Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Published: July 15, 2016 doi: 10.3791/54218
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

Mitoz organizma büyümesi ve farklılaşması için çok önemlidir. süreç son derece dinamik ve küçük bir zaman dilimi içinde uygun kromatin yoğunlaşması, mikrotübül kinetochore eki, kromozom ayrımı ve sitokinezi gerçekleştirmek için olayları sipariş gerektirir. hassas bir süreç hatalar doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere, insan hastalığı ile sonuçlanabilir. İnsan mitotik hastalık durumları araştıran geleneksel yaklaşımlar genellikle insan hastalığı okuyan zaman doğal fizyolojisini ve avantajlı gelişimsel / doku-spesifik bağlamı eksikliği hücre kültür sistemleri, güveniyor. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü, bir omurgalı sisteminde kromozom dinamikleri, Zebra ile görselleştirmek için bir yol sunarak birçok engellerin üstesinden. Bu protokol detay içeren bölünen hücrelerin, dinamik görüntüler elde etmek için kullanılabilecek bir yaklaşım olacaktır: In vitro transkripsiyon, Zebra balığı yetiştiriciliği / toplama, embriyo gömme ve zaman atlamalı görüntüleme. Optimizasyon ve modifBu protokolün ications de incelenmiştir. H2A.F / Z-EGFP kullanılması ve mCherry CAAX (etiketler hücre zarı) mRNA enjekte edilmiş embriyolar, AB vahşi tip, auroraB hi1045 ve mutant zebra balığı görüntülenmiştir esco2 hi2865 mitoz (kromatin etiketler). Zebra balığı yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme bir istatistiksel mitotik kusurları ve mitotik ilerlemesi zamanlamasını ölçmek için birden fazla mitoz gözlemlemek sağlar. Buna ek olarak, yanlış (yani, congression kusurları, kromozomların missegregation, vs.) mitotik süreçleri ve yanlış kromozom sonuçları (yani, anöploidi, poliploidi, mikronuklei, vs.) tanımlayan niteliksel yönlerini gözlem görülmektedir. Bu deney, doku farklılaşması / gelişme gözlem uygulanan ve mutant zebrabalıkları ve farmakolojik maddelerin kullanımı için uygun olan edilebilir. mitoz kusurları, kanser ve gelişimsel bozukluklara olacak büyük ölçüde yol nasıl görselleştirmehastalığın patogenezinde anlayışı geliştirmek.

Introduction

Mitoz canlı bir organizmada büyümesi, farklılaşması ve rejenerasyonu için kritik bir hücresel prosesin gereklidir. Doğru hazırlanması ve interfaz DNA replikasyonu üzerine, hücre bölünmesi astarlanmalıdır. mitoz, ilk safhada, birinci faz, siklin B / CDK1 aktivasyonu ile başlatılır. Profaz kromozomlarına kromatin malzemesinin yoğunlaşma ile karakterize edilir. Nükleer zarf arıza profaz ve prometafaz arasındaki geçiş gerçekleşir. prometafaz olarak, sentrozomlar, iğ oluşumu için çekirdeklenme merkezi, kinetochore eki arama Mikrotübülleri uzatırken zıt kutuplarda göç etmeye başlar. Eki üzerine, dönüşümler mikrotübül eki-end ve gerilim kuvvetleri metafaz plakası 1 oluşturan kromozom yönlendirmek. Tüm kromozomlar doğru bağlıysa, iğ montaj kapısı, memnun olduğunu birlikte kardeş kromatidler tutan kohezinin halkaları ayrılmaktadır ve mikrotübül kardeşi çekmek için kısaltmakanafaz 2,3 sırasında zıt kutuplara kromatidler. Son aşama, telofaz, iki yeni çekirdeklerin etrafında nükleer zarfın hücre ve reform uzamasını içerir. Sitokinez iki yeni yavru hücrelere 4-6 sitoplazma ayırarak bölme işlemini tamamlar. Anahtar mitotik yollar (yani iğ montaj kontrol noktasında, sentrozom kopyalanması, kardeş kromatid uyum, vb.) Değiştirilmesi metafaz tutuklama, kromozomların missegregation ve genomik instabilite 7-10 neden olabilir. Sonuçta, yollar kontrol mitoz kusurları gelişimsel bozuklukları ve kanser, mitoz gerektiren görselleştirme ve canlı, omurgalı, çok hücreli organizma 10-16 yılında kusurlarına sebep olabilir.

Zebra balığı embriyolar nedeniyle şeffaf dokusu, mikroenjeksiyon kolaylığı ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme için büyük bir model organizma olarak hizmet vermektedir. zebrafish kullanarak, bu yazının genel amacı olancanlı 5D mitoz 17 (Şekil 1C) (X, Y, Z, saat ve dalga boyu) görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Farklı mitotik yollardaki kusurlu mutant zebrafish kullanılması bu tür arızalardan sonucu göstermektedir. Bu protokol için, Aurora B ve Esco2 mutantlar bu hataları göstermek için seçildi. Aurora B mili oluşumu ve mikrotübül bağlanma yer kromozom yolcu kompleksi (TBM) bir parçası olan bir kinazdır. Ayrıca, sitokinez 18,19 bölünme karık oluşumu için gereklidir. Zebra balığı, Aurora B eksikliği karık indüksiyon, sitokinez, ve kromozom ayrımı 20 hatalarına yol açar. Esco2, diğer taraftan, kardeş kromatid uyum 21,22 için gerekli olan bir asetiltransferaz olduğu. Böylece, metafaz-anafaz geçiş 23 de uygun kromozom ayrımı sağlamak için cohesin stabilize halkanın SMC3 kısmında cohesin acetylates. zebrabalıkları Esco2 kaybı ch yol açarromosome missegregation, erken kardeş kromatid ayrılması, genomik istikrarsızlık ve p53-bağımlı ve bağımsız apoptoz 24,25. Nedeniyle durumunu, auroraB hi1045 ve esco2 hi2865 mutant zebra balığı bu tekniği 25-27 göstermek için kullanılacaktır (bundan sonra aurB a / a ve esco2 a / a, sırasıyla şu şekilde adlandırılır).

