Abstract
מיטוזה היא קריטית לצמיחה האורגניזם והבחנה. התהליך הוא מאוד דינמי ומחייב הורה אירועים להשיג עיבוי הכרומטין נכון, מצורף קינטוכור-microtubule, פרדה כרומוזום, ואת cytokinesis בתוך מסגרת זמן קטנה. שגיאות בתהליך העדין יכולות לגרום מחלות אנושיות, כוללים מומים מולדים וסרטן. גישות מסורתיות חוקרות מצבי מחל mitotic אדם לעתים קרובות מסתמכות על מערכות תרבית תאים, אשר חסרים את הפיסיולוגיה הטבעית בהקשר התפתחותי / רקמות ספציפיות יתרון כאשר לומדים מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתגבר על מכשולים רבים על ידי מתן דרך לחזות, עם רזולוציה גבוהה, דינמיקת כרומוזום במערכת החולייתנים, דג הזברה. פרוטוקול זה יפרט גישה, שניתן להשתמש בם כדי להשיג תמונות דינמיות של תאים מתחלקים, הכוללים: במבחנת שעתוק, רביית דג זברה / איסוף, הטבעה עוברת, ולאחר הזמן לשגות הדמיה. אופטימיזציה modifications של פרוטוקול זה גם נחקר. שימוש H2A.F / Z-EGFP (תוויות הכרומטין) ו mCherry-CAAX (קרום התא תוויות) עוברים מוזרק mRNA, מיטוזה ב AB wild-type, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה הוא מדמיין. הדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של דג זברה מאפשרת להתבונן mitoses המרובה לכמת פגמי mitotic סטטיסטיים ועיתוי של התקדמות mitotic. בנוסף, תצפית של היבטים איכותיים המגדירים תהליכי mitotic פסולים (כלומר, פגמי congression, missegregation של כרומוזומים, וכו ') ותוצאות כרומוזומליות פסולות (כלומר, aneuploidy, polyploidy, גרעינונים, וכו') הם נצפו. assay זה יכול להיות מיושם על תצפית של / בידול רקמת פיתוח הוא נוח לשימוש דג הזברה מוטציה וסוכני תרופתי. ויזואליזציה של כמה פגמים מיטוזה להוביל להפרעות סרטן והתפתחותיות יהיה מאודלשפר את ההבנה של בפתוגנזה של המחלה.
Introduction
מיטוזה הוא חיוני בתהליכים תאיים קריטי לצמיחה, בידול, והתחדשות בכל יצור חי. עם הכנה מדויקת שכפול של דנ"א ביניים, התא ערוך לחלק. השלב הראשון של מיטוזה, prophase, הוא שיזם ההפעלה של cyclin B / Cdk1. Prophase מאופיין עיבוי של חומר הכרומטין לתוך הכרומוזומים. פירוט המעטפה גרעיני מתרחש במעבר בין prophase ו prometaphase. בשנת prometaphase, centrosomes, במרכז nucleating להיווצרות ציר, להתחיל להגר הקטבים תוך הארכת microtubules בחיפוש מצורף קינטוכור. עם קובץ מצורף, המרות קצה בדבר עיקול microtubule וכוחות המתח לכוון את הכרומוזומים להרכיב צלחת metaphase 1. אם כל הכרומוזומים מחוברים כהלכה, מחסום הרכבת הציר בא על סיפוקו, טבעות cohesin מחזיקות את כרומטידה האחות יחד הם בקעו, ו microtubules לקצר למשוך אחותוכרומטידה כדי קטבים מנוגדים במהלך anaphase 2,3. השלב הסופי, telophase, כרוך התארכות התא הרפורמציה של מעטפת הגרעין סביב שני הגרעינים החדשים. Cytokinesis משלים את התהליך החלוקה על ידי הפרדת הציטופלסמה של התאים הבת החדשים שני 4-6. שינוי מסלולי mitotic מפתח (כלומר, מחסום הרכבת ציר, שכפול centrosome, לכידות כרומטידה אחות, וכו.) יכול לגרום למעצר metaphase, missegregation של הכרומוזומים, 7-10 יציבות גנומית. בסופו של דבר, פגמי מיטוזה שליטת מסלולים יכולים לגרום פרעות התפתחותיות וסרטן, ויזואליזציה מחייב של מיטוזה והפגמים שלה חי, חוליות, רב תאי אורגניזם 10-16.
עוברי דג הזברה לשרת כאורגניזם מודל נהדר עבור הדמיה לחיות בשל רקמה שקופה, קלות microinjection, ופיתוח מהיר. שימוש דג זברה, המטרה הכוללת של כתב היד הזה היאמתארים שיטה של 5D חי (מידות X, Y, Z, זמן, אורך הגל) הדמיה של מיטוזה 17 (תרשים 1C). שימוש מוטצית דג הזברה פגומה במסלולי mitotic שונים להדגים התוצאה של פגמים כאלה. עבור פרוטוקול זה, מוטציות אורורה B ו- Esco2 נבחרו כדי להמחיש את הפגמים הללו. אורורה B הוא קינאז כי הוא חלק מקומפלקס נוסעים כרומוזום (CPC) המעורבים ביצירת ציר והתקשרות microtubule. היא נדרשת גם להיווצרות הקמט מחשוף ב cytokinesis 18,19. בשנת דג הזברה, מחסור ב אורורה מוביל פגמים אינדוקציה תלם, cytokinesis, וכרומוזום הפרדה 20. Esco2, ומצד שני, הוא acetyltransferase כי הוא חיוני עבור לכידות כרומטידה אחות 21,22. זה acetylates cohesin על החלק SMC3 של הטבעת ובכך מייצב cohesin כדי להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה במעבר metaphase-anaphase 23. אובדן Esco2 דג הזברה מוביל CHmissegregation romosome, הפרדת כרומטידה אחות מוקדמת, חוסר יציבות גנומית, ו- p53 תלוי אפופטוזיס עצמאית 24,25. בשל הזמינות, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה (להלן המכונה aurB מ / מ 'esco2 מ / מ', בהתאמה) ישמש כדי להמחיש את הטכניקה הזו 25-27.
מיקרוסקופיה זיווגי confocal עם מכונות תא ניאון מתויגות אפשרה לחוקרים לחזות דינמיקת הכרומטין קרום התא במהלך מיטוזה 25,28,29. פלורסנט מתויג היסטונים שימשו היסטורית לדמיין הכרומטין. ההיסטונים הם חלבונים גרעיניים מורכב מארבעה זוגות שונים (H2A, H2B, H3, H4 ו) כי הם אחראי המבנה הנוקלאוזום כי מלחינת כרומוזומים 30. בעוד H2B הוא לטעון את היסטון השימושי ביותר עבור חלבוני ניאון בהעכבר תרבית תאים, השימוש היסטון 2A, Z משפחה (H2A.F / Z) הוכיח גם לשימוש 31,32 דג הזברה. Concanavalin A ו- קזאין קינאז 1-גמא למשל, למקם את קרום התא בעבר הוכח יעיל לדמיין את קרום תא קיפודי ים תסיסנית 33,34. מחקרים אחרים הראו כי חלבון פלואורסצנטי מתויג CAAX תוויות קרום התא היה מוצלח דג זברה 31. CAAX הוא מוטיב כי הוא מוכר על ידי אנזימים שינוי שלאחר translational כגון farnesyltransferases ו geranylgeranyltransferases. שינויים על ידי אנזימים אלה לגרום חלבונים להפוך קרום קשור, ובכך תיוג קרום התא 35.
בשל השימוש לפני דג זברה, פרוטוקול זה בחר להשתמש H2A.F / ת ו CAAX לתייג הכרומטין קרום התא. יישום של שיטה זו יאפשר החוקר לפקח מיטוזה ברמת התא היחידה להתבונן כרומוזום פרטדינמיקה, וכן בו זמנית לפקח חלוקות תא מרובות עלולים להשפיע בידול רקמות ופיתוח. מאמר זה יתמקד הדמית הדינמיקה של פרדה כרומוזום במהלך מיטוזה ברמת התא היחידה. בתוך כתב היד הזה, את היכולת להתבונן כמה חטיבות mitotic, לחשב זמן חלוק, ולפענח פנוטיפים mitotic שתודגם ודנה. באמצעות פרמטרים אלה, נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן לאסוף להחיל מצבי מחלה כמה מושפע פגמים mitotic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תמלול 1. במבחנה
- Linearize וקטורים pCS2-H2A.F / Z-EGFP ו / או pCS2-mCherry-CAAX ידי הגבלה NotI האנזים לעכל 31. שימוש RNA בערכת שעתוק במבחנה, ליצור מוצרי mRNA 5 'כתרים מכל תבנית, על פי הפרוטוקול של היצרן.
- לטהר את ה- mRNA כתרים באמצעות ערכת טיהור. עקוב אחר ההוראות של היצרן. Elute עם H RNase ללא 2 O.
- קבע את הריכוז של RNA על ידי ספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. (OD 260 x דילול x 40 מיקרוגרם / מ"ל).
- לדלל את RNA ל 100 ng / μl עבור כל H2A.F / Z-EGFP ו mCherry-CAAX עם RNase ללא H 2 O. אם ריכוז RNA הוא נמוך מדי, את הקרינה תפחת או נעדר. דגימות בהירות תקטנה את חשש phototoxicity ואת photobleaching. מצד השני, גם RNA הרבה יכול להיות רעיל ו / או לגרום מחוץ תופעות יעד.
הערה: אחסן את הנותריםmRNA מטוהר במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
2. גידול דג זברה, אוסף עובר, הזרקת mRNA 36-38
- הרכב טנקי רבייה עם מחסום להפריד הטנק לשני אזורים וממלאים כל אקווריום רבייה במי מערכת מדגה בשימוש במתקן דג הזברה.
- כדי למנוע רבייה בטרם עת, הנח שני דג זכר בצד אחד של המחסום ושני דגים נקבה בצד השני אמש רבייה.
- למחרת, להפשיר את התערובת mRNA הכין בעבר על הקרח. החלף את המים במיכלים רבייה במי מערכת מדגה טריים להסיר את המחסומים. מייד לאחר המחסומים נמשכים, לחמם עובש הזרקה ל -28.5 מעלות צלזיוס, להגדיר את הציוד עבור microinjection.
הערה: לקבלת מידע על תבניות להזרקה, עיין גרלך 36. - איסוף ביצים כל 10 - 15 דקות באמצעות מסננת תה ולשטוף את הביצים לתוך צלחת 100 x 15 מ"מ פטרי נקי באות E3 כחול (5 mM NaCl, KCl 0.17 מ"מ, 0.33 מ"מ 2 CaCl, 0.33 מ"מ 4 MgSO, 10 -5% מתילן כחול). E3 הכחול משמש למניעת גידול פטרייתי ולהבטיח התפתחות תקינה של דגי זחל. לקבלת מידע נוסף על הזדווגות ואיסוף עובר, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37.
- השבץ חד-תאים מבוימים עוברת בתוך תבנית הזרקה חממה ולהזריק את הרנ"א בחלמון בסך הרצוי של עוברים (איור 1 א). חשבון למוות עוברי טבעי עוברים מופרים על ידי ביצוע זריקות עובריות ב -15% יותר עובר מדרוש לצורך הניסוי. לפרטים נוספים על microinjection של עוברי דג הזברה, עיין גרלך 36 ו Porazinkski 37.
הערה: לשימוש לראשונה של mRNA, מבצע ניתוח מנה-עקום כדי לקבוע את המינון האופטימלי עבור קרינה ואת הכדאיות (המוגדרת אין פגמים התפתחותיים ברוטו עד 5 DPF) לפני ביצוע הדמית 5D. 150 - 200 ng / μlמוזרק לעוברים הוא לעתים קרובות הריכוז האופטימלי, ולכן הוא נקודת התחלה טובה עבור הריכוז הסופי. - בזהירות לחלץ את העוברים המוזרקים מהתבנית בעזרת פיפטה פסטרה זכוכית 9 "שונה. כדי לשנות את פיפטה, להמס את הסוף באמצעות מבער בונזן עד שנוצר כדור.
- מניחים עוברים מוזרקים בצלחת 100 x 15 מ"מ פטרי ב E3 הכחול ובית C חממת 28.5 °.
- שש שעות לאחר הזרקה, להסיר כל עוברים מתים או מופרים מהצלחות ולהוסיף נקי E3 הכחול. בית העוברים על 28.5 ° C.
3. הכנה והטבעה של עוברי דג הזברה חי הדמיה (איור 1B)
- שתי שעות לפני ההדמיה, להקרין את העוברים המוזרקים עבור GFP באמצעות מיקרוסקופ לנתח ניאון. מניחים עוברים GFP להביע ירוק בהיר בצלחת 100 x חדש 15 מ"מ פטרי עם E3 כחול.
- מרתיחים פתרון המניות של agarose נמוכה להמיס 1% על ידי הוספת 1 גרם של נמוכה להמיס agarose ל -100 מ"ל של E3 כחול. לאחר שימוש agarose, מכסה את הבקבוק עם רדיד אלומיניום. הפתרון המניה נשאר שימושי עד חודש.
- Aliquot 3 מ"ל של אגר מומסת לתוך צינור תרבות 17 x 100 מ"מ. שמור על חם agarose על ידי הנחת צינור תרבות באמבט מים C ° 42 עד מוכן לשימוש. הכן פתרון 15 מ"מ Tricaine במים deionized כדי להרדים את עוברי דג הזברה 36.
הערה: אם ההדמיה קודמת זמן נקודות היא רצויה, הריכוז אגר ניתן ירד נמוך כמו 0.3% 39. - תביאו את 15 מ"מ Tricaine, עוברים הוקרן, נמוכה להמיס agarose, E3 כחול, וצלחת תרבות התחתונה coverslip זכוכית 35 מ"מ עד מיקרוסקופ אור לנתיחה. מוציאים בזהירות את של סיסית העובר עם פינצטה 5 #. האם זה במשך שלושה עוברים.
- מניחים את העוברים dechorionated במיכל נפרד כדי להיות מורדם. המכסה של המנה coverslip התחתונה משמשת לעתים קרובות למטרה זו. בעזרת פיפטה העברה, להוסיף שלוש טיפות (כ 150 μl)של 15 מ"מ Tricaine כדי בצלחת של כחול 5 מ"ל E3 (אם באמצעות המכסה של צלחת coverslip למטה) או עד עוברים כבר הרדים מספיק. בנוסף, להוסיף 3-4 טיפות (כ 150 - 200 μl) של 15 מ"מ פתרון Tricaine אל הצינור agarose מומסת 1%.
- בעזרת פיפטה p200 עם 1 ס"מ של קצה פיפטה מנותקים; להעביר את העוברים בהרדמה כדי בצלחת coverslip בעל תחתית. הסר את כל עודפי E3 כחול: פתרון Tricaine.
- לאט לאט מוסיף 5 - 10 μl של agarose הנמוכה להמס: פתרון Tricaine על עובר, שמירה על כל טיפה נפרדת כדי להבטיח את העוברים לא להיסחף בטעות קרובה אחד לשני.
אזהרה: אם agarose חם מדי, זה יגרום נזק לעובר. טמפרטורה טובה כדי לשמור על אגרה היא C ° 42. - באמצעות מחט 21 G ½ 1, בעדינות לכוון את העובר ב agarose למיקום הרצוי. בעת שימוש במיקרוסקופ הפוכה הדמיה זמן לשגות, כוון את האזור של עניין (ROI) קרוב coverslip כמו possible.
הערה: כללית, באזור הזנב מציע וקלות ההתמצאות בהירות עקב (איור 1 א) יחסית רזה רקמות. רקמות אחרות, כגון שכבת האפיתל סביב קפלי חלמון סנפיר, ניתן להשתמש 28,29. רקמות אלה מציעות בבהירות רבה, אולם האזורים אלה הם רק כמה שכבות תאים עבים. לצורך בפרוטוקול זה, זה מועיל לתמונה באזור הזנב לרכוש חלוקות תא רבות ככל האפשר. - המתן כמה דקות עבור מיצוק חלקי של אגר. השתמש מחט להתפרק פיסה קטנה של אגר כדי לבדוק מיצוק שלה. כאשר פיסה אגר ניתן התרחקה הטיפה, המשך לשלב הבא.
- מכסה את coverslip כולו עם אגר נמוך להמס ויוצרים כיפה על העוברים המוטבעים. אפשר אגר לגבש לפני הזזת צלחת הדמיה confocal (איור 1 א).
- במהלך תהליך ההתמצקות אגר (לוקח כ -10 דקות), להכין 3 מיליליטר of E3 כחול פתרון עם חמש טיפות של (כ 250 μl) 15 מ"מ Tricaine להציב על העוברים מוטבע במהלך ההדמיה.
4. הדמיה Confocal 5D של 40,41 עוברים דג הזברה חי
הערה: ראה Ariga 40 ו אובריאן 41 לפרטים על כיצד לבצע הדמית 5D באמצעות מערכות confocal אחרות. עבור Z-מרווח, Z- מחסנית, Z-עומק, מרווח הזמן, והגדרות 5D ראה תרשים 1C.
- פתח את תוכנת ההדמיה ולהגדיר מיקרוסקופ כדי 1.4 עדשה אובייקטיבית 60X NA. החל שמן טבילה אל העדשה האובייקטיבית ומניח בצלחת התרבות מחזיקה שקופיות על במת מיקרוסקופ. באמצעות בקר הציר, למרכז את עובר עניין מעל העדשה האובייקטיבית ולהביא את העדשה האובייקטיבית כלפי מעלה כדי לפגוש את מנת התרבות.
- הקש על סמל עין החתיכה ולעבור מסנן GFP על המיקרוסקופ. דגש על ROI. התמקדות הרקמה הקרובה ביותר coverslip יהיה offer תוצאות ההדמיה הטובות ביותר.
- הסר את המשתלבים. בחר את ערוצי GFP ו mCherry (אורכי גל שנקבע מראש בתוכנה) ולהגדיר את הקו הממוצע אפשרות לקדמותו.
- השתמש "צפה / בקרת רכישה / A1 שטח סריקה" פקודה כדי לפתוח את כלי שטח סריקת A1.
- להתחיל בסריקה. באמצעות בקר הציר, עמדה עובר כך את אזור הסריקה מתמלא כמה שיותר דג הזברה ככל האפשר. כוח לייזר לא צריך להיות אופטימלי בשלב זה. מנמיכים את כוח לייזר כדי למנוע photobleaching מיותר.
- השתמש "בקרות צפו / רכישה / רכישת ND" פקודה כדי לפתוח את לוח בקרת רכישת ND.
- בגין סריקה כדי להגדיר את הפרמטרים מחסנית Z. קבע את הגבול העליון Z- מחסנית למקום שבו התאים הם לא בפוקוס גבול תחתון למקום שבו תאים אינם גלויים. לאפשר מרחב 3 מיקרומטר מעל המדגם לצמיחת תנועת תא, אשר עשוי להתרחב לתחום ההדמיה. The Z-ערימה עבור הדמויות המוצגים פרו זהtocol מכוסה בעומק-Z של 40 מיקרומטר הזנב העובר.
- הגדר את גודל הצעד Z-מרווח 2 מיקרומטר. בממוצע, תא הוא 10 מיקרומטר קוטר; ולכן 2 מיקרומטר יפיקו חמישה במרווחים של נתוני הדמיה להיות מנותחים עבור כל תא.
הערה: עומק התמונה שניתן לרכוש תלויה מרווח Z. רזולוצית Z הוא הקריב כדי להשיג עומק הכולל בממד Z כדי תמונה כמו תאים רבים עוברים מיטוזה כמו (Z- עומק גדול) אפשרי. המצב ההפוך הוא נכון, באותה, על ידי הפחתת גודל הצעד, ברזולוציה Z הוא זכה, תוך עומק Z הוא הקריב (Z- עומק קטן). - התאם את כוח לייזר תמונה, HV, וקיזזו רמות. עבור הניסויים הפגינו פרוטוקול זה, להשתמש בכוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות להגדיר ברמות המקבילות, בהתאמה, עבור ערוץ ה- GFP; 2 - 5, 120 - 140, ו -9 ל -11. עבור ערוץ mCherry, השתמש כוח הליזר הבא, HV, וקזז רמות, בהתאמה; 3 - 6, 120 - 140, ו -3 כדי-8. לאחר הפרמטרים נקבעים, לכבות את הסריקה כדי למנוע חשיפת ליזר מיותרת שעלולות לגרום phototoxicity ואת photobleaching של המדגם.
- בחר את סמל מיצוע קו 2x. "אין מיצוע" מייצר תמונה מגורענת בזמן "קו 4x הממוצע" מאריך את זמן הסריקה באופן דרסטי. השימוש מיצוע קו 2x מספק את איכות התמונה הגבוהה ביותר וזמן הסריקה המהירה.
- בחר את משך המתאים מרווח זמן הזמן הדרוש לצורך הניסוי. עבור חטיבות wild-type, מרווחי זמן של שתי דקות במשך שעה 2. עדיף לקביעת משך mitotic (ששימשו איורים 1, 2, 3 א, ו 3B). חטיבות המפעילות את מחסום הרכבת ציר עבור יותר מ -30 דקות מתאימות יותר של חמש דקות במשך ארבע שעות על מנת לשמר קרינה כפי שמודגם באיור 3C.
- סמן את תיבת "ולשמור את הקובץ" ואת שם הקובץ כדי לשמור את הקובץ באופן אוטומטי כפי שהוא נרכש. בדוק היטב את כל parameters הוגדר כהלכה ופגע "התחל הפעלה".
- לאחר הרכישה תושלם, כדי לראות את הקובץ בפורמט תלת ממדים, לחץ על סמל סף נפח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מדגים את היכולת להתבונן חלוקות תא רבות באמצעות תצוגת שדה רחב של זנב דג הזברה wild-type AB. במשך שבע התאים mitotic הם צילמו בתוך מסגרת זמן 14 דק '(סרט 1). בתוך מנות זמן שני hr, למעלה מ -40 אירועים mitotic נתפסו. בממוצע, 50 תאים מתחלקים נצפו AB ו -30 תאים המתחלקים בעוברי Aur B מ / מ '(איור 2 ב). כדי להסביר את מספר התאים צילמו, היחס של תאים mitotic למספר התאים צילמו חושבה (איור 2 ג). נתונים אלה מראים כי אין מספר נמוך של תאים עוברים מיטוזה ב עובר Aur B מ / מ '(איור 2 ב) אך פחות המספרים של תאים להיות צלם. היכולת לרכוש מספר משמעותי סטטיסטי של אירועים כגון זה תסייע כוח סטטיסטי.
-together.within-page = "1"> איור 3 מרחיב בטכניקה זו כדי לכלול לכימות משך mitotic. לאחר פגישת הזמן לשגות נרכש, תא יחיד יכול להיות מנותח עבור הזמן המושקע מיטוזה עם רזולוציה נאותה על ידי שימוש באפשרות זום (איור 3 א ', ב'). משך mitotic מחושב באופן ידני על ידי לספור כמה מרווחי הזמן תופסים חלוקת תא אחד. מספר מרווחי זמן מוכפל מרווח הזמן בין כל מחסנית Z. לדוגמה, באיור 3C, חלוקת נטל 12 מרווחי הזמן ואת מרווח הזמן בין כל מחסנית Z היה 2 דק '. לכן, בפעם חטיבת עבור תא זה היה 24 דקות. שעת חלוקת wild-type ממוצע AB היא 25 דקות ו -58 דקות עבור מ '/ מ' aurB (איור 3 ב). זמן חלוק ממושך כפי שניתן לראות מ 'aurB / m עולה שמחסום הרכבת ציר לא היה מרוצה עקב ומקןה שגויהמצורף tochore 1,2. אם ניקח מבט מקרוב על הגדלה עוברים wild-type, בכל שלב mitotic ניתן להבחין (איור 3 ג, סרט 2). בנוסף, ליקויי mitotic ניתן לצפות בעובר m / m aurB הכולל מעצר mitotic ונכשל cytokinesis וכתוצאה מכך תא binucleated ההיווצרות הבאה של גרעינון (3D איור, סרט 3). זה הגדלה ניתוח מראה פגמי mitotic תומך זמן הענף גדל רכש באיור 3 ב.
שונה אחרים פגמי mitotic המגוונת גורלות תא שעשוי להיות נתקלו נחקרים איור 4; הפגינו את העוברים esco2 + / m esco2 m / m. בעובר esco2 + / מ ', תנועות כרומוזום שגויות נלכדים יכולה להיות מוגדרת כ פגם congressionים. פגמי Congression להתרחש כאשר קבצי microtubule פסולים מבוצעים. פגמים אלה יגרמו לכישלון של הכרומוזומים אל נודד לעבר צלחת metaphase. כרומטידה אחות מותאמים, במיוחד לזיהוי ב 20 דקות ו -46, שלא congressed כלפי צלחת metaphase ניתן נצפתה לראשונה דק '14. התפרצות anaphase המפריד בין כרומטידה אחות מיושר על הצלחת metaphase וכן כרומטידה אחות לזווג ימינה, נצפים דקים 50. בנוסף, היווצרות הגרעינון אפשרית הוא ציין גם כרומטידה האחות המופרדת אלה נותרו מבודדת מחוץ לגרעין (T = 50, איור 4 א, סרט 4). באיור 4B, חטיבה רבה-קוטבית היא דמיינה (סרט 5). חטיבות רבות-קוטביות לעתים קרובות להתרחש עקב הגברת centrosome, אך עלולה להתרחש הדרך אחרת פירושה 42. באיור 4C, תא esco2 m / m בתחילה מדגים בהסרת כרומטידה אחות מוקדמתסיבוב יון ציר 9,43,44. גורל תא נוסף מראה בלוח זה מהווה גשר anaphase שבו מצורף merotelic הם 45,46 פתורים. גשר anaphase ניתן לראות ראשון בדקה 62. הכרומטין נראה בטרם עת decondense תוך התא עובר cytokinesis. כפי cytokinesis מתרחשת, הקמט מחשוף פוגעת הכרומוזומים decondensed, וכפי כריתה מתרחשת, מושך את החומר הכרומטין להקים גשר anaphase (איור 4C, סרט 6). אמנם לא מוצג כאן, על מנת לכמת את גורלם הסלולר, להקליט את כל חטיבות mitotic בכל מסגרת וסוג גורל התא הם מפגינים. מחלקים את מספר התאים בכל גורל במספר הכולל של חטיבות רשמה ולהתרבות על ידי 100 כדי לחשב את אחוז גורל התא.
איור 1: מתאר שרטוטי פרוטוקול. (א) (ב) ציור סכמטי של תהליך הטבעה העובר. עוברים המוזרק יש dechorionated וחומרי הרדמה. עובר מועברים לאחר מכן כדי בצלחת coverslip התחתונה ועודף כחול E3 מוסר. אגר נמוך להמס משמש ליצירת כיפות נפרדות כיסוי כל עובר. אוריינט עובר כך הזנב הוא קרוב ביותר coverslip. מתן שתי דקות לפני ההוספה אגרה כיסוי coverslip כולו. המתן עד אגר הוא התגבש לפני המעבר ל תמונה. (C) ציור סכמטי כדי להגדיר את המונחים Z-מרווח, Z- מחסנית, מעמיק Z, מרווח הזמן, משך זמן 5D המשמשים פרוטוקול ודיון. Z-מרווח מוגדר כמרחק בין כל תמונה כמו מיקרוסקופ נע עמוק לתוך המדגם כדי ליצור מחסנית Z. Z- מחסנית היא כל התמונות שצולמו באמצעותמדגם ב Z-המרווח המוגדר. המרחק נסע בערימה-Z מגדיר את Z- עומק. מרווח הזמן הוא משך הזמן בין מחסנית Z אחד ואת Z-המחסנית הבאה כדי ליצור תמונת הזמן לשגות. משך הזמן הוא הסכום הכולל של זמן המשמש תמונה. 5D מוגדרת ממדי X, Y, Z, זמן, ואת פליטת ניאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
זמן לשגות הדמיה איור 2. לוכדת אירועים mitotic מרובים בעובר דג הזברה לחיות. (א) סטילס זמן לשגות מניסוי תקריב הדברים לידי ביטוי דג הזברה AB wild-type, 24 hpf מוקרנים אירועי mitotic מרובים. כוכביות מצביעות לכיוון שבעה תאי מיטוזה. t = הזמן שחלף בדקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (ב) מספר ce mitoticLLS שנצפתה AB ו aurB m / m זנבות דג הזברה ב 24 hpf. ממוצע ± st. dev., n = 3 עובר / גנוטיפ. (C) היחס בין תאי mitotic לכל מספר כולל של תאי AB ו aurB M / M זנבות דג זברה ב 24 hpf. ממוצע ± st. dev., n = 3 עובר / גנוטיפ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תא יחיד איור 3. ניתוח לוכד כל שלב mitotic ומשך mitotic. (א) תא הנבחר מתצוגת השדה הרחבה של wild-type AB, 24 hpf העובר דג זברה שמוצג איור 2 א. (ב) זמן החטיבה הוא ציין עבור AB ו aurB m / m תאים ומחושב יוכל להסיק BRE מעטפת הגרעיןakdown (חוד) על התצפית הראשונה של הכרומטין המרוכז בתא להיווצרות של שני תאים הבת חדשים. n = 3 עוברים / גנוטיפ, n = 66 אוגדות עבור AB, n = 29 אוגדות עבור מ 'מ' / aurB, *** p-value <0.001. (C) AB תא wild-type חתוך לדמיין את התקדמות השלב דרך מיטוזה . t = min. בר סולם = 5 מיקרומטר. (ד) aurB m / m תא חתוך לדמיין התקדמות mitotic באמצעות מיטוזה הכוללת מעצר mitotic לכשל cytokinesis והיווצרות גרעינונים. חצים להצביע לכיוון גרעינונים. t = הזמן שחלף בדקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4.הדמיה של תא חי בודד לוכדת פגמים mitotic מרובים משויכים כרומוזום הפרדה אגף mitotic Mutant דג הזברה. (א) קצוץ תמונה של תא עובר פגמי congression בעובר esco2 + / m. החץ הדק מפקח על כרומוזום שמאל כי משוך לאחור לתוך צלחת metaphase. החץ העבה מפקח על כרומוזום הזכות שאינו נסוג לתוך צלחת metaphase ולהסיק לגבש הגרעינון. על החץ הכפול מציג את ההפרדה של כרומוזום התקין כי לא קונגרס בתחילתה anaphase. ריבועי להראות תקריב בתצוגות של הכרומוזומים שנכשלו לקונגרס. ריבועים היו קצוצים ובהירות משופרת להדמיה טובה יותר. קרינת CAAX הוסרה כדי להמחיש את הכרומוזומים ביתר קלות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (ב) קצוץ תמונה של תא עובר מעצר mitotic שתוצאתו חלוקה רבה קוטבית בתוך esco2 + / העובר מ. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (ג) תמונה חתוכה של עייפות לכידות עוברים תא וכתוצאה מכך היווצרות גשר anaphase בעיני דמוית החוט מושך בין שני הגרעינים שציינו סוגריים. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. t = הזמן שחלף בדקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1. חלוקות תא מרובות ניתן דמיינו נוף רחב של העובר דג הזברה wild-type מוזרק (קליק ימני להוריד).
סרט 2. שלבי מיטוזה ניתן דמיינו בקלות עובר דג זברת wild-type (r ight לוחץ כדי להוריד). פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין לבין התמורה כלפי congression של כרומטידה האחות כדי ליצור צלחת metaphase . הפרדה מדויקת מתרחשת מניב שני לתאי בת חדשים.
הדמית Live Movie 3. עובר m / m aurB מגלה מיס כרומוזוםegregation, נכשל cytokinesis, והיווצרות גרעינונים (קליק ימני להוריד). היא להסיק פירוט מעטפת גרעין מהופעתו הסדירה של הגרעין, הכרומוזומים להתפזר קטבים מנוגדים מסוגלים ליצור צלחת metaphase נאותה, והמשך לסובב על ציר הארכת החלוקה זמן של התא. Cytokinesis אינה מתרחשת כתוצאה בתא 4N ו גרעינונים מרובים.
סרט 4. פגמי Congression הם שנצפו עובר esco2 + / מ '(קליק ימני להוריד). פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין. לאחר הצלחת metaphase נוצר, כמה אינדיהכרומוזומים vidual לפזר משני צדדיו. אחת כרומוזום הפרט בצד שמאל בסופו של דבר משוך לאחור לתוך הצלחת metaphase ואילו כרומוזום ימינה נשאר מחוץ הצלחת metaphase ניתן לראות הפרדה כרומטידה אחות בתחילת anaphase. התא מפגין זמן חלוק ממושך אך מחלק אולטימטיבי עם היווצרות הגרעינון פוטנציאלית.
סרט 5. חלוקה רבה-קוטבית הוא ציין בעובר esco2 + / מ '(קליק ימני להוריד). פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין ולאחר מכן הכרומוזומים למזג לגבש Y-צורת indicativדואר של קטבי 3-ציר. התא מפגין זמן חלוק ממושך אך בסופו של דבר מתחלק 3 לתאים בת.
סרט 6. מוקדמת אחות הפרדת כרומטידה והיווצרות גשר anaphase הם נצפו בעובר מ esco2 m / (קליק ימני להוריד). פירוט מעטפת גרעין הוא להסיק מהופעתו הסדירה של הגרעין ולאחר מכן הכרומוזומים לפזר ברחבי התא מסוגל לגבש צלחת metaphase נכונה. הכרומטין decondenses לפני cytokinesis וככל שתא מתחלק, יוצר גשר anaphase בין שני התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש בשיטה זו מאפשר להסיק פירוט מעטפת הגרעין, היווצרות של צלחת metaphase ידי קבצים מצורפים microtubule-קינטוכור, והפרדה של כרומטידה אחות ליצירת שני תאים חדשים vivo ובאופן שהזמן גרמן. היכולת להתבונן מיטוזה דג הזברה יש יתרון על פני דגימות קבועות ומערכות תרבית תאים כי התאים להיות הדמיה בפיסיולוגיה הטבעית, הרקמה שקופה המאפשר לשמש חלבוני ניאון, הם מפתחים יחסית מהר, הזמן לשגות הדמיה ניתן לרכוש. שימוש דג הזברה מבוגרת עבור פרוטוקול זה מוגבל בשל העומק-Z המוגבל שניתן לרכוש בשל הרקמה העבה שאינה העור או עיניים. בעוד בעלי חיים מהונדסים המבטא H2A.F / Z-EGFP ו mCherry-CAAX יכולים לשמש לאותה מטרה, צדדית וקל זריקות mRNA לתוך דג זברת מוטציה שונה יש יתרון על פני צלבים גנטיים. במצבים בהם ניתוח mitotic הואנדרש לאחר הפרית שלוש ימים (DPF) או עוברי מאוחר יותר, חיות טרנסגניות תהיינה נחוצות בשל זמן מחצית החיים של RNA באורגניזם זה המתפתח במהירות.
חלבוני ניאון אחרים המאפשר הדמיה מיטוזה ניתנים בפרוטוקול זה. לדוגמה, H2B-GFP mRNA מהווה חלופה H2A.F / Z-EGFP עבור הכרומטין, ומספק תיוג דומה. חלבוני ניאון מתויג אחרים שניתן להשתמש בטכניקה זו כוללים POM121, centrin, Eb1, Hec1, ו EMTB אשר יאפשר הדמיה ב-העובר חי של המעטפה, צנטריול גרעיני, בתוספת-סוף microtubules, קינטוכור, ו microtubules, בהתאמה 32,47-51.
פרוטוקול זה יש צעדי הדמיה מרכזיים כי חייב להיות מוצאים להורג על מנת להשיג תוצאות איכותיות: 1) הקפד למטב את איכות mRNA וריכוז להניב את הקרינה המבריקה לא רעיל ככל האפשר. הקרינה יותר תוביל לחשיפת ליזר פחות ולכן, פחות photobleaצ'ינג phototoxicity. 2) העובר חייב להיות בהרדמה מלאה ובטוחה של אגר. תנועות קלות תגרומנה לשנות את התוצאות ועלולות להרוס את הניסוי. 3) הריכוז אגר חייב להיות מתאים לשלב של עובר רצוי להיות צלם. בגיל 24 hpf ובהמשך, 1% agarose נמוכה להמיס מתאימה. אם הדמיה 12 hpf או קודם לכן, פתרון agarose 0.3% אמור לשמש 39. 4) את ההחזר על ההשקעה בעובר צריך להיות קרוב ככל כדי coverslip ככל האפשר. שלב זה אינו מגביל אחד הדמיה הזנב. העיניים, העור, באזור הגב, חלמון, וקפל סנפיר הם דוגמאות לתחומים אחרים שיכולים להשתמש בפרוטוקול זה.
הזמן הוא הגורם המגדיר שמפריד בפרוטוקול זה מעוברים קבוע הדמיה או רקמות. בעת הגדרת מחסנית Z, Z-מרווח, זמן לשגות מרווח, ומשך זמן לשגות, חשוב לזכור בהקשר של הניסוי (איור 1 ג). חלוקת התא wild-type נמשך בדרך כלל כ 25 דקות ב 24 hpf. בשנת הלמשל הוא, 2 מיקרומטר Z-מרווח המכסים 40 מיקרומטר של רקמות בתוך מחסנית Z, עם מרווח זמן של שתי דקות לשני hr הוכח כיעיל. יתר על כן, בעוברים עם מיטוזה פגום, תאי מעצר mitotic יהיו ככל הנראה כיום, באופן דרסטי הגדלת פעמי חלוקת תא. כדי לרכוש חטיבות מלאות מרובות, משך הזמן צריך להיות מוגבר, כלומר, בין 2 hr עד 4 שעות. זמן הרכישה כבר יחשוף המדגם לשלטון לייזר יותר ולהגדיל את הסיכון של photobleaching ו phototoxicity. במקרה זה, את מרווח הזמן בין כל מחסנית Z צריך להיות מוגבר. תנועות כרומוזום דינמיות תוקרבנה על ידי הגדלת מרווח הזמן בין ערימות-Z, אבל משך הזמן הוא זכה. זה הכרחי כאשר הדמית חלוקות תא שעלול להימשך יותר משני hr.
למרות שזה לא נדון ישירות, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם על מנת לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה יותר במישור-Z בצורה מדויקת יותר לדמיין מו כרומוזום פרטvements. לדוגמה, באיור 4A שני כרומוזומים missegregated הם נצפו. הכרומוזום ימינה (שצוין על ידי החץ העבה) הוא בתחילה בהיר בפוקוס אבל מעמעם במסגרות האחרונות. עם מרווח Z 2 מיקרומטר, כרומוזום uncongressed נופל בין מרווח-Z. לכידת תנועות דקות ואירועי כרומוזום יחידים יכולים להיות מושלמות על ידי הגדלת רזולוציית במישור Z. כדי לעשות זאת, להתמקד על תא יחיד שימוש באפשרות שטח סריקת A1. בעת הגדרת הפרמטרים Z- מחסנית, השתמש מרחק Z-מרווח קטן יותר. מגוון מומלץ הוא 0.5 - 1 מיקרומטר. בנוסף, ומקטין את מרווח הזמן בין כל ערימת Z ייצור מעברים חלקים בין כל מסגרת זמן, כלומר, משתי דקות ל -30 שניות - 1 דקות. אזהרה אחת לסוג של הדמיה זו היא העומק-Z המוגבל שניתן להשיג. בשל מרווח Z-מרווח הזמן הקטן, יותר רקמות תיחשפנה הלייזרים בתוך מסגרת זמן קטנה יותר. כדי להתגבר על זה, SMמשך זמן aller יכול לשמש; אולם זה תלוי גם כמה זמן החוקר רוצה ללכוד חטיבות.
אנלוגיה שעשויה לעזור עם שינויים אלה היא לחשוב על ערימה-Z כמו אקורדיון. המרחק בין כל קיפול של המפוח הוא המרווח-Z ואת עומק Z מיוצג על ידי אורכו של האקורדיון. בשנת מקרה שבו אחד לא היה רוצה תצבור חשיפה לייזר יותר במדגם, כפי מותח אקורדיון (מגדיל מעמיק Z), המרחק בין הקפלים של המפוח (Z-אינטרוולים) חייב להגדיל גם כן. המצב ההפוך הוא נכון שככל חוזי האקורדיון, העומק-Z פוחת. את הקפלים של חוזה המפוח וכן, מתאים ירידת מרווח Z. אנלוגיה זו ניתן להחיל על דגימות קבועות חיות. המורכבות היא הגדילה בפרוטוקול זה כאשר הזמן להוסיף למשוואה. יש כמות מוגבלת של זמן כי האקורדיוניסט יכול להאריך או לכווץ את האקורדיון. represen זהts את מרווח הזמן. על מנת לכסות יותר מרחק (Z-עומק) את מרווח הזמן חייב לעלות. כמו כן, על מנת לשמוע מוסיקה יותר, צריך להאזין במשך זמן ארוך יותר (משך זמן) במונחים של פרוטוקול זה, כדי להיות עדים יותר חלוקות תא, משך הזמן חייב לעלות. גורם הרכבה לזכור היא שהמוזיקה יותר כי הוא שיחק, ויותר עייף האקורדיוניסט. זה מקביל למימד, הקרינה הסופית. החשיפה לייזר יותר המדגם הוא נתון, יותר photobleaching ו phototoxicity (עייפות) הופכת לנושא.
לסיכום, פרוטוקול זה מפרט שיטה לדמיין מיטוזה בעובר דג הזברה לחיות החלים על ניתוחים שונים; 1) חלוקה מספר 2) חלוקה זמן 3) גורל חטיבה ו -4) דינמיקה הכרומטין ברזולוציה גבוהה. אפשרויות מרובות המאפשרים הדמית רכיבי mitotic החל מצורף microtubule-קינטוכור כדי צנטריול ניתן ליישם דינמיקה. שילוב היכולת שלמיטוזה הדמית in vivo עם התקדמות עריכת הגנום דג הזברה תעשה את זה קל ליצור מוטציות בהיבטים שונים של מיטוזה מודל מחלות אנושיות בתוך האורגניזם חוליות 25,26,52-56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N.
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A.
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J.
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
