Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Observerer Mitotisk divisjon og Dynamics i en Live Sebrafisk Embryo

Published: July 15, 2016 doi: 10.3791/54218
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

Mitose er avgjørende for organismevekst og differensiering. Prosessen er svært dynamisk og krever beordret hendelser for å oppnå riktig kromatin kondens, microtubule-kinetochore vedlegg, kromosom segregering, og cytokinese i en liten tidsramme. Feil i den delikate prosessen kan føre til sykdom hos mennesker, inkludert fødselsskader og kreft. Tradisjonelle tilnærminger som undersøker humane mitotisk sykdomstilstander er ofte avhengige av cellekultursystemer, som mangler den naturlige fysiologi og utviklings / vev-spesifikk sammenheng fordelaktig når man vil studere human sykdom. Denne protokollen overvinner mange hindringer ved å tilveiebringe en måte å visualisere, med høy oppløsning, kromosom dynamikk i et virveldyr system, sebrafisk. Denne protokollen vil detalj en tilnærming som kan brukes for å oppnå dynamiske bilder av dele celler, som inkluderer: in vitro transkripsjon, sebrafisk avl / oppsamling, embryo embedding, og time-lapse imaging. Optimalisering og modifications av denne protokollen er også utforsket. Bruke H2A.F / Z-EGFP (etiketter kromatin) og mCherry-CAAX (etiketter cellemembranen) mRNA-injiserte embryoer, mitose i AB villtype, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant sebrafisk er visualisert. Høy oppløsning levende avbildning i sebrafisk gjør det interessant å observere flere mitoser til statistisk tallfeste mitotiske feil og timing av mitotisk progresjon. I tillegg er observasjon av kvalitative aspekter som definerer feil mitotiske prosesser (dvs. congression defekter, missegregation av kromosomer, etc.) og utilbørlig kromosom utfall (dvs. Aneuploidy, polyploidi, mikrokjerner, etc.) observert. Denne analysen kan brukes til observasjon av vev differensiering / utvikling, og er mottagelig for anvendelse av mutant sebrafisk og farmakologiske midler. Visualisering av hvordan defekter i mitose føre til kreft og utviklingsforstyrrelser vil sterktøke forståelsen av patogenesen av sykdommen.

Introduction

Mitose er en viktig cellulær prosess essensielt for vekst, differensiering og regenerering i en levende organisme. Ved nøyaktig fremstilling og replikasjon av DNA i inter, blir celle primet å dele seg. Den første fasen av mitose, profase, blir initiert ved aktivering av cyclin B / Cdk1. Prophase er kjennetegnet ved kondensering av kromatin materiale inn i kromosomer. Nuclear konvolutt sammenbrudd finner sted ved overgangen mellom prophase og prometafase. I prometafase, centrosomes, det kjerne senter for spindel formasjon, begynner å migrere til motsatte poler mens utvide mikrotubuli på jakt etter kinetochore vedlegg. Ved vedlegg, til konverteringer slutt på microtubule vedlegg og strekkrefter orientere kromosomer danner en metafase plate 1. Dersom alle kromosomene er riktig tilkoblet, er spindelenheten sjekkpunkt fornøyd, cohesin ringer holder søsterkromatider sammen spaltes, og mikrotubuli forkorte å trekke søsterkromatider til motsatte poler løpet anaphase 2,3. Den siste fasen, telophase innebærer forlengelse av cellen og reformasjon av den kjernefysiske konvolutten rundt de to nye kjerner. Cytokinese fulldelingsprosessen ved å skille cytoplasmaet av de to nye datterceller 4-6. Endring av viktige mitotiske baner (dvs. spindelenheten sjekkpunkt, sentrosomen duplisering, søsterkromatidutveksling samhold, osv.) Kan resultere i meta arrest, missegregation av kromosomer, og genomisk ustabilitet 7-10. I siste instans kan defekter i trasé kontrollere mitose forårsake utviklingsforstyrrelser og kreft, som nødvendig visualisering av mitose og dets defekter i en live, virveldyr, multi-cellular organisme 10-16.

Sebrafisk embryo tjene som en stor modellorganisme for live bildebehandling på grunn av gjennomsiktig vev, enkel mikroinjeksjon, og rask utvikling. Ved hjelp av sebrafisk, den overordnede målet med dette manuskriptet er åbeskriver en fremgangsmåte for direkte 5D (dimensjoner X, Y, Z, tid, og bølgelengde) avbildning av mitose 17 (figur 1C). Bruken av mutant sebrafisk defekt i ulike mitotiske trasé viser konsekvensen av slike feil. For denne protokollen, ble Aurora B Esco2 mutanter valgt å illustrere disse feilene. Aurora B er en kinase som er en del av kromosomet passasjer kompleks (CPC) som er involvert i spindeldannelse og mikrotubuli-vedlegg. Det er også nødvendig for spalting fure formasjonen i cytokinese 18,19. I sebrafisk, fører Aurora B-mangel av feil i fure induksjon, cytokinese, og kromosom segregering 20. Esco2, på den annen side, er en acetyltransferase som er avgjørende for søsterkromatidutveksling samhold 21,22. Det acetylates cohesin på SMC3 delen av ringen dermed stabiliserende cohesin å sikre riktig kromosom segregering ved metafase-anaphase overgang 23. Tap av Esco2 i sebrafisk fører til chromosome missegregation, for tidlig søsterkromatidutveksling separasjon, genomisk ustabilitet, og p53-avhengig og uavhengig apoptose 24,25. På grunn av tilgjengeligheten, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant sebrafisk (heretter referert til som aurB m / m og esco2 m / m, henholdsvis) vil bli brukt for å illustrere denne teknikken 25-27.

