Abstract
La mitosi è fondamentale per la crescita e la differenziazione organismal. Il processo è altamente dinamico e richiede ordinato eventi per realizzare una corretta condensazione della cromatina, l'attaccamento ai microtubuli cinetocoro, segregazione dei cromosomi, e citocinesi in un piccolo lasso di tempo. Errori nel delicato processo può portare a malattie umane, tra cui difetti di nascita e il cancro. Gli approcci tradizionali che indagano stati di malattia mitotico umani spesso si basano su sistemi di coltura cellulare, che non hanno la naturale fisiologia e contesto di sviluppo / tessuto-specifica vantaggiosa quando si studia la malattia umana. Questo protocollo supera molti ostacoli, fornendo un modo per visualizzare, ad alta risoluzione, la dinamica dei cromosomi in un sistema di vertebrati, il pesce zebra. Questo protocollo saranno i dettagli di un approccio che può essere usato per ottenere immagini dinamiche di cellule in divisione, che comprendono: la trascrizione in vitro, allevamento zebrafish / raccolta, embrione embedding, e time-lapse imaging. Ottimizzazione e modifications di questo protocollo sono anche esplorati. Utilizzando H2A.F / Z-EGFP (etichette cromatina) e mCherry-CAAX (etichette cella a membrana) embrioni mRNA-iniettato, mitosi in AB wild-type, auroraB hi1045, e hi2865 ESCO2 zebrafish mutante viene visualizzato. Ad alta risoluzione delle immagini dal vivo in zebrafish permette di osservare più mitosi per quantificare statisticamente difetti mitotici e tempi di progressione mitotico. Inoltre, si osservano osservazione di aspetti qualitativi che definiscono i processi impropri mitosi (ad esempio, difetti congressione, missegregation di cromosomi, ecc) e gli esiti cromosomiche improprio (ad esempio, aneuploidia, poliploidia, micronuclei, etc.). Questo test può essere applicato alla osservazione di tessuti differenziazione / sviluppo ed è suscettibile all'uso di zebrafish mutante e agenti farmacologici. Visualizzazione di come difetti di mitosi portare a disturbi del cancro e di sviluppo sarà notevolmentemigliorare la comprensione della patogenesi della malattia.
Introduction
La mitosi è un essenziale processo cellulare fondamentale per la crescita, la differenziazione e la rigenerazione in un organismo vivente. Dopo accurata preparazione e la replicazione del DNA in interfase, la cella è innescato per dividere. La prima fase della mitosi, profase, viene avviata dall'attivazione della ciclina B / Cdk1. Prophase è caratterizzata dalla condensazione del materiale cromatina in cromosomi. Nucleare ripartizione busta avviene al passaggio tra profase e prometafase. In prometafase, centrosomi, il centro di nucleazione per la formazione del fuso, cominciano a migrare verso poli opposti, estendendo microtubuli in cerca di attaccamento cinetocore. Al momento di attacco, le conversioni al fine di applicare il sistema dei microtubuli e forze di tensione orientano i cromosomi che formano una piastra di metafase 1. Se tutti i cromosomi sono collegati correttamente, il punto di controllo di assemblaggio del mandrino è soddisfatto, anelli cohesin tengono i cromatidi fratelli insieme sono spaccati, e microtubuli accorciare a tirare sorellacromatidi ai poli opposti durante anaphase 2,3. La fase finale, telofase, comporta l'allungamento della cella e riforma della membrana nucleare attorno ai due nuovi nuclei. Citochinesi completa il processo di divisione separando citoplasma delle due nuove cellule figlie 4-6. L'alterazione delle vie principali mitosi (cioè, posto di blocco di assemblaggio del mandrino, la duplicazione dei centrosomi, sorella cromatidi coesione, ecc.) Può provocare l'arresto metafase, missegregation dei cromosomi, e instabilità genomica 7-10. In ultima analisi, difetti nei percorsi di controllo mitosi possono causare disturbi dello sviluppo e il cancro, che richiede la visualizzazione della mitosi e dei suoi difetti di un live, vertebrato, organismo pluricellulare 10-16.
embrioni di zebrafish servire come un grande organismo modello per l'imaging dal vivo grazie al tessuto trasparente, la facilità di microiniezione e rapido sviluppo. Utilizzando zebrafish, l'obiettivo generale di questo manoscritto è quello didescrivere un metodo di 5D vivo (dimensioni X, Y, Z, tempo e lunghezza d'onda) di imaging di mitosi 17 (Figura 1C). L'uso di zebrafish mutante difettoso in diversi percorsi mitotici dimostrare la conseguenza di tali difetti. Per questo protocollo, Aurora B ESCO2 mutanti sono stati scelti per illustrare questi difetti. Aurora B è una chinasi che fa parte del complesso cromosoma passeggeri (CPC) coinvolte nella formazione del fuso e l'attaccamento microtubuli. E 'anche necessario per la formazione di scissione solco nel cytokinesis 18,19. In zebrafish, la carenza di Aurora B porta a difetti di induzione solco, citocinesi, e la segregazione cromosoma 20. ESCO2, d'altra parte, è un acetiltransferasi che è essenziale per sorella cromatidi coesione 21,22. Si acetila cohesin sulla parte SMC3 dell'anello stabilizzando così cohesin per garantire una corretta segregazione cromosomica al passaggio metafase-anafase 23. Perdita di ESCO2 in zebrafish porta a chmissegregation romosome, prematura sorella separazione cromatidi, instabilità genomica, e p53-dipendente apoptosi e indipendenti 24,25. Grazie alla disponibilità, auroraB hi1045, e hi2865 ESCO2 zebrafish mutante (di seguito denominato aurB m / m ed ESCO2 m / m, rispettivamente) verrà utilizzato per illustrare questa tecnica 25-27.