Floresan etiketli hücre makine ile Kaplin konfokal mikroskopi mitoz 25,28,29 sırasında kromatin ve hücre zarı dinamiklerini görselleştirmek için araştırmacıların sağladı. Floresan etiketli histon tarihsel kromatin görselleştirmek için kullanılmıştır. Histonlar kromozom 30 oluşturan nükleozom yapısının sorumlu olan dört farklı çiftlerin (H2A, H2B, H3 ve H4) oluşan çekirdek proteinleridir. H2B tartışmasız floresan proteinleri en çok kullanılan histon ikenFare ve hücre kültürü, Histon 2A kullanımı Aile Z'nin (H2A.F / Z) zebrabalıkları 31,32 kullanılmak için de kanıtlamıştır. Konkanavalin A ve kasein kinaz 1-y, örneğin, hücre zarı lokalize ve daha önce deniz kestanesi ve Drosophila 33,34 hücre zarı görselleştirme etkili gösterilmiştir. Diğer çalışmalar CAAX floresan etiketli protein, hücre zarı etiketler göstermiştir ve Zebra balığı 31 başarılı oldu var. CAAX gibi farnesyltransferases ve Geranilgeraniltransferazlar gibi post-translasyonel modifiye enzimler tarafından tanınan bir motiftir. Bu enzimler tarafından değişiklikler proteinleri, hücre zarı 35 etiketleme, zara bağlı hale neden olur.

Nedeniyle zebrabalıkları önceki kullanım, bu protokol kromatin ve hücre zarı etiketlemek için H2A.F / Z ve CAAX kullanmayı seçti. Bu yöntemin uygulanması bireysel kromozom gözlemlemek için araştırmacı bireysel hücre düzeyinde mitoz izlemesini sağlayacakdinamikler, hem de aynı anda doku farklılaşması ve geliştirme etkileyebilecek birden fazla hücre bölünmeleri izlemek. Bu makale, bireysel hücre seviyesinde mitoz sırasında kromozom ayrımı dinamiklerini görüntüleme üzerinde durulacak. Bu yazının içinde, çeşitli mitoz bölünmeler gözlemlemek bölünme zamanı hesaplamak ve mitotik fenotipleri deşifre yeteneği resimli ve tartışılacaktır. Bu parametreler kullanılarak, fizyolojik ilgili veriler toplanabilir ve mitoz arızalardan etkilenen birçok hastalık durumlarıyla başvurdu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. in vitro transkripsiyon

  1. Enzim 31 sindirmek Notl kısıtlama pCS2-H2A.F / Z-EGFP ve / veya pCS2 mCherry-CAAX vektörleri Linearize. Vitro transkripsiyon kitinde bir RNA kullanılarak, üreticinin protokolüne uygun olarak, her şablonun 5 'başlıklı mRNA ürünleri oluşturur.
  2. Bir saflaştırma kiti kullanılarak şapkalı mRNA arındırın. üreticinin talimatlarına uyun. RNaz ücretsiz H2O ile Zehir
  3. bir spektrofotometre kullanılarak 260 nm'de absorbans ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. (OD 260 x seyreltme x 40 ug / ml).
  4. Her biri H2A.F / Z-EGFP ve mCherry CAAX RNase içermeyen H2O için ul / 100 ng RNA seyreltin RNA konsantrasyonu çok düşükse, flüoresan azalması veya mevcut olacaktır. Parlak örnekler fototoksisite ve photobleaching kaygıları azalacaktır. Diğer taraftan, çok RNA toksik ve / veya hedef etkilere kapalı yol açabilir.
    Not: Kalan Mağaza-80 ° C dondurucu içinde saflaştırılmış mRNA.

2. Zebra balığı Islahı, Embriyo Toplama ve mRNA Enjeksiyon 36-38

  1. iki bölgeye tankı ayırmak ve Zebra balığı tesiste kullanılan yetiştiricilik sistemi su ile her üretim tankı doldurmak için bir engel ile üreme tankları birleştirin.
  2. ıslah gece önce, zamansız ıslah önlemek diğer tarafta bariyer bir tarafında ve iki kadın balık iki erkek balık yerleştirmek için.
  3. Sonraki gün, buz üzerinde, daha önce hazırlanan mRNA'nın karışımı çözülme. tatlı su sistemi su ile üreme tanklarında su yerine ve engellerin ortadan kaldırılması. bariyerler çekti hemen sonra, 28.5 ° C bir enjeksiyon kalıp sıcak ve mikroenjeksiyon için ekipman kurmak.
    Not: enjeksiyon kalıpları hakkında bilgi için, Gerlach 36 bakınız.
  4. Bir çay süzgeci kullanılarak 15 dakika ve E ile temiz 100 x 15 mm Petri kabı içine yumurta durulama - yumurta her 10 topla3 Mavi (5 mM NaCl, 0.17 mM KCI, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO 4, 10 -5% metilen mavisi). E3 Mavi mantar büyümesini önlemek ve larva balık düzgün gelişimini sağlamak için kullanılır. Çiftleşme ve embriyo koleksiyonu hakkında daha fazla bilgi için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 bakın.
  5. Yerleştir tek hücreli bir ısıtılmış enjeksiyon kalıp embriyolar düzenleyerek embriyolar (Şekil 1A), istenen miktarda yumurta sarısı içine RNA enjekte edilir. Doğal embriyonik ölüm ve deney için gerekli% 15 daha fazla embriyoların üzerinde embriyonik enjeksiyonları yaparak döllenmemiş embriyolar için hesap. Zebra balığı embriyolarının mikroenjeksiyon Ek detaylar için, Gerlach 36 ve Porazinkski 37 başvurun.
    NOT: mRNA İlk kullanımda, önce 5D görüntüleme gerçekleştirmek için (en fazla 5 dpf'e hiçbir brüt gelişimsel kusurlar olarak tanımlanır) floresan ve canlılığı için en uygun dozu belirlemek için bir doz-eğrisi analizi gerçekleştirmek. 150-200 ng / mlembriyoların içine enjekte bu nedenle nihai konsantrasyon için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, genellikle uygun konsantrasyondur.
  6. Dikkatle değiştirilmiş 9 "cam Pasteur pipeti kullanarak kalıp enjekte embriyolar ayıklayın. Pipet değiştirmek için, bir top kıvamına gelinceye kadar bir Bunsen beki kullanarak sonuna eritin.
  7. Bir 28.5 ° C inkübatör 100 x 15 mm Petri E3 Mavi çanak ve evde enjekte edilen embriyolar yerleştirin.
  8. enjeksiyon sonrası altı saat, plakalardan herhangi bir ölü ya da döllenmemiş embriyolar kaldırmak ve temiz E3 Blue ekleyin. 28.5 ° C'de Ev embriyolar.