Kobling konfokalmikroskopi med fluorescerende-merket celle maskiner har aktivert forskere å visualisere kromatin og cellemembranen dynamikk under mitose 25,28,29. Fluorescerende-merket histoner har historisk blitt brukt til å visualisere kromatin. Histoner er kjerneproteiner sammensatt av fire forskjellige par (H2A, H2B, H3 og H4) som er ansvarlig for nucleosome struktur som komponerer kromosomer 30. Mens H2B er uten tvil den mest brukte histone for fluorescerende proteiner imus og cellekultur, bruk av Histone 2A, Familie Z (H2A.F / Z) har vist seg godt for bruk i sebrafisk 31,32. Concanavalin A og kasein kinase 1-gamma for eksempel, lokalisere til cellemembranen, og er tidligere vist seg effektive i å visualisere cellemembranen i kråkeboller og Drosophila 33,34. Andre studier har vist at CAAX fluorescerende-merket protein etiketter cellemembranen og var vellykket i sebrafisk 31. CAAX er et motiv som er anerkjent av posttranslasjonelle modifiserende enzymer som farnesyltransferases og geranylgeranyltransferases. Modifiseringer av disse enzymene forårsake proteinene blir membran-assosiert, således merking cellemembranen 35.

På grunn av den forutgående bruk i sebrafisk, valgte denne protokollen som skal brukes H2A.F / Z og CAAX å merke kromatin og cellemembranen. Anvendelse av denne fremgangsmåten vil tillate forskeren til å overvåke mitose på individuelt cellenivå for å observere individuelle kromosomdynamikk, samt samtidig overvåke flere celledelinger som kan påvirke vevet differensiering og utvikling. Denne artikkelen vil fokusere på å avbilde dynamikken i kromosom segregering under mitose på individnivå cellenivå. Innenfor dette manuskriptet, vil evnen til å observere flere mitotiske divisjoner, beregne divisjon tid, og tyde mitotiske fenotyper illustreres og drøftes. Ved hjelp av disse parametrene, fysiologisk relevante data kan samles og brukes til en rekke sykdomstilstander som påvirkes av mitotiske defekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. In vitro transkripsjon

  1. Linearize pCS2-H2A.F / Z-EGFP og / eller pCS2-mCherry-CAAX vektorer av NotI restriksjonsenzym fordøye 31. Ved hjelp av en RNA in vitro transkripsjon kit, generere 5 'avkortet mRNA produkter fra hver mal, i henhold til produsentens protokoll.
  2. Rense avkortet mRNA ved hjelp av en rensesett. Følg produsentens anvisninger. Eluere med RNase-fritt H 2 O.
  3. Bestemme konsentrasjonen av RNA ved absorbans ved 260 nm ved anvendelse av et spektrofotometer. (OD 260 x fortynning x 40 ug / ml).
  4. Fortynn RNA til 100 ng / mL for hver H2A.F / Z-EGFP og mCherry-CAAX med RNase-fritt H 2 O. Hvis RNA-konsentrasjonen er for lav, vil fluorescensen være svekket eller fraværende. Lysere prøvene vil minske bekymringer over fototoksisitet og fotobleking. På den annen side kan for mye RNA være giftige og / eller forårsake av mål-effekter.
    Merk: Oppbevar den gjenværenderensede mRNA i -80 ° C fryser.