Accoppiamento microscopia confocale con macchinari cellule fluorescenti-tag ha permesso ai ricercatori di visualizzare cromatina e della membrana cellulare dinamiche durante la mitosi 25,28,29. istoni fluorescenti-tag sono stati storicamente utilizzati per la visualizzazione della cromatina. Gli istoni sono proteine nucleari composti da quattro diverse coppie (H2A, H2B, H3, H4 e) che sono responsabili della struttura nucleosomi che compone i cromosomi 30. Mentre H2B è probabilmente il più usato per istone proteine fluorescenti amouse e colture cellulari, l'uso di istone 2A, Famiglia Z (H2A.F / Z) ha dimostrato bene per l'uso in zebrafish 31,32. Concanavalina A e caseina chinasi 1-gamma per esempio, localizzare alla membrana cellulare e sono stati precedentemente dimostrato efficace nel visualizzare membrana cellulare in ricci e drosophila 33,34. Altri studi hanno dimostrato che la proteina fluorescente-tag CAAX etichette la membrana cellulare e ha avuto successo in zebrafish 31. CAAX è un motivo che è riconosciuto da enzimi di modificazione post-traduzionali quali farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modifiche di questi enzimi causano proteine di diventare associata alla membrana, etichettatura così la membrana cellulare 35.
A causa del precedente uso di zebrafish, questo protocollo ha scelto di utilizzare H2A.F / Z e CAAX di etichettare cromatina e la membrana cellulare. L'applicazione di questo metodo permetterà al ricercatore di monitorare mitosi a livello di cella singola osservare singolo cromosomadinamiche, come monitorare e allo stesso tempo più divisioni cellulari che possono influire differenziazione dei tessuti e lo sviluppo. Questo articolo si concentrerà su l'imaging le dinamiche di segregazione dei cromosomi durante la mitosi a livello singola cella. All'interno di questo manoscritto, la capacità di osservare diverse divisioni mitotiche, calcolare il tempo di divisione, e decifrare i fenotipi mitotiche verrà illustrato e discusso. Utilizzando questi parametri, fisiologicamente dati rilevanti possono essere raccolti e applicati a diversi stati di malattia affetti da difetti mitotico.
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Protocol
1. in vitro Trascrizione
- Linearizzare pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / o vettori pCS2-mCherry-CAAX per restrizione NotI enzima digerire 31. L'utilizzo di un RNA nel kit di trascrizione in vitro, generare 5 'prodotti mRNA ricoperti da ogni modello, secondo il protocollo del produttore.
- Purificare i mRNA innevate con un kit di purificazione. Seguire le istruzioni del produttore. Eluire con RNasi-free H 2 O.
- Determinare la concentrazione di RNA mediante assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro. (OD 260 x diluizione x 40 mcg / ml).
- Diluire l'RNA a 100 ng / mL per ogni H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX con RNase-free 2 O. Se la concentrazione di RNA è troppo bassa, la fluorescenza sarà diminuita o assente. campioni Brighter diminuirà le preoccupazioni sulla fototossicità e photobleaching. D'altra parte, troppo RNA può essere tossico e / o causare effetti off bersaglio.
Nota: Conservare il rimanentemRNA purificato in -80 ° C freezer.
2. Allevamento Zebrafish, Embrione Collection, e mRNA iniezione 36-38
- Assemblare vasche di allevamento con una barriera per separare il serbatoio in due regioni e riempire ciascun serbatoio di allevamento con l'acqua sistema di acquacoltura utilizzato nella struttura zebrafish.
- Per evitare l'allevamento prematura, posizionare due pesci maschio su un lato della barriera e due pesci femmina dall'altro lato la notte prima di allevamento.
- Il giorno successivo, scongelare la miscela mRNA precedentemente preparato sul ghiaccio. Sostituire l'acqua in vasche di allevamento con acqua sistema di acquacoltura fresca e rimuovere le barriere. Subito dopo le barriere sono tirati, riscaldare uno stampo ad iniezione di 28,5 ° C e impostare l'apparecchiatura per la microiniezione.