3. Hazırlama ve Görüntüleme için canlı balığı Embriyolar gömülmesi (Şekil 1B)

  1. İki saat görüntüleme önce, bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak GFP enjekte embriyolar ekran. E3 Blue ile yeni bir 100 x 15 mm Petri kabındaki parlak yeşil GFP ifade embriyolar yerleştirin.
  2. agaroz E3 Blue 100 ml düşük eriyik 1 g eklenerek% 1 düşük erime sıcaklığı olan agaroz bir stok solüsyonu kaynatılır. agaroz kullandıktan sonra, alüminyum folyo ile şişesi kapağı. stok solüsyonu bir ay kadar yararlıdır kalır.
  3. Kısım 17 x 100 mm kültür tüpü içine erimiş agar 3 mi. Kullanıma hazır olana kadar bir 42 ° C su banyosunda kültür tüpü yerleştirerek agaroz sıcak tutun. Zebra balığı embriyolar 36 anestezi için deiyonize edilmiş su içinde 15 mM Tricaine çözeltisi hazırlayın.
    Not: erken zaman noktalarında görüntüleme isteniyorsa, agar konsantrasyonu% 0,3 39 kadar düşük azaltılabilir.
  4. 15 mM Tricaine, ekranlı embriyolar, düşük erime agaroz, E3 Mavi ve diseksiyon ışık mikroskobu ile 35 mm cam lamel alt kültür çanak getirin. Dikkatle 5. cımbız ile embriyonun koryon çıkarın. üç embriyo için bunu yapın.
  5. Ayrı bir kapta dechorionated embriyolar anestezi olmak yerleştirin. lamel taban kabı kapağı genellikle bu amaç için kullanılır. Bir transfer pipeti kullanarak, üç damla (yaklaşık 150 ul)kadar veya embriyolar yeterince anestezi edilmiştir (lamel alt çanak kapağı kullanıyorsanız) 5 ml E3 mavi çanak 15mM Tricaine. % 1 erimiş agaroz tüpe 15 mM Tricaine çözeltisi - (200 ul, yaklaşık 150), ek olarak, 3-4 damla ekleyin.
  6. kesilmiş pipet 1 cm olan bir P200 pipet kullanarak; Lamel tabanlı çanak anestezi embriyolar transfer. Tricaine çözüm: herhangi bir aşırı E3 Mavi çıkarın.
  7. Embriyolar yanlışlıkla birbirine yakın kayması etmemelerini sağlamak için ayrı her damla tutarak, embriyolar üzerinde Tricaine çözümü: Düşük erime agaroz 10 ul - Yavaşça 5 ekleyin.
    Uyarı: Agaroz çok sıcak ise, embriyo zarar verecektir. 42 ° C de iyi bir sıcaklık agar korumak için.
  8. 21 G 1 ½ iğne kullanarak, yavaşça istenen konuma agaroz embriyo yönlendirin. Time-lapse görüntüleme için ters bir mikroskop kullanılarak zaman possib olarak lamel yakın ilgi alanları (ROI) bölgesini yönlendirmekle.
    Not: Genel amaçlar için, kuyruk bölgesi nedeniyle nispeten ince doku (Şekil 1A) için oryantasyon ve netlik kolaylığı sağlar. Bu sarısı ve fin kat çevreleyen epitel tabakası gibi diğer dokuların, 28,29 kullanılabilir. Bu dokular, ancak bu bölgeler yalnızca birkaç hücre tabakaları kalın, büyük netlik sunuyoruz. Bu protokolün amacı için, mümkün olduğunca çok sayıda hücre bölünmesi elde etmek için kuyruk bölgesi görüntü için faydalıdır.
  9. agar kısmi katılaşması için bir kaç dakika bekleyin. onun katılaşma test etmek için agar küçük bir parça parçalayın iğne kullanın. agar bir parça damla uzağa çekilebilir, bir sonraki adıma geçin.
  10. düşük erime agar gömülü embriyolar üzerinde bir kubbe oluşturan tüm lamel örtün. Ağar konfokal görüntüleme (Şekil 1A) için çanak geçmeden önce katılaşmaya izin verin.
  11. Agar katılaşma süreci (yaklaşık 10 dakika sürer) sırasında, 3 ml o hazırlamak(Yaklaşık 250 ul) 15 mM Tricaine beş damla F E3 Blue çözeltisi görüntüleme sırasında gömülü embriyolar üzerinde yerleştirilir.