2. Sebrafisk Avl, Embryo Collection, og mRNA Injection 36-38

  1. Montere oppdrettstanker med en barriere for å separere tanken i to regioner, og fylle hver avl tank med akvakultursystemvannet som brukes i anlegget sebrafisk.
  2. For å hindre for tidlig avl, plassere to hannfisk på den ene siden av barrieren og to hunnfisk på den andre siden kvelden før avl.
  3. Den neste dag, tine den tidligere fremstilte mRNA-blandingen på is. Skift vannet i avl tanker med fersk oppdrettssystem vann og fjerne barrierer. Umiddelbart etter barrierene er trukket, varme en injeksjon mold til 28,5 ° C og sette opp utstyret for mikroinjeksjon.
    Merk: For informasjon om sprøytestøpeformer, se Gerlach 36.
  4. Samle egg hver 10 - 15 min ved hjelp av en te sil og skyll eggene i en ren 100 x 15 mm petriskål med E3 Blå (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 -5% metylen blå). E3 Blå brukes til å hindre soppvekst og sikre riktig utvikling av larve fisk. For mer informasjon om paring og embryo samling, se Gerlach 36 og Porazinkski 37.
  5. Legge en celle iscenesatt embryo i en oppvarmet injeksjon mold og injisere RNA inn i eggeplomme i den ønskede mengden av embryoer (Figur 1a). Konto for naturlig embryonale død og ubefruktede embryoer ved å utføre embryonale injeksjoner på 15% flere embryoer enn nødvendig for forsøket. For ytterligere informasjon om mikroinjeksjon av sebrafisk embryoer, se Gerlach 36 og Porazinkski 37.
    MERK: For første gangs bruk av mRNA, utføre en dose-kurve analyse for å fastslå den optimale dosen for fluorescens og levedyktighet (definert som ingen brutto utviklingsmessige defekter opp til 5 dpf) før du utfører 5D bildebehandling. 150-200 ng / mLinjiseres i embryoer er ofte den optimale konsentrasjonen, og derfor er det et godt utgangspunkt for sluttkonsentrasjonen.
  6. Nøye trekke ut de injiserte embryoer fra formen ved hjelp av en modifisert 9 "glass Pasteur pipette. For å endre pipette, smelte enden ved hjelp av en gassbrenner til den danner en ball.
  7. Plasser injisert embryo i en 100 x 15 mm petriskål i E3 Blå og hus i en 28,5 ° C inkubator.
  8. Seks timer etter injeksjon, fjerne eventuelle døde eller ubefruktede embryoer fra platene og legge ren E3 blå. Hus embryoene på 28,5 ° C.

3. Utarbeidelse og Inkludering av Levende Sebrafisk embryoer for Imaging (figur 1B)

  1. To timer før bildebehandling, skjerme de injiserte embryoer for GFP bruker en fluorescerende dissekere mikroskop. Plasser lyse grønne GFP-uttrykke embryoer i en ny 100 x 15 mm petriskål med E3 blå.
  2. Kok en stamløsning av 1% lavt smeltepunkt agarose etter tilsetning av 1 g av lav smelte agarose i 100 ml E3 blå. Etter bruk av agarose, dekker kolben med aluminiumsfolie. Aksjen løsning fortsatt nyttig for opptil en måned.
  3. Alikvoter 3 ml av den smeltede agar inn i et 17 x 100 mm dyrkningsrør. Hold agarose varme ved å plassere dyrkningsrør i et 42 ° C vannbad inntil den er klar for bruk. Forbered en 15 mM Tricaine løsning i avionisert vann for å bedøve de sebrafisk embryoer 36.
    MERK: Hvis avbildning på tidligere tidspunkter er ønsket, kan konsentrasjonen av agar bli redusert så lavt som 0,3% 39.
  4. Ta med 15 mM Tricaine, skjermede embryoer, lav smelte agarose, E3 blå, og en 35 mm glass dekkbunnkultur parabolen til en disseksjon lysmikroskop. Fjern forsiktig fosteret chorion med # 5 pinsett. Gjør dette for tre embryoer.
  5. Plasser dechorionated embryoene i en egen beholder for å bli bedøvet. Lokket på dekkglass nedre fatet blir ofte brukt til dette formålet. Ved hjelp av en overføring pipette, tilsett tre dråper (ca. 150 gl)15 mm Tricaine til retten av 5 ml E3 blå (hvis du bruker lokket på dekk bunnen rett) eller til embryoer er tilstrekkelig bedøvet. I tillegg legger 3-4 dråper (ca. 150-200 pl) av 15 mM Tricaine løsning på 1% agarose smeltede rør.
  6. Ved hjelp av en P200 pipette med 1 cm pipettespissen avskåret; overføre bedøves embryoene til dekk bunn parabolen. Fjern overflødig E3 Blå: Tricaine løsning.
  7. Tilsett langsomt 5 - 10 pl av lavt smelte agarose: Tricaine løsningen i løpet av embryoene, og holder hver dråpe atskilt for å sikre at embryoene ikke tilfeldigvis drift nær hverandre.
    Advarsel: Hvis agarose er for varmt, vil det skade fosteret. En god temperatur for å opprettholde den ved agar er 42 ° C.
  8. Ved hjelp av en 21 G 1 ½ nål, forsiktig orientere embryoet i agarose til ønsket posisjon. Når du bruker en invertert mikroskop for time-lapse imaging, orientere regionen av interesse (ROI) så nær dekkglass som possible.
    Merk: For generelle formål, halen regionen tilbyr enkel orientering og klarhet grunn av den relativt tynne vev (figur 1A). Andre vev, slik som epitellaget omgir eggeplomme og finne folder, kan brukes 28,29. Disse vev har stor klarhet, men disse regionene er bare noen få cellelag tykke. For formålet med denne protokollen, er det fordelaktig å avbilde hale regionen for å skaffe så mange celledelinger som mulig.
  9. Tillat et par minutter for delvis størkning av agar. Bruk nålen til å brekke fra hverandre et lite stykke agar for å teste sin størkning. Når et stykke av agar kan trekkes vekk fra rulle, gå videre til neste trinn.
  10. Dekk hele dekkglass med lav smelte agar danner en kuppel over den innebygde embryoer. La agar å stivne før du flytter parabolen for confocal imaging (figur 1A).
  11. Under agar størkningsprosessen (tar ca 10 min), forberede 3 ml of E3 Blå løsning med fem dråper (ca. 250 pl) 15 mM Tricaine som skal plasseres over den innebygde embryoer under bildebehandling.