Nota: Per informazioni su stampi ad iniezione, si rimanda al Gerlach 36. - Raccogliere uova ogni 10 - 15 minuti utilizzando un colino da tè e sciacquare le uova in un ambiente pulito 100 x 15 mm piastra di Petri con E3 Blu (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mm CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4, 10 -5% blu di metilene). E3 blu è usato per prevenire la crescita di funghi e garantire il corretto sviluppo delle larve. Per maggiori informazioni su l'accoppiamento e la raccolta degli embrioni, fare riferimento a Gerlach 36 e 37 Porazinkski.
- Incorporare una cella scena embrioni in uno stampo ad iniezione riscaldato ed iniettare l'RNA nel tuorlo nella quantità desiderata di embrioni (Figura 1A). Conto per naturale morte embrionale ed embrioni non fecondate eseguendo iniezioni embrionali, il 15% in più rispetto embrioni necessario per l'esperimento. Per ulteriori dettagli su microiniezione di embrioni di zebrafish, si prega di fare riferimento a Gerlach 36 e 37 Porazinkski.
NOTA: Per il primo utilizzo di mRNA, eseguire un'analisi dose di curva per determinare la dose ottimale per la fluorescenza e la vitalità (definita come assenza di difetti di sviluppo lordi fino a 5 dpf) prima di eseguire l'imaging 5D. 150 - 200 ng / mliniettate in embrioni è spesso la concentrazione ottimale, quindi è un buon punto di partenza per la concentrazione finale. - estrarre delicatamente gli embrioni iniettati dallo stampo utilizzando una versione modificata del "vetro pipetta Pasteur 9. Per modificare la pipetta, sciogliere il finale utilizzando un becco Bunsen fino a formare una palla.
- Mettere embrioni iniettati in un 100 x 15 mm piastra di Petri in E3 blu e la casa in un incubatore a 28.5 °.
- Sei ore dopo l'iniezione, rimuovere eventuali embrione è morto o non fecondate dai piatti e aggiungere pulita E3 blu. Casa gli embrioni a 28,5 ° C.
3. Preparazione e Embedding a Live embrioni di zebrafish per Imaging (Figura 1B)
- Due ore prima di imaging, lo screening degli embrioni iniettati per GFP utilizzando un microscopio da dissezione a fluorescenza. Luogo luminoso embrioni che esprimono GFP-verdi in una nuova mm piatto 100 x 15 Petri con E3 blu.
- Far bollire una soluzione stock di 1% a basso agarosio fusione con l'aggiunta di 1 g di basso punto di fusione agarosio a 100 ml di E3 Blu. Dopo aver utilizzato il agarosio, coprire il pallone con un foglio di alluminio. La soluzione madre può essere utile per un massimo di un mese.
- Aliquotare 3 ml di agar fuso in una provetta 17 x 100 mm. Mantenere la calda agarosio collocando la provetta in un bagno d'acqua a 42 ° C fino al momento dell'uso. Preparare una soluzione di 15 mm Tricaine in acqua deionizzata per anestetizzare gli embrioni di zebrafish 36.
NOTA: Se l'imaging in punti temporali precedenti è desiderato, la concentrazione di agar può essere diminuita a partire da 0,3% 39. - Portare il 15 MM Tricaine, gli embrioni a screening, bassa agarosio fusione, E3 Blu, e da 35 mm di vetro coprioggetto cultura fondo piatto per un microscopio ottico dissezione. Rimuovere con attenzione corion dell'embrione con # 5 pinzette. Fare questo per tre embrioni.
- Mettere gli embrioni dechorionated in un contenitore separato per essere anestetizzati. Il coperchio del piatto coprioggetto fondo viene spesso utilizzato per questo scopo. Usando una pipetta di trasferimento, aggiungere tre gocce (circa 150 ml)15 mM Tricaine al piatto 5 ml E3 blu (se utilizzando il coperchio del piatto inferiore coprioggetto) o fino embrioni sono stati sufficientemente anestetizzato. Inoltre, aggiungere 3-4 gocce (circa 150 - 200 microlitri) di 15 mM soluzione Tricaine al tubo agarosio fuso 1%.
- Usando una pipetta P200 con 1 cm dalla punta della pipetta tagliare; trasferire gli embrioni anestetizzati al piatto coprioggetto fondo. Rimuovere qualsiasi eccesso E3 Blu: soluzione Tricaine.
- Aggiungere lentamente 5 - 10 ml di agarosio a bassa fusione: soluzione Tricaine negli embrioni, mantenendo ogni goccia separato per garantire gli embrioni non accidentalmente deriva vicini l'uno all'altro.
Attenzione: se l'agarosio è troppo caldo, si danneggia l'embrione. Una buona temperatura per mantenere l'agar a è 42 ° C. - Utilizzando un 21 ago G 1 ½, orientare delicatamente l'embrione nel agarosio nella posizione desiderata. Quando si utilizza un microscopio invertito per l'imaging time-lapse, orientare la regione di interesse (ROI) più vicino possibile al vetrino come possibLe.