Canlı Zebra balığı Embriyolar 40,41 4. 5D Konfokal Görüntüleme

NOT: Diğer konfokal sistemleri kullanarak 5D görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl ilgili ayrıntılar için Ariga 40 ve O'Brien 41 Bkz. Z-aralık, Z-yığının Z-derinlik, zaman aralığı, ve 5D tanımları Şekil 1C bakın.

  1. görüntüleme yazılımı açın ve 60X NA 1.4 objektife mikroskop ayarlayın. objektife daldırma yağı sürün ve mikroskop sahnede slayt tutucuya kültür çanak yerleştirin. eksen kontrolörü kullanarak, objektif lens üzerinde ilgi embriyo ortalamak ve kültür çanak karşılamak için yukarı objektif lens getirmek.
  2. Göz parça simgesine tıklayın ve mikroskop GFP filtre geçin. YG odaklanın. o lamel yakın doku üzerinde olacak OdaklamaEn iyi görüntüleme sonuçları ffer.
  3. kilidini çıkarın. (Yazılımında önceden belirlenmiş dalga boylarını) GFP ve mCherry kanalları seçmek ve normal seçeneği ortalama çizgisini ayarlayın.
  4. Kullan "Görünüm / Edinme Kontrolleri / A1 Tarama Alanı" A1 Tarama Alanı aracını açmak için komut.
  5. Taramaya başlamak. Tarama alanı mümkün olduğunca zebrafish kadar dolu, böylece eksen-denetleyici kullanarak, embriyo yerleştirin. lazer gücü, bu noktada uygun olduğu gerek yoktur. Gereksiz photobleaching önlemek için lazer gücünü azaltın.
  6. ND edinme kontrol panelini açmak için "Görünüm / Edinme Kontrolleri / ND edinimi" komutunu kullanın.
  7. Z-yığın parametrelerini ayarlamak için taramaya başlayın. Hücreler artık görünür olduğu Z-yığın hücreleri odakta olmadığı durumlarda üst sınır ve alt sınırını ayarlayın. görüntüleme alanına genişletebilir büyüme ve hücre hareketi için numune üzerinde 3 mikron alanı için izin verin. Bu pro gösterilen rakamlar Z-yığınıProtokolün embriyo kuyruk 40 mikron Z-derinlik kaplı.
  8. 2 um Z-aralık adım boyutunu ayarlamak. Ortalama olarak, hücre çapı 10 um; Bu nedenle, 2 um görüntüleme verileri beş aralıkları, her bir hücre için, analiz edilecek üretecektir.
    NOT: elde edilebilir görüntünün derinliği Z aralığına bağlıdır. Z çözünürlüğü mümkün (büyük Z-derinlik) olarak mitoz geçiren birçok hücreler olarak görüntüye için Z boyutunda genel derinlik kazanmaya kurban. Z derinliği (küçük Z-derinlik) kurban ederken ters ki, doğrudur, adım boyutunu azaltarak, Z çözünürlük, elde edilir.
  9. Görüntü lazer gücünü, HV ayarlayın ve seviyeleri ofset. Deneyler, bu protokolde gösterilmiştir için aşağıdaki lazer gücü, HV kullanabilir ve GFP kanal için sırasıyla ilgili seviyelerde belirlenen seviyeleri ofset; 5, 120 - - 2 140 ve -11 -9. MCherry kanal için, aşağıdaki lazer gücü, HV kullanın ve sırasıyla seviyeleri, ofset; 3-6, 120-140, ve -3-8. parametreleri ayarlandıktan sonra, numunenin fototoksisite ve photobleaching neden olabilir gereksiz lazer maruz kalmasını önlemek için tarama kapatın.
  10. 2x hat ortalama simgesini seçin. "Ortalama 4x hattı" büyük ölçüde tarama süresini artırırken "Hayır ortalama" bir grenli bir görüntü oluşturur. 2x hattı Ortalamanın kullanılması görüntü kalitesi ve hızlı tarama süresi sunuyor.
  11. deney için gerekli olan uygun zaman aralığı ve süreyi seçin. Vahşi tip bölümleri için, 2 saat, iki dakikalık bir zaman aralığı (Şekil 1, 2, 3A ve 3B'de kullanılan) mitotik süresinin belirlenmesi için uygundur. Daha uzun bir süre 30 dakika mili düzeneği kontrol noktasında aktive Bölümler Şekil 3C'de gösterildiği gibi floresan korumak için, dört saat süre ile, beş dakikalık aralıklarla için daha uygundur.
  12. "Dosyaya Kaydet" kutusunu işaretleyin ve edinsel ediliyor otomatik olarak dosyayı kaydetmek için dosya adı. Tüm pa Çift çeknütrisyonel parametrelerin değerlendirilerek nütrisyonel doğru ayarlanmış ve "run start" vuruluyor.
  13. iktisap tamamlandıktan sonra, üç boyutlu biçimde dosyasını görüntülemek ses eşik simgesine tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2 AB vahşi tip Zebra balığı kuyruk geniş bir alan görünümünü kullanarak birçok hücre bölünmeleri gözlemlemek yeteneği gösterir. Yedi mitotik hücreler 14 dakika süre (Film 1) 'de görüntülü. İki saat zaman Ders kapsamında, 40 mitotik olayların ele geçirildi. Ortalama olarak, 50 bölünen hücreleri AB gözlendi ve aur B a / a embriyolar (Şekil 2B) 30 bölünen hücreler. Görüntülü hücre sayısı, (Şekil 2C) hesaplanmıştır görüntülü hücre sayısı ile mitotik hücre oranı hesaba katılması için. Bu veriler, görüntülü aur B a / a embriyolar (Şekil 2B), fakat hücre, daha az sayıda mitoz geçmekte hücrelerin daha düşük bir sayıda olmadığını göstermektedir. Bu gibi olayların istatistiksel olarak anlamlı bir sayı elde etmek için yeteneği istatistiksel güce yardımcı olacaktır.

Şekil 3 mitoz süresi miktarının eklemek için bu tekniği genişletir. Time-lapse oturumu elde edilir sonra, bireysel bir hücre yakınlaştırma aracı (Şekil 3A, B) kullanılarak yeterli çözünürlüğe sahip mitoz harcanan süre için analiz edilebilir. Mitotik süresi çok zaman aralıkları bir hücre bölünmesini almak nasıl sayarak elle hesaplanır. Zaman aralıklarının sayısı daha sonra her bir Z-yığını arasındaki zaman ile çarpılır. Örneğin, Şekil 3C'de, bölme 12 zaman aralıklarında aldı ve her Z-yığını arasındaki zaman aralığı 2 dakika idi. Bu nedenle, bu hücre için bölünme süresi 24 dakikaydı. Ortalama AB vahşi tip bölünme süresi 25 dk ve aurB m / m 58 dakika (Şekil 3B). AurB m görüldüğü gibi Uzamış bölünme zamanı / m mili montaj kontrol noktası nedeniyle hatalı kine için memnun olmamıştır düşündürmektedirtochore ekleri 1,2. Yabani tip embriyolar yakınlaştırılmış daha yakından bakmak alarak, her mitotik faz (Şekil 3C, Film 2) ayırt edilebilir. Buna ek olarak, mitotik kusurlar mitotik yakalanmayı içerir ve mikronükleus (Şekil 3D, Film 3) 'in bir binükleer hücre ve sonraki oluşumu ile sonuçlanır sitokinezi başarısız aurB a / a embriyo gözlenebilir. Mitotik kusurları gösteren analizde uzaklaştırdınız Bu Şekil 3B edinilen artan bölünme zamanı destekler.

Diğer çeşitli mitotik kusurları ve Şekil 4'te incelenmiştir karşılaşılabilir hücre kaderi çeşitli; esco2 + / m ve esco2 a / a embriyolar gösterdi. Bir esco2 + / M embriyo hatalı kromozom hareketleri yakalanır ve congression kusur olarak tanımlanabilirs. uygunsuz mikrotübül ekleri yapıldığında Congression kusurlar ortaya çıkar. Bu kusurlar kromozom hatası metafaz plakasına doğru göç etmeye neden olur. metafaz plakasına doğru congressed değil min 20 ve 46 özellikle tanımlanabilir Eşli kardeş kromatidler, ilk, en az 14. Anaphase başlangıçlı metafaz plakası yanı sıra sağ eşleştirilmiş kardeş kromozomlardalerde hizalı kardeş kromatidler ayıran en görülebilir bu ayrı kardeş kromatidler çekirdeğe (T ​​= 50, Şekil 4A, Movie 4) dışında izole kalır Buna ek olarak dakikada 50 gözlemlenmiştir, olası mikronükleus oluşumu gözlenir. Şekil 4B'de, çok-kutuplu bir bölümü (Film 5) görüntülenmiştir. Çok kutuplu bölünmeler genellikle sentrozom amplifikasyon nedeniyle oluşur, ancak diğer 42 anlamına aracılığıyla oluşabilir. Şekil 4C'de, bir esco2 a / a hücresi ilk erken kız kardeş kromatid separat göstermektediriyon ve iş mili dönüşü 9,43,44. Bu panelde gösterilen başka hücre kaderi merotelic ekleri 45,46 çözülmemiş olduğu bir anafaz köprüdür. anafaz köprüsü ilk dakikada 62. görülebilir kromatin hücre sitokinezi geçiyor için erken decondense iken görünür. Sitokinez meydana gibi, bölünme karık kesilme meydana gibi bir anafaz köprüsü (Şekil 4C, Film 6) oluşturmak için kromatin materyali çeker, yoğunluğu azaltılmış kromozomlar üzerinde çarpar ve. Hücresel kaderi ölçmek amacıyla, burada gösterilen olmasa da, bütün her karede mitotik bölünmeleri ve sergiledikleri hücre kaderi türünü kaydedin. Kaydedilen bölünmeler toplam sayısına göre her kaderin hücre sayısını bölün ve hücre kaderi yüzdesini hesaplamak için 100 ile çarpın.

Şekil 1
Şekil 1: Protokol Çizimler Anahat. (A) (B) embriyo gömme işleminin şematik çizimi. Enjekte edilen embriyoların dechorionated ve anestezi gerekir. Embriyolar daha sonra lamel dipli kaba aktarılır ve aşırı E3 mavi uzaklaştırılır. Düşük erime agar her bir embriyo kapsayan ayrı kubbe oluşturmak için kullanılır. Kuyruk lamel yakın yani embriyolar Orient. Bütün lamel kapsayan ağar eklemeden önce iki dakika bekleyin. Agar görüntüye geçmeden önce katılaşmış kadar bekleyin. (C) şematik çizim şartlarını protokol ve tartışma kullanılan Z-aralık, Z-yığını, Z-derinlik, zaman aralığı, zaman süresi ve 5D tanımlamak için kullanılır. Z-aralık mikroskop Z-yığını oluşturmak için derin numune içine hamle olarak her görüntünün arasındaki mesafe olarak tanımlanır. Z-yığını bir üzerinden alınan görüntülerin hepsitanımlı Z aralıklarla numune. Z-yığınında seyahat mesafe Z-derinlik tanımlar. Zaman aralığı tek Z-yığını ve bir zaman atlamalı görüntü oluşturmak için bir sonraki Z-yığını arasında zaman miktarıdır. Zaman süresi görüntüye kullanılan zaman toplam miktarıdır. 5D boyutları olarak tanımlanır X, Y, Z, saat ve floresan emisyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Zaman-Lapse Görüntüleme Canlı Zebra balığı Embriyo Çoklu Mitotik Olaylar yakalar. (A) AB vahşi tip bir uzaklaştırdınız deneyden Time-lapse fotoğraflar, çoklu mitotik olayları gösteren 24 hpf Zebra balığı. Yıldız mitoz yedi hücrelere karşı etmektedir. t, dakika olarak geçen zamanı =. Ölçek çubuğu = 5 mikron. (B) mitotik ce sayısı24 hpf AB ve aurB m / m zebrabalıkları kuyrukları gözlenen rf. ± st ortalama. dev., n = 3 embriyo / genotip. (C) AB ve aurB m / toplam hücre sayısı başına mitotik hücrelerin oranı 24 hpf Zebra balığı kuyrukları m. ± st ortalama. dev., n = 3 embriyo / genotip. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Bireysel Hücre Analizi yakalar Her Mitotik Faz ve Mitotik süresi. (A), AB vahşi tip geniş alan görüntüsü arasından seçilmiş bir hücre, 24 HPF zebra balığı embriyo Şekil 2A'da gösterilmiştir. (B) Bölümü süresi AB için gözlenir ve aurB m / m Hücreler ve nükleer zarf bre çıkarım hesaplananİki yeni yavru hücrelerin oluşmasına bir hücrede yoğunlaşmış kromatin ilk gözlem de akdown (NEB). n = 3 embriyo / genotip, n = AB için 66 tümen, n = aurB m / m 29 tümen, *** p değeri <0.001. (C) AB vahşi tip hücre mitoz yoluyla faz ilerlemesini görselleştirmek için kırpılır . t = dak. Ölçü bar = 5 um. (D) aurB a / a Hücre sitokinez yetmezliği ve mikronuklei oluşumu ile sonuçlanarak mitotik arrest içeren mitoz yoluyla mitotik ilerlemesini görselleştirmek için kırpılır. Oklar mikronükleuslar doğru etmektedir. t, dakika olarak geçen zamanı =. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4.Tek Hücre Canlı Görüntüleme Mitotik Mutant kromozom Ayrışma ve Bölümü ile İlişkili Çoklu Mitotik Kusur yakalar Zebra balığı. (A), bir esco2 + / m embriyoda congression kusurları geçiren bir hücrenin görüntüsü kırpılmış. ince ok metafaz plaka içine geri çekilir, sol kromozomu izler. kalın ok metafaz plaka geri çekti ve bir mikronukleus oluşturmak için olayla değil doğru kromozomu izler. çift ​​ok anafaz başlangıcında değil kongreyi yaptılar doğru kromozom ayrılmasını göstermektedir. Insets Kongreye başarısız kromozom görünümlerinde uzaklaştırdınız göstermektedir. Insets kırpılmış ve parlaklık iyi görünüm için geliştirilmiştir. CAAX flüoresans daha kolay kromozom görselleştirmek için uzaklaştırılmıştır. Ölçek çubuğu = 5 mikron. (B) A bir esco2 bir çok kutuplu bölünme ile sonuçlanır mitotik tutuklama geçiren bir hücrenin görüntü kırpılmış + / M embriyo. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Parçacığı gibi parantez tarafından belirtildiği iki çekirdek arasında çekerek görülen anafaz köprüsü oluşumu ile sonuçlanan bir hücre geçiren uyum yorgunluk (C) kırpılmış bir görüntü. Ölçek çubuğu = 5 mikron. t min geçen süre =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Film 1
1. Birden fazla hücre bölünmeleri enjekte yabani tip zebrafish embriyo geniş bir görünümde görüntülendi olabilir Movie (sağ indirmek için tıklayın).

Film 2 Mitoz Film 2. Aşama kolayca yabani tip zebrafish embriyo görüntülenebilir (r ight indirmek için tıklayın). Nükleer zarf arıza bir metafaz plakanın oluşturulması için kardeş kromozomlardalerde congression doğru çekirdek ve gelirlerin düzensiz görünümü ile anlaşılmaktadır . Doğru ayrışma meydana gelir ve iki yeni kız hücreleri verir.

Film 3
Film 3. Canlı görüntüleme aurB m / m embriyo kromozom özledim ortayaegregation, sitokinezi başarısız ve mikronuklei oluşumu (sağ indirmek için tıklayın). Nükleer zarf dökümü, kromozomlar bölümü uzanan eksen üzerinde döndürmek için uygun bir metafaz plakanın oluşturulması ve devam edemiyor zıt kutuplara dağılım çekirdeğin düzensiz görünümü ile anlaşılmaktadır hücrenin süresi. Sitokinez 4N hücreli ve çok mikronükleuslar sonuçlanan oluşmaz.

Film 4
Film 4. Congression kusurları bir gözlenir esco2 + / m embriyo (sağ indirmek için tıklayın). Nükleer zarf arıza çekirdeğinin düzensiz görünümü ile anlaşılmaktadır. metafaz plakası oluşturulduktan sonra, bir kaç indireysel kromozomların her iki tarafa dağılır. sağa kromozom metafaz plaka dışında kalır ve anafaz başlangıcında kardeş kromatidler ayıran görülebilir ise sola kapalı biri bireysel kromozom sonunda metafaz plaka içine geri çekilir. Hücre uzun bölünme zamanı ancak potansiyel mikronükleus oluşumu ile nihai böler sergiler.

Film 5
Film 5. Çok kutuplu bölünme, bir esco2 + / m embriyo gözlenmiştir (sağ indirmek için tıklayın). Nükleer zarf arıza çekirdeğinin düzensiz görünüm anlaşılabilir ve daha sonra kromozomlar Y-şekil indicativ oluşturmak için birleştirme olduğunu3-mili direkleri örn. Hücre uzun bölünme zamanı sergiler ama sonuçta 3 yavru hücreye bölünür.

Film 6
Film 6. kromatid ayrılması ve anafaz köprüsü oluşumu esco2 m / m embriyo gözlenen Erken kardeş (sağ indirmek için tıklayın). Nükleer zarf arıza kromozomların bir kuramadı hücre boyunca dağılım sonra çekirdeğin düzensiz görünüm anlaşılabilir ve uygun metafaz plakası. Kromatin önce sitokinez ve hücrenin bölünmesinden olarak decondenses iki hücre arasında bir anafaz köprüsü oluşturur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntemin kullanılması bir in vivo ve zamana bağlı bir şekilde iki yeni hücre oluşturmak için nükleer zarf arıza, mikrotübül kinetochore ekleri ile metafaz plaka oluşumunu ve kardeş kromozomlardalerde ayrımını anlaması için izin verir. Hücreler doğal fizyolojisi görüntülü çünkü zebrafish mitoz gözlemlemek yeteneği, doku floresan proteinleri kullanılabilmesi için, onlar nispeten hızlı geliştirmek ve zaman atlamalı görüntüleme sağlayan şeffaf sabit örnekleri ve hücre kültürü sistemleri üzerinden avantajlıdır elde edilebilir. Bu protokol için, yetişkin zebrabalıkları kullanımı nedeniyle cilt veya göze değil, daha kalın dokuya bağlı olarak elde edilebilir, sınırlı Z derinliği sınırlıdır. H2A.F / Z-EGFP ve mCherry CAAX ifade eden transgenik hayvanlar, farklı mutant zebrabalıkları mRNA'nın enjeksiyonları aynı amaçla, çok yönlülük ve kullanım kolaylığı için kullanılabilir olsa da, genetik haç avantajlıdır. durumlarda mitotik analiz buradaÜç gün sonra fertilizasyon (dpf) veya daha embriyolar gerekli transgenik hayvanları, hızla gelişen organizmanın RNA yarı-ömrü için gerekli olacaktır.

mitoz görselleştirmek için diğer floresan proteinleri bu protokole uygun. Örneğin, H2B-GFP mRNA kromatin doları / Z-EGFP H2A.F bir alternatif olduğunu ve benzer etiketleme sağlar. Bu teknikte kullanılabilen diğer floresan-etiketli proteinler, sırasıyla, çekirdek zarı, sentrioller artı uç mikrotübüller, kinetokor oluşumunu uyarır ve mikrotübül CANLI embriyo görüntüleme için izin POM121, fotoseli, EB1, Hec1 ve EMTB içerir 32,47-51.

Bu protokol kaliteli sonuçlar elde etmek için yürütülen gereken birkaç anahtar görüntüleme adımlar vardır: 1) parlak floresan ve mümkün olduğunca hiçbir toksisite elde etmek için mRNA kalitesi ve konsantrasyonu optimize etmek için emin olun. Daha fazla floresans daha az lazer maruz kalma ve bu nedenle daha az photoblea yol açacaktırÇing ve fototoksisite. 2) embriyo tam anestezi ve ağar güvenli olması gerekir. Minör hareketler sonucu değiştirecektir ve deney mahvedebilir. embriyo aşaması görüntülü istenen 3) agar konsantrasyonu uygun olmalıdır. 24 hpf ve ayrıca% 1 düşük erimeli agaroz uygundur. Görüntüleme 12 hpf veya daha önceki,% 0.3 agaroz çözüm 39 kullanılması gerektiğini durumunda. 4) embriyoda YG mümkün olduğunca lamel kadar yakın olmalıdır. Bu adım kuyruk görüntüleme için bir sınırlama yoktur. gözler, cilt, dorsal bölge, yumurta sarısı ve yüzgeç kat, bu protokolü kullanarak diğer alanlarda örnekleridir.

Zaman görüntüleme sabit embriyolar veya dokulardan bu protokolü ayıran belirleyici faktördür. Z-yığını, Z-aralık, time-lapse aralığı ve zaman atlamalı süre ayarlarken, akılda deney (Şekil 1C) bağlamını tutmak önemlidir. Bir vahşi tip hücre bölünmesi, genellikle 24 HPF yaklaşık 25 dakika sürer. thörneği, iki saat boyunca, iki dakikalık bir zaman aralığına sahip bir z-yığın doku 40 um, kapsayan 2 um Z aralığı etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bundan başka, bozuk mitoz ile embriyolar, mitotik arrest hücreler büyük ihtimalle, mevcut olacaktır büyük ölçüde hücre bölünme kez artar. Birden fazla tam bölümleri elde etmek için, bekleme süresi 4 saat 2 saat mesafede, yani artırılması gerekmektedir. Daha uzun kazanım süresi daha fazla lazer gücü örnek ortaya çıkarmak ve photobleaching ve fototoksisite riskini artıracaktır. Bu durumda, her bir Z-yığını arasında geçen süre arttırılmalıdır. Dinamik kromozom hareketleri Z-yığınlarının arasındaki zaman aralığını artırarak kurban edilecek, ancak zaman süresi elde edilir. üzerinde iki saat sürebilir hücre bölünmeleri görüntüleme Bu gereklidir.

doğrudan ele değildi rağmen, bu protokol daha doğru bireysel kromozom mo görselleştirmek için Z-düzleminde bir yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için optimize edilebilirvements. Örneğin Şekil 4A, iki missegregated kromozom gözlenir. (Kalın okla belirtildiği) sağa kromozom başlangıçta parlak ve odakta ancak son birkaç karelerde karartır. 2 mikron Z-arayla, uncongressed kromozom Z-aralık arasında düşer. Yakalama dakika hareketleri ve tekil kromozom olayları Z düzleminde çözünürlüğünü artırarak yapılabilir. Bunu yapmak için, A1 Tarama Alanı aracını kullanarak tek bir hücre üzerinde yakınlaştırmak. Z-yığını parametreleri ayarlarken, küçük bir Z-aralık mesafe kullanın. 1 mikron - önerilen aralık 0.5 olduğunu. Buna ek olarak, her bir Z yığını arasında bir zaman aralığının kısaltılması, iki dakika ile 30 saniye için, yani, her bir zaman dilimi arasında yumuşak geçişler yaratacak - 1 dak. görüntüleme bu tür bir uyarı elde edilebilir sınırlı Z derinliğidir. Nedeniyle küçük Z-aralık ve zaman aralığına, daha doku küçük bir zaman dilimi içinde lazerler maruz kalacağı. Bu, sm üstesinden gelmek için,aller zaman süresi kullanılabilir; ancak bu araştırmacı bölünmeleri yakalamak istiyorum ne kadar da bağlıdır.

Bu değişikliklerle yardımcı olabilecek bir benzetme bir akordeon gibi Z-yığının düşünmektir. körük her pli arasındaki mesafe Z aralığı ve Z derinlik akordeon uzunluğu ile temsil edilmektedir. bir (Z-derinliğini artırır) akordeon uzanıyor olarak, örnek bir daha lazere maruz tahakkuk istemem bir örneği olarak, körük (Z-aralık) kıvrımlarında arasındaki mesafe de artmalıdır. ters akordeon sözleşmesi olarak bu doğrudur, Z-derinlik azalır. Körük sözleşme pileler, hem de Z aralığında bir azalmaya karşılık gelir. Bu benzerlik, sabit ve canlı örneklere uygulanabilir. Zaman denkleme ilave edildiğinde karmaşıklığı Bu protokolde artar. akordeoncu uzatmak veya akordeon bulaşabilir zaman sonlu bir miktar var. bu Temsilci Vekilizaman aralığı ts. karşılamak amacıyla daha fazla mesafe (Z-derinlik) zaman aralığı artırmak gerekir. Yanı sıra, daha fazla müzik dinlemek için, bir, bu protokol bakımından zaman (zaman süresi) daha uzun bir süre için dinlemek gerekir daha fazla hücre bölünmeleri görebilmesi için, zaman süresi artırmak gerekir. Akılda tutulması gereken bir bileşik faktör olduğu oynanır fazla müzik, daha yorgun akordeoncu. Bu son boyut, floresan benzer. Numune verilir daha fazla lazer pozlama, daha photobleaching ve fototoksisite (yorgunluk) bir sorun haline gelir.

Özetle, bu protokol, farklı analizler için geçerli canlı zebrafish embriyo mitoz görselleştirmek için bir yöntem ayrıntıları; 1) bölme numarası 2) bölme süresi 3) bölümü kader ve 4) yüksek çözünürlüklü kromatin dinamikleri. dinamiklerini centriole için mikrotübül kinetochore ekleri arasında değişen mitotik bileşenleri görselleştirmek için birden fazla olasılık uygulanabilir. yeteneği birleştirenZebra balığı genom düzenleme son gelişmeler ile in vivo görüntüleme mitoz kolay bir omurgalı bir organizmanın 25,26,52-56 insan hastalığı modellemek için mitoz çeşitli yönleriyle mutantlar üretmek için yapacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCS2 vectors Gift from K. Kwan For plasmid of interest
NotI-HF restriction enzyme New England BioLabs R3189S For restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kit Life Technologies AM1340 For in vitro transcription
RNeasy Mini kit Qiagen 74104 For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 For housing embryos
microinjection mold homemade For holding embryos during microinjection
Agarose II Amresco 0815-25G For embedding embryos
Tricaine Sigma-Aldrich E10521-10G For anesthetizing embryos
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich C8106 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M7506 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate Sigma-Aldrich MB1 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tube Fisher Scientific 50-819-812 For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish  MatTek Corp P35G-0-20-C  No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezers Dumont 72701-D For dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needle Becton Dickinson 305167 For positioning embryos in agar
Dissecting microscope Nikon AZ100 For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscope Nikon A1+ For time-lapse imaging
Confocal software NIS Elements AR 4.13.00 For image acquisition and processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
  2. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  3. Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
  4. Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
  5. Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
  6. Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
  7. Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
  8. Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
  9. Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
  10. Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
  11. Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
  12. Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
  13. Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
  14. Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
  15. Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
  16. Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
  17. Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
  18. Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
  19. Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
  20. Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
  21. Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
  22. Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
  23. Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
  24. Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
  25. Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
  26. Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
  27. Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
  28. Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
  29. Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
  30. Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
  31. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  32. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  33. Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
  34. Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
  35. Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
  36. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
  37. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
  38. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  39. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
  40. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
  41. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
  42. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
  43. Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
  44. Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
  45. Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
  46. Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
  47. Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  48. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
  50. Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
  51. Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
  52. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  53. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  54. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  55. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  56. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).

Tags

Gelişimsel Biyoloji Sayı 113 Canlı görüntüleme Zebra balığı mitoz kromozom dinamikleri konfokal görüntüleme genomik instabilite mitoz tutuklama hücre biyolojisi mikroenjeksiyon,
Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Percival, S. M., Parant, J. M.… More

Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218, doi:10.3791/54218 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter