut bewegingen en singuliere chromosoom gebeurtenissen kan worden bereikt door de resolutie in het Z-vlak toeneemt. Om dit te doen, in te zoomen op een afzonderlijke cel functie A1 Scan Area. Bij het opzetten van de Z-stack parameters, gebruik dan een kleinere Z-interval afstand. Een aanbevolen bereik is 0,5-1 urn. Bovendien verminderen de tijdsinterval tussen elke Z stack vloeiender overgangen tussen elk tijdsbestek, dwz van twee min tot 30 sec - 1 min. Een waarschuwing dit type beeldvorming is de beperkte Z-diepte die kan worden bereikt. Door de kleinere Z-interval en tijdsinterval zal weefsel wordt blootgesteld aan de lasers in een kleiner tijdsbestek. Om dit, sm overwinnenAller tijdsduur kan worden gebruikt; maar dit is ook afhankelijk van hoe lang de onderzoeker wil divisies vangen.
Een analogie die kunnen helpen met deze wijzigingen is te denken aan een Z-stack als een accordeon. De afstand tussen elke plooi van de balg is de Z-interval en de Z-diepte weergegeven door de lengte van de accordeon. In een geval waar men niet zou willen meer laserbelichting om het monster toekomen, als accordeon stukken (verhoogt Z-diepte), moet de afstand tussen de plooien van de balg (Z-interval) ook toe. Het omgekeerde geldt, dat als de accordeon contracten, de Z-diepte afneemt. De plooien van de balg contract ook, overeenkomend met een afname van Z-interval. Deze analogie kan worden toegepast op vaste en levende monsters. De complexiteit is verhoogd bij dit protocol wanneer de tijd wordt toegevoegd aan de vergelijking. Er is een beperkte hoeveelheid tijd dat de accordeon kan uitstrekken of samentrekken accordeon. dit vertegents het tijdsinterval. Om te dekken meer afstand (Z-diepte) het tijdsinterval moet toenemen. Als goed, om meer muziek te horen, moet men luisteren naar een langere tijd (tijdsduur) In termen van dit protocol, met het oog op meer celdelingen getuige, moet de tijdsduur te verhogen. Een compounding factor in gedachten te houden is dat hoe meer muziek die wordt gespeeld, hoe meer moe van de accordeonist. Dit is analoog aan de uiteindelijke afmeting, fluorescentie. Hoe meer laser exposure het monster wordt gegeven, hoe meer fotobleken en fototoxiciteit (vermoeidheid) wordt een probleem.
Kortom, dit protocol Gegevens werkwijze mitose visualiseren in een levende zebravis embryo toepasbaar in allerlei analyses; 1) divisie nummer 2) divisie tijd 3) divisie lot en 4) chromatine dynamiek hoge resolutie. Meerdere mogelijkheden voor het visualiseren mitotische componenten variërend van microtubule-dynamiek kinetochoor bijlagen centriole kunnen worden toegepast. Het combineren het vermogen vanbeeldvorming mitose in vivo met de recente ontwikkelingen in het genoom van het bewerken in de zebravis zal maken het gemakkelijk om mutanten in de verschillende aspecten van de mitose genereren om menselijke ziekte te modelleren in een gewerveld organisme 25,26,52-56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N.
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A.
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J.
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