Nota: Per scopi generali, la regione coda offre la facilità di orientamento e chiarezza a causa della relativamente sottile di tessuto (Figura 1A). Altri tessuti, come lo strato epiteliale che circonda le pieghe tuorlo e pinne, possono essere usati 28,29. Questi tessuti offrono grande chiarezza, tuttavia queste regioni sono spessi solo pochi strati di cellule. Ai fini di questo protocollo, è vantaggioso per un'immagine regione coda di acquisire quante divisioni cellulari possibili. - Attendere qualche minuto per la solidificazione parziale del agar. Utilizzare l'ago di spezzare un piccolo pezzo di agar per testare la sua solidificazione. Quando un pezzo di agar può essere tirato dalla goccia, procedere al passo successivo.
- Coprire l'intero vetrino con una bassa agar fusione formando una cupola sopra gli embrioni incorporati. Lasciare che l'agar solidificare prima di spostare il piatto per l'imaging confocale (Figura 1A).
- Durante il processo di solidificazione agar (dura circa 10 minuti), preparare da 3 ml osoluzione f E3 blu con cinque gocce di (circa 250 ml) 15 mm Tricaine per essere posizionato sopra gli embrioni incorporati durante l'imaging.
4. 5D confocale Imaging Live embrioni di zebrafish 40,41
NOTA: Vedere Ariga 40 e O'Brien 41 per i dettagli su come eseguire l'imaging 5D utilizzando altri sistemi confocale. Per Z-intervallo, Z-stack, Z-profondità, intervallo di tempo, e definizioni 5D si veda la Figura 1C.
- Aprire il software di imaging e impostare il microscopio a 60X NA 1.4 lente dell'obiettivo. Applicare l'olio di immersione alla lente dell'obiettivo e posizionare il piatto cultura nel supporto diapositive sul palco microscopio. Utilizzando il controllore assi, centrare l'embrione di interesse al di sopra della lente dell'obiettivo e portare la lente obiettivo verso l'alto per incontrare il piatto cultura.
- Fare clic sull'icona oculare e passare al filtro GFP sul microscopio. Focus sul ROI. Concentrandosi sul tessuto più vicino al vetrino sarà offer i migliori risultati di imaging.
- Rimuovere il blocco. Selezionare i canali GFP e mCherry (lunghezze d'onda pre-impostati nel software) e impostare la linea opzione normale media.
- Utilizzare "Controlli View / acquisizione / A1 Area di scansione" comando per aprire lo strumento A1 Area di scansione.
- Avviare la scansione. Utilizzando l'asse-controllore, posizionare l'embrione in modo che l'area di scansione viene riempito con la maggior quantità di zebrafish possibile. La potenza del laser non deve essere ottimale a questo punto. Abbassare la potenza del laser al fine di evitare inutili photobleaching.
- Utilizzare i "Controlli View / acquisizione / acquisizione ND" comando per aprire il pannello di controllo acquisizione ND.
- Avviare la scansione per impostare i parametri di Z-stack. Impostare il limite superiore Z-stack per cui le cellule non sono a fuoco e limite inferiore per cui le cellule non sono più visibili. Lasciare uno spazio 3 micron sopra il campione per la crescita e il movimento delle cellule, che può espandersi nel campo di ripresa. La Z-stack per i dati riportati in questo proprotocollo copriva una Z-profondità di 40 micron di coda dell'embrione.
- Impostare la dimensione del passo Z-intervallo di 2 micron. In media, una cella è 10 micron di diametro; quindi 2 micron produrrà cinque intervalli di dati di imaging da analizzare per ogni cella.
NOTA: La profondità dell'immagine che può essere acquisito dipende dall'intervallo Z. risoluzione Z è sacrificato per ottenere profondità totale nella dimensione Z al fine di immagine come molte cellule in fase di mitosi possibile (grande Z-profondità). L'inverso è vero, nel senso che, diminuendo la dimensione del passo, la risoluzione Z si guadagna, mentre la profondità Z viene sacrificato (piccolo Z-profondità). - Regolare la potenza del laser immagine, HV, e offset livelli. Per gli esperimenti hanno dimostrato in questo protocollo, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli fissati ai livelli corrispondenti, rispettivamente, per il canale GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Per il canale mCherry, utilizzare il seguente potenza del laser, HV, e offset livelli, rispettivamente; 3 - 6, 120 - 140, e -3 a-8. Una volta impostati i parametri, spegnere la scansione per evitare l'esposizione al laser inutili che possono causare fototossicità e photobleaching del campione.
- Selezionare l'icona media linea di 2x. "No media" produce un'immagine sgranata mentre "linea 4x media" aumenta drasticamente il tempo di scansione. L'uso della linea di 2x media fornisce la migliore qualità di immagine e il tempo più veloce di scansione.
- Selezionare l'intervallo di tempo e durata, necessarie per l'esperimento. Per le divisioni wild-type, intervalli di tempo di due minuti per 2 ore è meglio per la determinazione della durata mitotico (utilizzato nelle figure 1, 2, 3A e 3B). Divisioni che attivano il checkpoint del fuso per più di 30 minuti sono più adatti per cinque intervalli minuti per quattro ore al fine di preservare la fluorescenza come mostrato nella Figura 3C.