4. 5D Confocal Imaging av Levende Sebrafisk embryoer 40,41

MERK: Se Ariga 40 og O'Brien 41 for informasjon om hvordan du utfører 5D avbildning ved hjelp av andre confocal systemer. For Z-intervall, Z-stack, Z-dybde, tidsintervall, og 5D definisjoner se figur 1C.

  1. Åpne bildebehandlingsprogrammer og sette mikroskop for å 60X NA 1.4 objektiv. Påfør immersjonsolje til objektiv og plassere kulturen fatet i lysbildeholderen på mikroskopet scenen. Bruke aksen kontrolleren, sentrerer embryo av interesse over objektiv og bringe objektiv oppover for å møte kulturen fatet.
  2. Klikk på øyet stykke ikonet og bytte til GFP filter på mikroskopet. Fokus på ROI. Med fokus på vev som er nærmest dekk vil offer de beste bilderesultatene.
  3. Fjern sperre. Velg GFP og mCherry kanaler (pre-set bølgelengder i programvare) og angi linje snitt alternativ til vanlig.
  4. Bruk "Vis / Anskaffelses kontroller / A1 Skann.område" kommandoen for å åpne A1 Skann.område verktøyet.
  5. Begynne å skanne. Bruke akse-kontrolleren, plassere embryoet slik at skanningen området er fylt med så mye av sebrafisk som mulig. Den lasereffekt behøver ikke å være optimal ved dette punktet. Senk laser makt for å unngå unødvendig fotobleking.
  6. Bruk "Vis / Anskaffelses kontroller / ND oppkjøps" kommandoen for å åpne ND oppkjøpet kontrollpanelet.
  7. Begynne å skanne for å sette Z-stack parametere. Sett Z-stack øvre grense for hvor cellene ikke er i fokus og nedre grense for hvor cellene er ikke lenger synlig. Tillat for en tre mikrometer plass over prøven for vekst og celle bevegelse, som kan ekspandere inn i bildefeltet. Z-stack for tallene som vises i dette proprotokollen dekket en Z-dybde på 40 mikrometer i embryoet halen.
  8. Angi at trinnstørrelsen Z-intervall til 2 um. I gjennomsnitt er en celle 10 pm i diameter; derfor 2 um vil produsere fem intervaller på bildedata som skal bli analysert for hver celle.
    MERK: dybde i bildet som kan erverves avhenger av Z-intervallet. Z oppløsning er ofret for å få generell dybde i Z dimensjonen for å image så mange celler som gjennomgår mitose som mulig (stor Z-dybde). Det motsatte er sant, ved at, ved å redusere trinnstørrelsen, blir Z oppløsning oppnådd, mens Z dybde er ofret (liten Z-dybde).
  9. Juster bilde laser makt, HV, og utlignet nivåer. For forsøkene demonstrert i denne protokollen, bruker du følgende laser makt, HV, og utlignet nivåer satt på tilsvarende nivåer, henholdsvis for GFP kanalen; 2-5, 120-140, og -9 til -11. For mCherry kanalen, bruker du følgende laser makt, HV, og offset nivåer, henholdsvis; 3 - 6, 120-140, og -3 til-8. Når parametrene er satt, slå av skanning for å hindre unødvendig laser eksponering som kan forårsake fototoksisitet og fotobleking av prøven.
  10. Velg 2x linjen gjennomsnitts ikonet. "No averaging" produserer et kornete bilde mens "4x linjen gjennomsnitt" drastisk øker skannetiden. Bruk av 2x linje i snitt gir den beste bildekvaliteten og raskeste skanning tid.
  11. Velge den passende tidsintervall og tidsvarighet som er nødvendig for forsøket. For vill-type seksjoner, to-minutters intervaller i 2 timer er best for bestemmelse av mitotisk varighet (benyttet i figurene 1, 2, 3A og 3B). Divisjoner som aktiverer spindelenheten sjekkpunktet i lengre tid enn 30 minutter er mer egnet for fem minutters intervaller i fire timer for å bevare fluorescens som vist i figur 3C.
  12. Sjekk "lagre til fil" boksen og navnet på filen for å automatisk lagre filen som den blir kjøpt. Dobbeltsjekk alle pameterne er satt riktig, og trykk "start run".
  13. Etter oppkjøpet er fullført, for å se filen i en tredimensjonal format, klikk på volumet terskelen ikonet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser evnen til å observere mange celledelinger ved hjelp av et bredt felt riss av en AB vill-type sebrafisk hale. Over syv mitotiske celler er avbildet i en 14 min tidsramme (Movie 1). Innen to timers tids kurs, ble over 40 mitotiske hendelser fanget. I gjennomsnitt ble 50 dele celler observert i AB og 30 dele celler i aur B m / m embryoer (figur 2B). Å ta hensyn til antall celler avbildes, forholdet av mitotiske celler til antall celler avbildes ble beregnet (figur 2C). Disse dataene tyder på at det ikke er et lavere antall celler går gjennom mitose i aur B m / m embryoer (figur 2B), men færre antall celler som avbildes. Evnen til å tilegne seg et statistisk signifikant antall hendelser som dette vil hjelpe i statistisk styrke.

Figur 3 utdyper denne teknikken til å inkludere kvantifisering mitotisk varighet. Når en time-lapse session blir kjøpt opp, kan en enkelt celle bli analysert for tidsbruk i mitose med tilstrekkelig oppløsning ved å bruke zoom-verktøyet (figur 3A, B). Mitotisk varighet beregnes manuelt ved å telle hvor mange tidsintervaller ta opp en celledeling. Antallet av tidsintervaller blir så multiplisert med tidsintervallet mellom hvert Z-stabel. For eksempel, i figur 3C, fordeling tok opp 12 tidsintervaller, og tidsintervallet mellom hver Z-stakken var 2 min. Derfor divisjonen tid for denne cellen var 24 min. Den gjennomsnittlige AB villtype divisjon tid er 25 min og 58 min for aurB m / m (figur 3B). En langvarig divisjon tid som vist i aurB m / m antyder at spindelenheten sjekkpunkt ikke har blitt oppfylt på grunn av feilaktig kinetochore vedlegg 1,2. Å ta en nærmere titt på det forstørrede i vill type embryoer, kan hver mitotiske fasen skilles (figur 3C, Movie 2). I tillegg kan mitotiske defekter observeres i aurB m / m embryo som består av mitotisk stopp og sviktet cytokinese resulterer i en binucleated celle og etterfølgende dannelse av en mikrokjerne (figur 3D, Film 3). Denne zoomet i analysen viser mitotiske defekter støtter økt divisjon tid kjøpt i figur 3B.

Diverse diverse mitotiske feil og celle skjebner som kan oppstå er utforsket i figur 4; demonstrert i esco2 + / m og esco2 m / m embryoer. I en esco2 + / m embryo, er feilaktige kromosom bevegelser registrert og kan defineres som congression defekts. Congression feil oppstår når feil mikrotubulidynamikk vedlegg er gjort. Disse feilene vil føre til svikt i kromosomene å migrere mot metafase plate. Sammenkoblede søsterkromatider, spesielt identifiserbare på min 20 og 46, som ikke har congressed mot metafase plate kan først observert på min 14. anaphase utbruddet skiller søsterkromatider justert ved metafase plate samt de sammenkoblede søsterkromatider til høyre, observert på minuttet 50. i tillegg er mulig mikrokjernedannelse observert da disse separerte søsterkromatider forblir isolert utenfor kjernen (T = 50, 4A, Movie 4). I figur 4B, er en multi-polar divisjon visualisert (Movie 5). Multi-polare divisjoner oppstår ofte på grunn av sentrosomen forsterkning, men kan forekomme gjennom andre betyr 42. I figur 4C, viser en esco2 m / m celle i utgangspunktet for tidlig søsterkromatidutveksling separation og spindel rotasjon 9,43,44. En annen celle skjebne demonstrert i dette panelet er en anaphase bro der merotelic vedlegg er uløst 45,46. Den anaphase broen kan bli først sett på minuttet 62. kromatin ser ut til tidlig decondense mens cellen er under cytokinese. Som cytokinese skjer, treffer spalting fure på decondensed kromosomer, og som abscission skjer, trekker kromatinet materiale for å danne en anaphase bro (figur 4C, Movie 6). Selv om det ikke er vist her, for å kvantifisere de cellulære skjebner, spille inn alle mitotiske divisjoner i hver ramme og den type celle skjebne de viser. Del antall celler i hver skjebnen av det totale antallet inndelinger registrert og multiplisere med 100 for å beregne celle skjebne prosent.

Figur 1
Figur 1: Protokoll Tegninger Outline. (EN) (B) Skjematisk tegning av embryoet embedding prosessen. De injiserte embryoene skal dechorionated og bedøvet. Embryoene blir deretter overført til dekkglass-bunnskål og overskudd av E3 Blue blir fjernet. Lav smelte agar blir brukt til å opprette separate domer som dekker hvert embryo. Orienter embryoene så halen er nærmest dekkglass. Vent to minutter før du legger agar dekker hele dekkglass. Vent til agar stivner før han flyttet til bildet. (C) Skjematisk tegning for å definere begrepene Z-intervall, Z-stack, Z-dybde, tid intervall, varighet og 5D som brukes i protokollen og diskusjon. Z-intervall er definert som avstanden mellom hvert bilde som et mikroskop beveger seg dypere inn i prøven til å skape en Z-stabel. Z-stack er alle bildene tatt gjennom etprøve ved den definerte Z-intervall. Avstanden reiste i en Z-stack definerer Z-dybde. Tidsintervall er mengden av tid mellom en Z-stabel og den neste Z-stabelen for å opprette en time-lapse bilde. Varigheten er den totale tidsbruken til bilde. 5D er definert som dimensjonene X, Y, Z, tid og fluorescerende utslipp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Time-Lapse Imaging Fanger Flere Mitotiske hendelser i en Live Sebrafisk embryo. (A) Time-Lapse stillbilder fra en zoomet ut eksperiment i en AB vill-type, 24 HPF sebrafisk viser flere mitotiske hendelser. Stjernene peke mot syv celler i mitose. t = tiden som har gått i min. Målestokk = 5 um. (B) Antall mitotisk cells observert i AB og aurB m / m sebrafisk haler på 24 HPF. Mean ± st. Dev., n = 3 embryoer / genotype. (C) Forholdet av mitotiske celler pr totalt antall celler i AB og aurB m / m sebrafisk haler ved 24 HPF. Mean ± st. dev., n = 3 embryo / genotype. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Individuell Cell Analysis Fanger Hver Mitotisk fase og Mitotisk Varighet. (A) En celle valgt fra det brede betraktningsfeltets riss av AB vill-type, 24 HPF sebrafisk embryo vist i figur 2A. (B) Division tid er observert for AB og aurB m / m celler og beregnes ut fra dedusere atom konvolutt breakdown (NEB) ved den første observasjonen av kondensert kromatin i en celle til dannelse av to nye datterceller. n = 3 embryo / genotype, n = 66 divisjoner for AB, n = 29 divisjoner for aurB m / m, *** p-verdi <0,001. (C) AB vill-type celle er beskåret for å visualisere den fasen progresjon gjennom mitose . t = min. Scale bar = 5 mikrometer. (D) aurB m / m celle er beskåret for å visualisere mitotisk progresjon gjennom mitose som inkluderer mitotisk arrest resulterer i cytokinese svikt og mikronuklei formasjon. Piler peker mot mikrokjerner. t = tiden som har gått i min. Scale bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4.Enkeltcelle Levende Imaging Fanger Flere Mitotiske mangler knyttet kromosom segregering og divisjon i Mitotisk Mutant Sebrafisk. (A) En beskåret bilde av en celle gjennomgår congression defekter i en esco2 + / m embryo. Den tynne pilen overvåker venstre kromosom som er trukket tilbake inn i metafase plate. Den tykke pilen overvåker riktig kromosom som ikke er trukket tilbake i metafase plate og utledes for å danne en mikrokjerne. Den doble pilen viser separasjon av retten kromosom som ikke Kongressen på anaphase utbruddet. Innfellinger viser zoomet utsikten over kromosomene som ikke klarte å kongressen. Innfellinger ble beskåret og lysstyrke forbedret for bedre visualisering. CAAX fluorescens ble fjernet for å visualisere kromosomene lettere. Målestokk = 5 um. (B) En beskjæres bilde av en celle gjennomgår mitotisk stopp som resulterer i en multi-polar divisjon i en esco2 + / M embryo. Målestokk = 5 um. (C) En beskårede bilde av en celle gjennomgår kohesjon tretthet resulterer i anaphase brodannelse sett av de trådliknende trekking mellom de to kjerner som er angitt av parentesene. Scale bar = 5 mikrometer. t = tid som har gått i min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

film 1
Movie 1. Flere celledel kan visualiseres i et bredt syn på en injisert vill-type sebrafisk embryo (høyreklikk for å laste ned).

Movie 2 Film 2. Faser i mitose kan enkelt visualiseres i en vill-type sebrafisk embryo (r ight Klikk for å laste ned). Nuclear konvolutt sammenbrudd utledes av uregelmessig utseende av kjernen og fortsetter mot congression av søsterkromatider å danne en metafase plate . Nøyaktig segregering oppstår og gir to nye datterceller.

Movie 3
Movie 3. Live-avbildning av aurB m / m embryo avslører kromosom missegregation, mislyktes cytokinese, og mikronuklei dannelse (høyreklikk for å laste ned). Nuclear konvolutt sammenbrudd utledes av uregelmessig utseende av kjernen, kromosomer spre til motsatte poler klarer å danne en skikkelig metafase plate, og fortsett å rotere på aksen utvide divisjon tid for cellen. Cytokinese ikke forekommer noe som resulterer i en 4N celle og flere mikrokjerner.

Movie 4
Movie 4. Congression feil er observert i en esco2 + / m embryo (høyreklikk for å laste ned). Nuclear konvolutt sammenbrudd utledes av uregelmessig utseende av kjernen. Etter at metafase platen er dannet, noen få indikelte kromosomer spre til hver side. Ett individ kromosom av til venstre blir til slutt trukket tilbake inn i metafase-plate mens kromosomet til høyre forblir utsiden av metafase platen, og kan sees å separere søsterkromatider ved utbruddet av anaphase. Cellen viser en langvarig divisjon tid, men ultimate dividerer med potensial mikrokjernedannelse.

Movie 5
Movie 5. Multi-polar divisjon er observert i en esco2 + / m embryo (høyreklikk for å laste ned). Nuclear konvolutt sammenbrudd utledes av uregelmessig utseende av kjernen og deretter kromosomer sammen for å danne en Y-form indicative av 3-spindel polene. Cellen viser en langvarig divisjon tid, men til slutt deler seg i 3 datterceller.