- Selezionare la casella "Salva su file" e il nome del file per salvare automaticamente il file come si è in fase di acquisizione. Doppio controllo tutte le parametri siano impostate correttamente e ha colpito "start run".
- Dopo l'acquisizione è stata completata, per visualizzare il file in un formato tridimensionale, cliccare sull'icona soglia di volume.
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Representative Results
La figura 2 mostra la capacità di osservare molte divisioni cellulari che utilizzano un ampio panorama di un campo di tipo selvaggio coda zebrafish AB. Oltre sette cellule mitotiche vengono esposte in un arco di tempo 14 min (Film 1). Entro il corso di due ore, più di 40 eventi mitotico sono stati catturati. In media, 50 cellule in divisione sono stati osservati nel 30 AB e divisione delle cellule in AUR B m / m embrioni (Figura 2b). Per tener conto del numero di cellule ripreso, il rapporto tra cellule mitotiche numero di cellule imaged stato calcolato (Figura 2C). Questi dati suggeriscono che non c'è un numero inferiore di cellule che passano attraverso la mitosi nelle aur B m / m embrioni (Figura 2b), ma un minor numero di numero di cellule in fase ripreso. La capacità di acquisire un numero statisticamente significativo di eventi come questa sarà di aiuto nella potenza statistica.
Figura 3 si espande su questa tecnica per includere quantificare durata mitotico. Una volta che una sessione di time-lapse è acquisito, una singola cella può essere analizzato per il tempo trascorso in mitosi con adeguata risoluzione utilizzando lo zoom (Figura 3A, B). Durata mitotico è calcolata manualmente contando quanti intervalli di tempo occupano una divisione cellulare. Il numero di intervalli di tempo viene quindi moltiplicata per l'intervallo di tempo tra ogni Z-stack. Ad esempio, in Figura 3C, la divisione prese 12 intervalli di tempo e l'intervallo di tempo tra ogni Z-stack era 2 min. Pertanto, il tempo di divisione per questa cella era 24 min. L'AB tempo medio di wild-type divisione è di 25 min e 58 min per aurB m / m (Figura 3B). Una divisione di tempo prolungato come si vede nella aurB m / m suggerisce che il punto di controllo di assemblaggio del mandrino non è stata soddisfatta a causa di vacche erroneaallegati tochore 1,2. Dando uno sguardo più da vicino la ingrandita wild-type embrioni, ogni fase mitotico si distingue (Figura 3C, Movie 2). Inoltre, i difetti mitotiche possono essere osservati nella aurB m / m embrione che comprendono l'arresto mitotico e non è riuscito cytokinesis risultante in una cella binucleate e la successiva formazione di un micronuclei (Figura 3D, film 3). Questo zoom in analisi che mostra difetti mitotici supporta l'aumento del tempo di divisione acquisita in figura 3B.
Vari altri difetti diversi mitotico e destino delle cellule che si possono incontrare sono esplorati in figura 4; dimostrato nel ESCO2 + / m e ESCO2 m / m embrioni. In un ESCO2 + / m embrione, movimenti cromosoma erronee vengono catturati e possono essere definiti come difetto congressioneS. difetti congressione si verificano quando gli allegati microtubuli impropri sono fatti. Questi difetti provocano fallimento dei cromosomi di migrare verso la piastra di metafase. cromatidi fratelli appaiati, in particolare identificabili min 20 e 46, che non hanno congressed verso la piastra di metafase possono essere osservati a prima min 14. Anaphase insorgenza separa i cromatidi fratelli allineati al piatto metafase, nonché i cromatidi fratelli appaiati a destra, osservata a minuto 50. Inoltre, possibile formazione di micronuclei si osserva come questi cromatidi fratelli separati rimangono isolati al di fuori del nucleo (T = 50, figura 4A, film 4). Nella Figura 4B, una divisione multipolare viene visualizzata (filmato 5). Divisioni multi-polari, spesso si verificano a causa dell'amplificazione centrosoma, ma può avvenire attraverso altri mezzi 42. Nella figura 4C, un ESCO2 m / m delle cellule dimostra inizialmente sorella prematura cromatidi separationi e la rotazione del mandrino 9,43,44. Un altro destino della cellula dimostrato in questo pannello è un ponte anaphase in cui gli allegati merotelic sono irrisolti 45,46. Il ponte può essere anaphase prima volta al minuto 62. La cromatina sembra prematuramente decondense mentre la cella è in fase di cytokinesis. Come avviene la citocinesi, il solco scissione incide sui cromosomi decondensazione e, come avviene abscissione, tira il materiale cromatina per formare un ponte anaphase (Figura 4C, Film 6). Anche se non mostrato qui, al fine di quantificare i destini cellulari, registrare tutte le divisioni mitotiche in ogni fotogramma e il tipo di destino delle cellule esibiscono. Dividere il numero di cellule in ciascun destino per il numero totale di divisioni registrate e moltiplicare per 100 per calcolare la percentuale destino cellulare.
Figura 1: Protocollo Disegni Outline. (UN) (B) Schema del processo dell'embrione embedding. Gli embrioni devono essere iniettati dechorionated e anestetizzati. Gli embrioni vengono poi trasferiti al piatto coprioggetto-inferiore e superiore E3 blu viene rimosso. Low agar fuso viene utilizzato per creare cupole distinte che coprono ogni embrione. Orientare gli embrioni in modo che la coda è più vicino al vetrino. Attendere due minuti prima di aggiungere l'agar che copre tutto il vetrino. Attendere fino a quando l'agar è solidificato prima di passare all'immagine. (C) Schema di definire i termini Z-intervallo, Z-stack, Z-profondità, intervallo di tempo, durata e 5D che vengono utilizzati nel protocollo e la discussione. Z-intervallo è definito come la distanza tra ogni immagine come il microscopio si sposta più in profondità nel campione per creare un Z-stack. Z-stack è tutte le immagini scattate attraverso uncampione alla Z-intervallo definito. La distanza percorsa in un Z-stack definisce la Z-profondità. Intervallo di tempo è la quantità di tempo tra uno Z-stack e il successivo Z-stack per creare un'immagine ripresa temporizzata. Durata Il tempo è la quantità totale di tempo utilizzato per l'immagine. 5D è definita come le dimensioni X, Y, Z, il tempo, le emissioni e fluorescenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Time-Lapse Imaging Cattura più eventi mitotiche in un embrione in vivo Zebrafish. (A) Time-lapse fotogrammi di un esperimento zoom out in un AB wild-type, 24 HPF zebrafish mostrando più eventi mitotico. Gli asterischi indicano verso sette cellule in mitosi. t = tempo trascorso in min. Barra di scala = 5 micron. (B) Il numero di ce mitoticoLLS osservati in AB e aurB m / m code zebrafish a 24 HPF. Media ± st. dev., n = 3 embrioni / genotipo. (C) Il rapporto tra cellule mitotiche per numero totale di cellule in AB e aurB m / m code zebrafish a 24 HPF. Media ± st. dev., n = 3 embrioni / genotipo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. singola cella Analisi Cattura Ogni mitotico fase e Mitotic Durata. (A) Una cella selezionata dalla vista ampio campo di AB wild-type, 24 HPF zebrafish embrione mostrato nella Figura 2A. Si osserva (B) Tempo di divisione per AB e aurB m / m cellule e calcolato da inferire bre involucro nucleareakdown (NEB) alla prima osservazione della cromatina condensata in una cella alla formazione di due nuove cellule figlie. n = 3 embrioni / genotipo, n = 66 divisioni per AB, n = 29 divisioni per aurB m / m, *** p-value <0.001. (C) AB cellule wild-type è ritagliata per visualizzare la progressione di fase attraverso la mitosi . t = min. Barra di scala = 5 micron. (D) aurB m / m cella è ritagliata di visualizzare la progressione mitotico attraverso la mitosi, che comprende l'arresto mitotico conseguente fallimento cytokinesis e la formazione di micronuclei. Le frecce puntano verso il micronuclei. t = tempo trascorso in min. Scala bar = 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4.Singola cellula dal vivo Imaging cattura difetti multipli mitotiche associati con Cromosoma segregazione e divisione in Mitotic Mutant Zebrafish. (A) di una cella di subire difetti congressione in ESCO2 + / m embrione A ritagliata. La freccia sottile controlla il cromosoma sinistra che viene tirato indietro nella piastra di metafase. La freccia di spessore controlla il cromosoma destra che non viene tirato indietro nella piastra metafase e dedurre in modo da formare un micronuclei. La doppia freccia indica la separazione del cromosoma diritto che non ha fatto il Congresso all'esordio anafase. Riquadri mostrano ingrandite vista dei cromosomi che non sono riusciti a congressi. Inserti sono state tagliate e la luminosità migliorata per una migliore visualizzazione. CAAX fluorescenza è stato rimosso per visualizzare i cromosomi più facilmente. Barra di scala = 5 micron. (B) immagine di una cella Una tagliata in fase di arresto mitotico che si traduce in una divisione multipolare in un ESCO2 + / M embrione. Barra di scala = 5 micron. (C) Una immagine ritagliata di una cellula in fase di stanchezza coesione causando la formazione ponte anafase visto dalla filiforme tirare tra i due nuclei rilevate dai staffe. Barra di scala = 5 micron. t = tempo trascorso in min. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1. divisioni cellulari multiple possono essere visualizzati in una vasta vista di un iniettato wild-type embrione zebrafish (tasto destro del mouse per scaricare).
Movie 2. fasi della mitosi possono essere facilmente visualizzati in una wild-type embrione zebrafish (r ight clicca per scaricare). Ripartizione involucro nucleare è dedotta dalla comparsa irregolare del nucleo e procede verso congressione dei cromatidi fratelli per formare un piatto metafase . la segregazione accurata verifica e produce due nuove cellule figlie.
Movie 3. vivo imaging aurB m / m embrione rivela cromosoma perdereegregation, non è riuscito citocinesi, e la formazione di micronuclei (tasto destro del mouse per scaricare). ripartizione involucro nucleare è dedotta dalla comparsa irregolare del nucleo, i cromosomi si disperdono ai poli opposti in grado di formare un piatto metafase corretta, e procedere a ruotare su asse che si estende alla divisione tempo della cella. Citochinesi non si verifica risultante in una cella 4N e molteplici micronuclei.
Movie 4. difetti congressione sono osservati in un ESCO2 + / m embrione (tasto destro del mouse per scaricare). Ripartizione involucro nucleare è dedotta dalla comparsa irregolare del nucleo. Dopo la piastra metafase è formata, alcuni indicromosomi individuali disperdono su entrambi i lati. Un cromosoma individuale largo a sinistra alla fine viene tirato indietro nella piastra di metafase, mentre il cromosoma alla destra rimane al di fuori della piastra metafase e può essere visto che separa cromatidi fratelli al momento della comparsa di anaphase. La cella presenta una divisione di tempo prolungato, ma divide finale con potenziale formazione di micronuclei.
Movie 5. divisione multi-polare è osservata in un ESCO2 + / m embrione (tasto destro del mouse per scaricare). Ripartizione involucro nucleare è dedotta dalla comparsa irregolare del nucleo e quindi i cromosomi si fondono per formare un indicativ Y-formae di poli 3-mandrino. La cella presenta una divisione di tempo prolungato, ma alla fine si divide in 3 cellule figlie.
Film 6. sorella precoce separazione cromatidi e la formazione di ponte anaphase sono osservati in un ESCO2 m / m embrione (tasto destro del mouse per scaricare). Ripartizione involucro nucleare è dedotta dalla comparsa irregolare del nucleo e poi cromosomi disperdono in tutta la cellula in grado di formare un piastra di metafase corretta. La cromatina decondenses prima cytokinesis e come la cellula si divide, crea un ponte di anafase tra le due cellule.
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Discussion
L'uso di questo metodo permette di dedurre ripartizione nucleare envelope, formazione di una piastra di metafase da allegati microtubuli cinetocoro, e la segregazione dei cromatidi fratelli per formare due nuove cellule in vivo e in un modo dipendente dal tempo. La capacità di osservare mitosi in zebrafish è vantaggioso su campioni fissati e sistemi di coltura cellulare perché le cellule vengono ripreso nella fisiologia naturale, il tessuto è trasparente che permette proteine fluorescenti da utilizzare, sviluppano relativamente veloce e time-lapse imaging possono essere acquisite. L'utilizzo di zebrafish adulto per questo protocollo è limitato a causa della limitata Z-profondità che può essere acquisita grazie al tessuto più spesso che non è la pelle o degli occhi. Mentre gli animali transgenici che esprimono H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX potrebbero essere utilizzati per lo stesso scopo, la versatilità e la facilità delle iniezioni di mRNA in diverse zebrafish mutante è vantaggioso su incroci genetici. Nelle situazioni in cui l'analisi è mitoticorichiesta in tre giorni dopo la fecondazione (DPF) o embrioni successive, sarebbero necessarie animali transgenici a causa del tempo di dimezzamento di RNA in questo organismo in rapido sviluppo.
Altre proteine fluorescenti per la visualizzazione mitosi sono suscettibili di questo protocollo. Ad esempio, H2B-GFP mRNA è un'alternativa a H2A.F / Z-EGFP per cromatina, e fornisce l'etichettatura simile. Altre proteine fluorescenti-tag che possono essere utilizzati in questa tecnica includono POM121, Centrin, Eb1, Hec1, e EMTB che consentirebbe di vivere l'imaging in-embrione di microtubuli membrana nucleare, centrioli, plus-end, cinetocoro, e microtubuli, rispettivamente, 32,47-51.
Questo protocollo ha diversi passaggi chiave per immagini che devono essere eseguite per ottenere risultati di qualità: 1) Assicurarsi che per ottimizzare la qualità mRNA e la concentrazione di cedere la fluorescenza più brillante e nessuna tossicità possibile. La fluorescenza più porterà a una minore esposizione al laser e, quindi, meno photobleaching e fototossicità. 2) L'embrione deve essere completamente anestetizzato e sicuro nel agar. movimenti minori altereranno i risultati e potrebbero rovinare l'esperimento. 3) La concentrazione di agar deve essere appropriato per la fase di embrionale desiderava essere ripreso. A 24 HPF e ulteriormente, 1% a bassa fusione agarosio è adatto. Se l'imaging a 12 HPF o precedente, una soluzione di agarosio 0,3% dovrebbe essere utilizzato 39. 4) Il ROI nell'embrione deve essere il più vicino al vetrino il più possibile. Questo passaggio non limita uno per l'imaging la coda. Gli occhi, la pelle, regione dorsale, tuorlo, e fin piega sono esempi di altre aree che possono utilizzare questo protocollo.
Il tempo è il fattore determinante che separa questo protocollo da immagini fisse embrioni o tessuti. Quando si imposta la Z-stack, Z-intervallo, intervallo di time-lapse, e la durata time-lapse, è importante tenere presente il contesto di questo esperimento (Figura 1C). Una divisione cellulare wild-type di solito dura circa 25 min a 24 HPF. in thè esempio, a 2 micron Z-intervallo che copre 40 micron di tessuto in un Z-stack, con un intervallo di tempo di due minuto per due ore è dimostrato efficace. Inoltre, negli embrioni con mitosi difettoso, le cellule in un arresto mitotico sarà probabilmente presente, drasticamente aumentando i tempi di divisione cellulare. Per acquisire molteplici divisioni pieni, la durata deve essere aumentato, vale a dire, da 2 ore a 4 ore. Un tempo di acquisizione più esporrà il campione più potenza laser e aumentare il rischio di photobleaching e fototossicità. In questo caso, l'intervallo di tempo tra ogni Z-stack deve essere aumentata. movimenti cromosomici dinamici saranno sacrificati aumentando l'intervallo di tempo tra Z-stack, ma durata di tempo è guadagnato. Ciò è necessario quando l'imaging divisioni cellulari che possono durare più di due ore.
Anche se non è stato discusso direttamente, questo protocollo può essere ottimizzato per ottenere un'immagine ad alta risoluzione nel piano z per visualizzare più accuratamente mo singolo cromosomavements. Per esempio, nella Figura 4A si osservano due cromosomi missegregated. Il cromosoma a destra (indicata dalla freccia di spessore) è inizialmente luminosa e a fuoco, ma si affievolisce negli ultimi fotogrammi. Con 2 micron Z-intervallo, il cromosoma uncongressed cade tra Z-interval. Cattura movimenti minute ed eventi cromosomiche singolari può essere realizzato aumentando la risoluzione nel piano Z. Per fare questo, zoomare su una singola cella usando lo strumento A1 Area di scansione. Quando si imposta i parametri di Z-stack, usare una distanza Z-intervallo più piccolo. Una gamma consigliata è 0,5-1 micron. Inoltre, riducendo l'intervallo di tempo tra ciascuna pila Z creerà transizioni uniformi tra ogni intervallo di tempo, cioè, da due min a 30 sec - 1 min. Un avvertimento a questo tipo di immagini è la Z-limitata profondità che può essere raggiunto. A causa della minore Z-interval e di intervallo, più tessuto sarà esposto al laser in un arco di tempo più piccola. Per superare questo, smaller durata di tempo può essere utilizzato; tuttavia questo dipende anche da quanto tempo il ricercatore vorrebbe catturare le divisioni.
Un'analogia che può aiutare con queste modifiche è quello di pensare ad un Z-stack come una fisarmonica. La distanza tra ogni piega del soffietto è Z-intervallo e la Z-profondità è rappresentata dalla lunghezza della fisarmonica. In un caso in cui non si vorrebbe accumulare più radiazioni laser al campione, come i tratti fisarmonica (aumenta Z-profondità), la distanza tra le pieghe del soffietto (Z-intervallo) deve aumentare pure. L'inverso è vero in quanto, come i contratti di fisarmonica, la Z-profondità diminuisce. Le pieghe del contratto soffietti pure, corrispondente ad una diminuzione Z-interval. Questa analogia può essere applicata a campioni fissati e vivi. La complessità è aumentata in questo protocollo quando il tempo viene aggiunto all'equazione. Vi è una quantità limitata di tempo che la fisarmonica può estendere o contrarre la fisarmonica. Questo rapprets l'intervallo di tempo. Al fine di coprire più distanza (Z-profondità) l'intervallo di tempo deve aumentare. Inoltre, al fine di ascoltare più musica, si deve ascoltare per un periodo di tempo più lungo (tempo di durata) In termini di questo protocollo, al fine di assistere a ulteriori divisioni cellulari, la durata deve aumentare. Un fattore compounding da tenere a mente è che più la musica che si gioca, il più stanco fisarmonicista. Questo è analogo alla dimensione finale, fluorescenza. Il più esposizione laser viene dato l'esempio, più photobleaching e fototossicità (stanchezza) diventa un problema.
In sintesi, questo protocollo dettagli di un metodo di visualizzare mitosi in un embrione di zebrafish vivo applicabile a diverse analisi; 1) numero della divisione 2) a divisione di tempo 3) divisione destino e 4) la dinamica della cromatina ad alta risoluzione. Molteplici possibilità di visualizzare i componenti mitotico vanno da allegati di microtubuli-cinetocoro per centriolo dinamiche possono essere applicati. Combinando la capacità dil'imaging mitosi in vivo con i recenti progressi nella modifica del genoma in zebrafish renderà più facile generare mutanti in vari aspetti della mitosi per modellare la malattia umana in un organismo vertebrato 25,26,52-56.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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