Movie 6
Movie 6. Prematur søsterkromatidutveksling separasjon og anaphase bro dannelse er observert i en esco2 m / m embryo (høyreklikk for å laste ned). Nuclear konvolutt sammenbrudd utledes av uregelmessig utseende av kjernen og deretter kromosomer spre gjennom hele cellen i stand til å danne en riktig metafase plate. Kromatinet decondenses før cytokinese og som cellen deler seg, skaper en anaphase bro mellom de to cellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruk av denne fremgangsmåten gjør det mulig å utlede atom konvolutt sammenbrudd, dannelsen av en metafase plate ved mikrotubul-kinetochore vedlegg, og segregering av søsterkromatider for å danne to nye celler in vivo og i en tidsavhengig måte. Evnen til å observere mitose i sebrafisk er fordelaktig i faste prøver og cellekultursystemer fordi cellene som avbildes i den naturlige fysiologi, er vevet gjennomsiktig som gjør det mulig for fluorescerende proteiner som skal brukes, utvikler de forholdsvis hurtig, og time-lapse avbildning kan bli kjøpt opp. Bruk av voksen sebrafisk for denne protokollen er begrenset på grunn av den begrensede Z-dybde som kan erverves grunn av tykkere vev som ikke er hud eller øyne. Mens transgene dyr som uttrykker H2A.F / Z-EGFP og mCherry-CAAX kunne brukes for samme formål, allsidighet og lette av mRNA-injeksjoner i forskjellig mutant sebrafisk er fordelaktig i genetiske krysninger. I situasjoner hvor mitotiske analyse erkreves i tre dager etter befruktning (dpf) eller senere embryoer, ville transgene dyr være nødvendig på grunn av halveringstiden til RNA i denne rask utvikling organisme.

Andre fluorescerende proteiner for å visualisere mitose er mottagelig for denne protokollen. For eksempel, er H2B-GFP mRNA et alternativ til H2A.F / Z-EGFP for kromatin, og gir tilsvarende merking. Andre fluorescerende-merket proteiner som kan brukes i denne teknikken inkluderer POM121, centrin, EB1, Hec1, og EMTB som ville tillate for live in-embryo avbildning av kjernefysisk konvolutt, Sentrioler, pluss-end mikrotubuli kinetochore og mikrotubuli, henholdsvis 32,47-51.

Denne protokollen har flere viktige bildebehandlings tiltak som må gjennomføres for å oppnå bedre resultater: 1) Sørg for å optimalisere mRNA kvalitet og konsentrasjon for å gi det klareste fluorescens og ingen toksisitet som mulig. Jo mer fluorescens vil føre til mindre laserstråling og derfor mindre photobleaChing og fototoksisitet. 2) Den embryo må være fullt bedøvet og sikkert i agar. Små bevegelser vil endre resultatene, og kan ødelegge hele forsøket. 3) Et agar-konsentrasjonen må være passende for den fasen av embryo ønskes å bli avbildet. Ved 24 HPF og videre, er 1% lavtsmeltende agarose egnet. Hvis bildebehandling på 12 HPF eller tidligere, bør en 0,3% agarose oppløsningen brukes 39. 4) Den avkastningen i embryoet bør være så nær dekkglass som mulig. Dette trinnet begrenser ikke en for avbilding av halen. Øyne, hud, rygg region, eggeplomme, og fin fold er eksempler på andre områder som kan bruke denne protokollen.

Tid er den avgjørende faktor som skiller denne protokollen fra bilde fast embryoer eller vev. Når du setter opp Z-stack, Z-intervall, time-lapse intervall, og time-lapse varighet, er det viktig å huske på sammenheng med forsøket (figur 1C). En vill-type celledeling vanligvis varer ca 25 min ved 24 HPF. i ther eksempel, har en 2 mikrometer Z-intervallet dekker 40 mikrometer av vev i en Z-stack, med en to minutters tidsintervall for to hr vist seg effektive. Videre, i embryoer med defekt mitose, celler i en mitotisk stopp vil mest sannsynlig være til stede, drastisk øker celledelings ganger. For å skaffe flere fulle divisjoner, bør varigheten økes, dvs. fra 2 timer til 4 timer. En lengre oppkjøp tid vil utsette prøven til mer laser makt og øke risikoen for fotobleking og fototoksisitet. I dette tilfelle må tidsintervallet mellom hver Z-stabel økes. Dynamiske kromosom bevegelser vil bli ofret ved å øke tidsintervallet mellom Z-stabler, men varigheten er oppnådd. Dette er nødvendig når tenkelig celledelinger som kan vare over to timer.

Selv om det ikke er direkte diskutert, kan denne protokollen optimaliseres for å oppnå et bilde med høyere oppløsning i Z-planet for mer nøyaktig å visualisere individuell kromosom movements. For eksempel, i figur 4A to missegregated kromosomer er observert. Kromosomet til høyre (bemerket av den tykke pil) er i utgangspunktet lyse og i fokus, men dimmer i de siste rammer. Med en 2 mikrometer Z-intervall, faller uncongressed kromosomet mellom Z-intervallet. Fange minutt bevegelser og enkelt kromosom hendelser kan oppnås ved å øke oppløsningen i Z planet. For å gjøre dette, zoome inn på en enkelt celle med A1 Skann.område verktøyet. Når du setter opp Z-stable parametrene, bruker du en mindre Z-intervall avstand. En anbefalte området er 0,5 til 1 mikrometer. I tillegg vil redusere tidsintervallet mellom hver Z stabel skape mykere overganger mellom hver tidsperiode, dvs. fra to min til 30 sekunder - 1 minutt. En påminnelse til denne typen bildebehandling er begrenset Z-dybden som kan oppnås. På grunn av den mindre Z-intervall og tidsintervallet, blir mer vev bli utsatt for lasere i en mindre tidsperiode. For å overvinne dette, smaller tidsvarigheten kan anvendes; men dette er også avhengig av hvor lenge forskeren ønsker å fange divisjoner.

En analogi som kan hjelpe med disse endringene er å tenke på en Z-stack som et trekkspill. Avstanden mellom hver fold av belgen er den Z-intervall og Z-dybde er representert ved lengden av trekkspill. I et tilfelle hvor man ikke ønsker å avsette noe mer laser eksponering til prøven, som trekkspill strekninger (øker Z-dybde), må avstanden mellom foldene i belgen (Z-intervall) også øke. Det motsatte er sant i det som trekkspill kontrakter, reduserer Z-dybde. Plissene av belgen kontrakten også, tilsvarende en reduksjon i Z-intervall. Denne analogien kan brukes på fast og levende eksempler. Kompleksiteten øker i denne protokollen når tiden blir lagt til ligningen. Det er en begrenset mengde tid at trekkspilleren kan utvide eller kontrakt trekkspill. dette representertts tidsintervallet. For å dekke mer avstand (Z-dybde) tidsintervallet må øke. I tillegg, for å høre mer musikk, må man lytte etter en lengre tidsperiode (varighet) I forhold til denne protokollen, for å være vitne til flere celledelinger, må varigheten øke. En compounding faktor å huske på er at jo mer musikk som spilles, jo mer sliten av trekk. Dette er analogt til den endelige dimensjon, fluorescens. Jo mer laser eksponering prøven er gitt, blir mer fotobleking og fototoksisitet (tretthet) et problem.

Oppsummert denne protokollen detaljer en metode for å visualisere mitose i et live sebrafisk embryo som gjelder for ulike analyser; 1) divisjon nummer 2) divisjon tid 3) divisjon skjebne og 4) kromatin dynamikk høy oppløsning. Flere muligheter for å visualisere mitotiske komponenter som spenner fra mikrotubulidynamikk-kinetochore vedlegg til centriole dynamikk kan brukes. Ved å kombinere evnenbildebehandling mitose in vivo med den siste utviklingen i genomet redigering i sebrafisk vil gjøre det enkelt å generere mutanter i ulike aspekter av mitose å modellere menneskelig sykdom i et virveldyr organisme 25,26,52-56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCS2 vectors Gift from K. Kwan For plasmid of interest
NotI-HF restriction enzyme New England BioLabs R3189S For restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kit Life Technologies AM1340 For in vitro transcription
RNeasy Mini kit Qiagen 74104 For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 For housing embryos
microinjection mold homemade For holding embryos during microinjection
Agarose II Amresco 0815-25G For embedding embryos
Tricaine Sigma-Aldrich E10521-10G For anesthetizing embryos
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich C8106 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M7506 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate Sigma-Aldrich MB1 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tube Fisher Scientific 50-819-812 For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish  MatTek Corp P35G-0-20-C  No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezers Dumont 72701-D For dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needle Becton Dickinson 305167 For positioning embryos in agar
Dissecting microscope Nikon AZ100 For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscope Nikon A1+ For time-lapse imaging
Confocal software NIS Elements AR 4.13.00 For image acquisition and processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
  2. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  3. Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
  4. Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
  5. Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
  6. Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
  7. Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
  8. Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
  9. Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
  10. Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
  11. Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
  12. Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
  13. Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
  14. Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
  15. Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
  16. Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
  17. Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
  18. Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
  19. Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
  20. Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
  21. Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
  22. Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
  23. Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
  24. Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
  25. Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
  26. Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
  27. Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
  28. Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
  29. Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
  30. Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
  31. Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  32. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  33. Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
  34. Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
  35. Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
  36. Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
  37. Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
  38. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  39. Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
  40. Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
  41. O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
  42. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
  43. Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
  44. Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
  45. Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
  46. Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
  47. Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  48. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
  50. Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
  51. Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
  52. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  53. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  54. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  55. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
  56. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).

Tags

Developmental Biology Live bildebehandling sebrafisk mitose kromosom dynamikk confocal bildebehandling genomisk ustabilitet mitotisk arrest cellebiologi mikroinjeksjon,
Observerer Mitotisk divisjon og Dynamics i en Live Sebrafisk Embryo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Percival, S. M., Parant, J. M.… More

Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218, doi:10.3791/54218 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter