Abstract
有糸分裂は、生物の増殖および分化に重要です。プロセスは非常に動的であり、短い時間枠内で適切なクロマチン凝縮、微小管動原体結合、染色体分離、および細胞質分裂を達成するために、イベントを命じする必要があります。繊細なプロセスのエラーは、出生異常や癌を含む、ヒトの疾患につながることができます。ヒトの有糸分裂の疾患状態を調査する従来のアプローチは、多くの場合、ヒトの疾患を研究する自然な生理機能および有利な発達/組織特異的な文脈を欠いている細胞培養系に依存しています。このプロトコルは、高解像度、脊椎動物のシステムにおける染色体ダイナミクス、ゼブラフィッシュで、視覚化する方法を提供することで、多くの障害を克服します。このプロトコルの詳細が含ま分裂細胞の動的な画像得るために使用することができるのアプローチは以下となります。in vitro転写、ゼブラフィッシュの繁殖/収集、胚の埋め込 み、およびタイムラプスイメージングを。最適化とMODIFこのプロトコルのicationsも模索されています。 H2A.F / Z-EGFP（ラベルのクロマチン）を使用し、mCherryを-CAAX（ラベルの細胞膜）のmRNAを注入した胚、AB野生型で有糸分裂、 オーロラの hi1045、およびesco2の hi2865変異体ゼブラフィッシュが可視化されます。ゼブラフィッシュにおける高解像度のライブイメージングは1つが統計的に有糸分裂欠陥や有糸分裂進行のタイミングを定量化するために、複数の有糸分裂を観察することができます。また、不適切な（ すなわち、会合欠損、染色体のmissegregation、 等 ）有糸分裂プロセス及び不適切な染色体結果（ すなわち、異数性、倍数性、小核、 等）を定義質的側面 の観察が観察されます。このアッセイは、組織分化/開発の観測に適用され、変異体ゼブラフィッシュ及び薬理学的薬剤の使用に適していることができます。有糸分裂の欠陥が癌や発達障害になります大幅につながる方法の可視化疾患の病因の理解を高めます。
Introduction
有糸分裂は、生体内の増殖、分化、および再生のための重要な細胞プロセスに不可欠です。正確な準備と間期におけるDNAの複製の際に、細胞は分裂するプライミングされます。有糸分裂の第一期、前期は、サイクリンB / Cdk1のの活性化によって開始されます。前期は、染色体にクロマチン材料の凝縮によって特徴付けられます。核膜の内訳は、前期と中期の間の遷移で発生します。前中期では、中心体は、紡錘体形成のための核形成中心は、動原体の添付ファイルの検索で微小管を拡張しながら反対の極に移行し始めます。取り付け時には、変換は微小管の添付ファイルを-終了すると張力は、中期板1を形成する染色体を向けます。すべての染色体が正しく接続されている場合、スピンドルアセンブリチェックポイントが満たされ、一緒に姉妹染色を保持コヒーシン環が切断され、および微小管は妹を引っ張って短くされています後期2,3の間に反対の極にクロマチド。最終段階、終期は、二つの新しい核の周りに核膜のセルと改革の伸長を伴います。細胞質分裂は、2つの新しい娘細胞4-6の細胞質を分離することにより、分割プロセスを完了します。キー有糸分裂経路（ すなわち、紡錘体形成チェックポイント、中心体の複製、姉妹染色分体の接着など ）の変更は、中期停止、染色体のmissegregation、およびゲノム不安定性7-10をもたらすことができます。最終的には、有糸分裂を制御する経路における欠陥は、有糸分裂およびライブでの欠陥、脊椎動物、多細胞生物10-16の可視化を必要と、発達障害やがんを引き起こす可能性があります。
ゼブラフィッシュの胚は透明な組織、マイクロインジェクションの容易さ、および迅速な開発によるライブイメージングのための偉大なモデル生物としての役割を果たす。ゼブラフィッシュを用いて、この原稿の全体的な目標はにありますライブ5D有糸分裂17（ 図1C）の（寸法X、Y、Z、時間、及び波長）イメージングの方法を記載します。別の有糸分裂経路における欠損変異体ゼブラフィッシュの使用は、このような欠陥の結果を示しています。このプロトコルについては、オーロラBおよびEsco2変異体は、これらの欠陥を説明するために選択しました。オーロラBは、紡錘体形成と微小管の添付ファイルに関わる染色体パッセンジャー複合体（CPC）の一部であるキナーゼです。また、細胞質分裂18,19内の分裂溝の形成のために必要とされます。ゼブラフィッシュでは、オーロラBの欠乏は畝間誘導、細胞質分裂、および染色体分離20の欠陥につながります。 Esco2は、他の一方で、姉妹染色分体凝集21,22のために不可欠であるアセチルトランスフェラーゼです。したがって、中期、後期の遷移23で適切な染色体分離を確保するために、コヒーシンの安定化リングのSMC3部にコヒーシンをアセチル化。ゼブラフィッシュにおけるEsco2の損失をCHにつながりますromosome missegregation、早期の姉妹染色分体の分離、ゲノム不安定性、およびp53依存性および非依存性アポトーシス24,25。在庫状況により、 オーロラの hi1045、およびhi2865変異ゼブラフィッシュをesco2に（以下、それぞれ、aurB メートル/メートルと呼ばれ、esco2 m / m）のこの手法25-27を説明するために使用されます。
蛍光タグ付き細胞機構とのカップリング共焦点顕微鏡は、有糸分裂25,28,29の間にクロマチンと細胞膜動態を可視化する研究を可能にしました。蛍光タグ化ヒストンは、歴史的にクロマチンを可視化するために使用されてきました。ヒストンは、染色体30を構成するヌクレオソーム構造を担当している4異なる対（H2A、H2B、H3、およびH4）からなる核タンパク質です。 H2Bは間違いなく中の蛍光タンパク質のための最も使用されるヒストンですがマウスおよび細胞培養、ヒストン2Aの使用、家族Z（H2A.F / Z）はゼブラフィッシュ31,32で使用するために十分であることが判明しました。コンカナバリンA及びカゼインキナーゼ、例えば、1-γは、細胞膜に局在し、以前にウニとショウジョウバエ33,34に細胞膜を可視化するのに有効なことが示されています。他の研究では、CAAX蛍光標識タンパク質が細胞膜を標識することが示されており、ゼブラフィッシュ31に成功したしました。 CAAXは、farnesyltransferasesやgeranylgeranyltransferasesなどの翻訳後修飾酵素によって認識されるモチーフです。これらの酵素による修飾は、タンパク質は、このように細胞膜35を標識する 、膜結合になることが。
ゼブラフィッシュでの使用前に、このプロトコルは、クロマチンと細胞膜を標識するためにH2A.F / ZとCAAXを使用することにしました。この方法の適用は、個々の染色体を観察するために、研究者は、個々の細胞レベルで有糸分裂を監視することができますダイナミクスは、だけでなく、同時に組織分化と発達に影響を与える可能性のある複数の細胞分裂を監視します。この記事では、個々の細胞レベルでの有糸分裂の際に染色体の分離のダイナミクスを画像化に焦点を当てます。この原稿の中に、いくつかの有糸分裂を観察する分割時間を計算し、有糸分裂の表現型を解読する能力が示され、説明されます。これらのパラメータを用いて、生理学的に関連するデータを収集することができ、有糸分裂の欠陥の影響を受け、いくつかの疾患状態に適用されます。
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Protocol
1. in vitro転写
- 酵素31を消化NotI制限によってPCS2-H2A.F / Z-EGFPおよび/ またはPCS2-mCherryを-CAAXベクトルを線形化。 インビトロ転写キットに RNAを用いて、製造業者のプロトコールに従って、各テンプレートから5 'キャップされたmRNAの産物を生成します。
- 精製キットを用いてキャップされたmRNAを精製します。製造元の指示に従ってください。 RNaseフリーのH 2 Oで溶出
- 分光光度計を用いて260 nmの吸光度によってRNAの濃度を決定します。 （OD 260のx希釈×40 / mlの）。
- 各H2A.F / Z-EGFPおよびRNaseフリーH 2 OでmCherryを-CAAXのためμL/ 100 ngのにRNAの希釈RNAの濃度が低すぎると、蛍光が減少または存在しないことになります。明るいサンプルは、光毒性および光退色に対する懸念を軽減します。一方、あまりにも多くのRNAは有毒であることおよび/またはオフターゲット効果を引き起こす可能性があります。
注：残りの保管-80℃の冷凍庫で精製したmRNA。
2.ゼブラフィッシュの繁殖、胚コレクション、およびmRNA注入36-38
- 二つの領域にタンクを分離し、ゼブラフィッシュの施設で使用される養殖システムの水でそれぞれ飼育タンクを埋めるために障壁と繁殖タンクを組み立てます。
- 不時の繁殖を防ぐために、飼育前夜反対側の障壁と二人の女性の魚の片側に2男性の魚を置きます。
- 翌日、氷の上に先に調製したmRNA混合物を解凍。新鮮な養殖システムの水で飼育水槽内の水を交換し、障壁を取り除きます。障壁が引っ張られた直後、28.5°Cに射出成形金型を温め、マイクロインジェクションのための機器を設定します。
注：射出成形金型については、ゲルラッハ36を参照してください。 - 茶こしを使って15分とEとのきれいな100×15ミリメートルペトリ皿に卵をすすぐ - 卵ごとに10を収集3ブルー（5のNaCl、0.17のKCl、0.33mMのCaCl 2を、0.33 mMのMgSO 4を、10 -5％メチレンブルー）。 E3ブルーは、真菌の増殖を防止し、仔魚の適切な発展を確実にするために使用されます。交配と胚コレクションの詳細については、ゲルラッハ36とPorazinkski 37を参照してください。
- 埋め込 み1セルは、温めた射出成形金型に胚を上演し、胚の所望の量（ 図1A）に卵黄の中にRNAを注入します。実験に必要とされるよりも15％以上の胚の胚性注射を行うことで、自然胚の死と未受精胚のためのアカウント。ゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクションに関する詳細については、ゲルラッハ36とPorazinkski 37を参照してください。
注：mRNAの初めての使用のためには、前5D撮影を行うには（5 DPFまで肉眼発達障害と定義される）蛍光および生存のために最適な用量を決定するために、用量曲線分析を行います。 150から200 ngの/μlの胚に注入は、したがって、それは最終濃度ための良い出発点であり、多くの場合、最適な濃度です。 - 慎重に修正された9「ガラスパスツールピペットを用いて、金型から注入された胚を抽出します。ピペットを変更するには、それがボールを形成するまでブンゼンバーナーを使用して、エンドを溶かします。
- 100×15ミリメートルのペトリE3ブルーディッシュと28.5℃のインキュベーターに家に注入された胚を置きます。
- 六時間の注射後、プレートから任意の死亡または未受精胚を削除し、クリーンE3ブルーを追加します。 28.5℃でのハウスは、胚。
3.イメージングのためのライブゼブラフィッシュ胚（図1B）の調製と埋め込み
- 撮影前の2時間は、蛍光解剖顕微鏡を用いてGFPのための注入された胚を選別します。 E3ブルーと新しい100×15ミリメートルペトリ皿に明るい緑色のGFP発現胚を置きます。
- アガロースE3ブルー100mlに低融点1gを添加することによって、1％低融点アガロースのストック溶液を沸騰。アガロースを使用した後、アルミホイルでフラスコを覆います。原液は、1ヶ月までのために有用なままです。
- 17×100mmの培養チューブに小分けした溶融寒天の3ミリリットルを。使用するまで42℃の水浴中で培養管を配置することによって、アガロースを暖かく保ちます。ゼブラフィッシュ胚36を麻酔するために、脱イオン水で15 mMのトリカイン溶液を調製します。
注：以前の時点で撮像が望まれる場合、寒天の濃度は0.3％39限り低く低下させることができます。 - 15 mMのトリカイン、スクリーニングの胚、低融点アガロース、E3ブルー、および解剖光顕微鏡に35ミリメートルのカバーガラス底の培養皿を持参してください。慎重に＃5ピンセットで胚の絨毛膜を除去します。 3胚のためにこれを行います。
- 麻酔する別の容器にdechorionated胚を置きます。カバーガラスボトムディッシュの蓋は、多くの場合、この目的のために使用されます。トランスファーピペットを用いて、3滴（約150μl）を追加15 mMのトリカインの5ミリリットルE3青（カバーガラスボトムディッシュの蓋を使用している場合）または胚が十分に麻酔をかけてきたまでの一品に。 1％溶融アガロースチューブに15 mMのトリカイン溶液を - （200μlの約150）また、3-4滴を追加します。
- カットオフピペットチップから1cmとP200のピペットを用いて、カバーガラス底皿に麻酔胚を移します。余分なE3ブルーを削除：トリカインソリューション。
- 胚が誤ってお互いに近いドリフトしないことを保証するために別々の各ドロップを保ち、胚を超えるトリカインソリューション：低融点アガロース10μlの - ゆっくりと5を追加します。
警告：アガロースがあまりにも暖かくている場合、それは胚を損傷します。寒天を維持するために良好な温度は42℃です。 - 21 G 1½針を使用して、静かに所望の位置にアガロースで胚を向けます。タイムラプスイメージングのための倒立顕微鏡を使用する場合、possibなどのカバーガラスに近い関心領域（ROI）を配向ル。
注意：一般的な目的のために、テール領域が比較的薄い組織（ 図1A）に配向し、明確化のしやすさを提供しています。そのような卵黄フィン折り目を囲む上皮層などの他の組織は、28,29を使用することができます。これらの組織は、しかし、これらの領域がわずか数細胞層の厚さ、偉大な明快さを提供しています。このプロトコルのためには、できるだけ多くの細胞分裂を取得するテール領域画像に有益です。 - 寒天の部分凝固のためのいくつかの分を許可します。その凝固をテストするために、寒天の小片を分割するために針を使用してください。寒天の片が落下から引き離すことができた場合、次のステップに進みます。
- 低融点寒天が埋め込まれた胚の上にドームを形成すると全体カバースリップをカバーしています。寒天は、共焦点画像（ 図1A）のための皿を移動する前に固化することを可能にします。
- 寒天凝固過程（約10分かかります）中に3mlのO調製（約250μl）を15 mMのトリカインの5滴とF E3ブルー溶液は、撮像中に埋め込まれた胚の上に配置されます。
ライブゼブラフィッシュ胚40,41の4 5D共焦点イメージング
注：他の共焦点システムを使用して5D撮影を行う方法の詳細については有賀40とオブライエン41を参照してください。 Z-intervalには、Zスタック、Z深度、時間間隔、および5Dの定義は、 図1Cを参照してください。
- イメージングソフトウェアを開き、60X NA 1.4対物レンズに顕微鏡を設定します。対物レンズにイマージョンオイルを塗布し、顕微鏡ステージ上にスライドホルダーに培養皿を置きます。軸コントローラを使用して、対物レンズの上に興味のある胚を中心と培養皿を満たすために上向きの対物レンズをもたらします。
- アイピースのアイコンをクリックして、顕微鏡でGFPフィルターに切り替えます。 ROIに焦点を当てています。 Oカバーガラスに最も近い組織になります着目最良の撮像結果ffer。
- インターロックを外します。 （ソフトウェアで予め設定された波長）GFPとmCherryをチャンネルを選択し、通常のオプションを平均ラインを設定します。
- A1スキャン領域のツールを開くには、「表示/取得コントロール/ A1スキャン領域」コマンドを使用します。
- スキャンを開始します。スキャン領域を可能なゼブラフィッシュの限りで満たされているように、軸コントローラを使用して、胚を置きます。レーザー出力は、この時点で最適である必要はありません。不要な光退色を避けるために、レーザーパワーを下げます。
- ND取得コントロールパネルを開くには、「表示/取得コントロール/ ND取得」コマンドを使用します。
- Z-スタックパラメータを設定するためにスキャンを開始します。細胞は、もはや表示されている場所へのZ-スタックセルにフォーカスがないどこに上限値と下限値を設定します。イメージング分野に拡張してもよい成長と細胞運動のためのサンプル上記3μmの空間を可能にします。このプロに示す数値のためのZスタックトコールは、胚の尾部に40ミクロンのZ深さをカバーしました。
- 2μmのZ-間隔のステップサイズを設定します。平均すると、細胞は直径が10μmです。したがって、2μmの各セルのために分析されるイメージングデータの5区間を生成します。
注：取得することができる画像の深さはZ間隔に依存します。 Zの解像度が可能（大Z-深さ）などの有糸分裂を受けて、多くの細胞として画像化するためにZ次元での全体的な深さを得るために犠牲にされています。逆が真であるZ深さを（小Z深度）犠牲にしながら、その中に、ステップサイズを小さくすることにより、Z分解能が得られます。 - 画像レーザパワー、HVを調整し、レベルを相殺しました。このプロトコルで実証実験のために、以下のレーザーパワー、HVを使用し、GFPチャネルに対して、それぞれ、対応するレベルで設定レベルをオフセット。 5、120 - - 2 140、および-11 -9。 mCherryをチャネルに対して、それぞれ、次のレーザパワー、HVを使用して、レベルをオフセット。 3から6、120から140、および-3へ-8。パラメータを設定したら、サンプルの光毒性および光退色を引き起こす可能性があり、不必要なレーザー露光を防止するためにスキャンを遮断してください。
- 2倍のライン平均のアイコンを選択します。 「いいえ、平均は「大幅に」平均4倍のラインが「スキャン時間を増加させながら、粒子の粗い画像を生成しません。 2倍のライン平均を使用すると、最高の画質と最速のスキャン時間を提供します。
- 実験のために必要な適切な時間間隔と持続時間を選択します。野生型分割のために、2時間2分の時間間隔は、（ 図1、図2、図3A、および図3Bにおいて使用される）、有糸分裂の持続時間を決定するのが最良です。より長い30分間紡錘体チェックポイントを活性化部門は、図3Cに示されているように、蛍光を維持するために4つの時間、5分間隔のために適しています。
- 「ファイルに保存」ボックスをチェックし、それが取得されているときに自動的にファイルを保存するファイルに名前を付けます。すべてのPAダブルチェックラメータが正しく設定され、「実行を開始「ヒットしています。
- 買収は、3次元形式でファイルを表示するには、完了すると、ボリュームのしきい値アイコンをクリックしてください。
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Representative Results
図2は、AB、野生型ゼブラフィッシュテールの広視野ビューを使用して、多くの細胞分裂を観察する能力を示しています。 7上の有糸分裂細胞は、14分間の時間枠（ 動画1）に結像されます。 2時間の時間経過の中で、40以上の有糸分裂のイベントが捕捉しました。平均して、50分裂する細胞は、ABとAUR BはM / m個の胚（ 図2B）で30分裂細胞で観察されました。撮像された細胞の数を考慮して、撮像された細胞の数に有糸分裂細胞の割合は、（ 図2C）を算出しました。このデータは、AURのB / M胚において有糸分裂を通過する細胞のより低い数（ 図2B）が、撮像される細胞の少ない数が存在しないことを示唆しています。このようなイベントの統計的に有意な数を取得する能力は、統計的検出力に役立ちます。
図3は、有糸分裂期間を定量含めるには、この手法を拡張したものです。タイムラプスセッションが取得されると、個々のセルは、ズームツール（ 図3A、B）を使用して、適切な解像度を有する有糸分裂に費やされた時間のために分析することができます。有糸分裂期間は、多くの時間間隔は1細胞分裂を取る方法をカウントすることにより、手動で計算されます。時間間隔の数は、各Zスタック間の時間間隔を乗じます。例えば、 図3Cに、部門は12時間間隔を取り上げ、それぞれのZスタック間の時間の間隔は2分でした。したがって、このセルの分割時間は24分でした。平均AB野生型分割時間は25分とaurB / M 58分間（ 図3B）である。aurBの M / Mに見られるような長期分割時間は紡錘体形成チェックポイントが誤キネに満たされていないことを示唆していますtochore添付1,2。野生型胚でズームをよく見ると、それぞれの分裂期には（ 図3C、 映画2）を区別することができます。また、有糸分裂欠陥は、有糸分裂の停止が含まれており、小核（ 図3D、 映画3）の二核細胞およびその後の形成をもたらす細胞質分裂に失敗したaurB メートル/メートル胚で観察することができます。有糸分裂の欠陥を示す分析ズームインこれは、 図3（b）で取得した増加分割時間をサポートしています。
遭遇し得る種々の他の多様な有糸分裂の欠陥および細胞運命は、図4で検討されています。 esco2 + / mおよびesco2 メートル/ mの胚で実証されました。 esco2 + / m個の胚では、誤った染色体の動きが捕捉され、会合の欠陥として定義することができます。sです。不適切な微小管の添付ファイルが行われたとき会合欠陥が発生します。これらの欠陥は、中期板に向かって移動する染色体の故障の原因となります。中期板に向かってcongressedしていない分20と46で特に識別可能な対になった姉妹は、最初のmin 14後期発症は、右に中期板で整列姉妹だけでなく、対になった姉妹染色分体を分離で観察することができますこれらの分離された姉妹は、核（T = 50、 図4A、映画4）の外側に絶縁されたままのようにさらに分50で観測され、可能な小核形成が観察されます。 図4Bに、多極分裂を（ 映画5）可視化されます。多極部門は多くの場合、中心体増幅に発生しますが、他の手段42を介して発生することがあります。 図4Cでは、esco2 メートル/ mのセルは、最初に早期の姉妹染色分体separatを実証しますイオンと主軸回転9,43,44。このパネルで実証別の細胞運命はmerotelic添付ファイルが45,46未解決である、後期橋です。後期ブリッジは最初のクロマチンは、細胞が分裂を受けている間に早期decondenseに見える分62で見ることができます。細胞質分裂が起こると落果が発生したように、分裂溝は、脱凝縮染色体に衝突し、後期ブリッジ（ 図4C、映画6）を形成するために、クロマチン材料を引っ張ります。ここでは図示しないが、細胞の運命を定量するために、各フレームと、それらが示す細胞の運命のタイプのすべての有糸分裂を記録します。記録された区分の総数によって各運命に細胞数を分割し、細胞の運命のパーセンテージを計算するために100を掛け。
図1：プロトコル図面概要。 （A） 。（B）胚埋め込 み処理の模式図。注入した胚は、dechorionatedと麻酔されなければなりません。胚は、次いで、カバーガラスボトムディッシュに移し、過剰E3ブルーを除去します。低融点寒天を各胚をカバーする別個のドームを作成するために使用されます。尾部がカバーガラスに最も近いので、胚を向けます。全体カバースリップをカバー寒天追加する前に、2分を待ちます。寒天を画像に移動する前に固化されるまで待ちます。（C）模式図プロトコルとの議論で使用される用語Z-間隔、Zスタック、Z深度、時間間隔、継続時間および5Dを定義します。 Z間隔は、顕微鏡のZスタックを作成するために試料中に深く移動するように、各画像間の距離として定義されます。 Z-スタックを通して撮影された画像の全てです定義されたZ-間隔でサンプル。 Zスタックに移動した距離は、Z深さを定義します。時間間隔は1、Zスタックとタイムラプス画像を作成するために、次のZスタック間の時間です。持続時間は、画像に使用される時間の合計です。 5Dは寸法X、Y、Z、時間、および蛍光発光のように定義されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. タイムラプスイメージングは、ライブゼブラフィッシュ胚における複数の有糸分裂のイベントをキャプチャします。 （A）AB野生型でズームアウトした実験からの時間経過の静止画、複数の有糸分裂事象を示す24 HPFのゼブラフィッシュ。アスタリスクは、有糸分裂中の7つのセルに向かって指しています。分で経過トン=時間。スケールバー=5μmである。（B）有糸分裂CEの数24 HPFでABおよびaurB メートル/ mのゼブラフィッシュテイルで観察LLS。 ±世紀を意味します。 DEV。、N = 3の胚/遺伝子型（C）AB及びaurB M /中の細胞の総数当たりの有糸分裂細胞の割合は、24 HPFにおけるゼブラフィッシュテールをmです 。 ±世紀を意味します。 DEV。、n = 3の胚/遺伝子型。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. 個々の細胞分析は、各分裂期と分裂時間をキャプチャします。 （A）、 図2（a）に示すAB野生型、24 HPFのゼブラフィッシュ胚の広視野のビューから選択されたセル。 （B）部門の時間がABのために観察され、aurB メートル/メートル 細胞および核エンベロープBREを推論から計算二つの新しい娘細胞の形成に細胞内の凝縮クロマチンの最初の観測でakdown（NEB）。 aurB メートル/ mに対するn = 3の胚/遺伝子型、N = ABのための66の部門はn = 29部門、*** p値<0.001。（C）AB野生型細胞が有糸分裂を介して位相進行を可視化するためにトリミングされ。トン=分。スケールバー=5μmである。（D）aurB メートル/メートル 細胞は、細胞質分裂の失敗と小核の形成をもたらす有糸分裂停止を含み、有糸分裂を介して有糸分裂の進行を視覚化するためにトリミングされています。矢印は、小核に向かって指しています。分で経過トン=時間。スケールバー=5μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4。単一細胞のライブイメージングは、有糸分裂変異における染色体分離および部門に関連する複数の有糸分裂の欠陥をキャプチャ ゼブラフィッシュ。 （A）esco2 + / m個の胚に会合欠陥を受けたセルのトリミングされた画像。細い矢印は、中期板に引き戻され、左染色体を監視します。太い矢印は、中期板に引き戻さと小核を形成するように推測されていない右の染色体を監視します。二重の矢印は、後期発症時の議会なかった右染色体の分離を示します。挿入図は、議会に失敗した染色体のビューでズーム表示しています。インセットは、より見やすくするためにトリミングされ、明るさが向上しました。 CAAX蛍光がより容易に染色体を視覚化するために除去しました。 = 5μmのスケールバー。（B）esco2における多極分裂をもたらす有糸分裂停止を受けているセルのトリミングされた画像+ / m個の胚。スケールバー=5μmである。糸状括弧で述べた2つの核の間に引いて、見後期架橋形成に得られた細胞受けて凝集疲労の（C）Aトリミングされた画像。スケールバー=5μmです。分で経過トン=時間。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
1.複数の細胞分裂が注入された野生型ゼブラフィッシュ胚の広い視野で可視化することができるムービー （右クリックしてダウンロード）。
有糸分裂の映画2フェーズを簡単に野生型ゼブラフィッシュ胚で可視化することができる （R IGHTをクリックしてダウンロード）。核膜内訳は、中期板を形成するために、姉妹の会合に向けた核および進行の不規則な外観から推測されます。正確な分離が発生し、二つの新しい娘細胞が得られます。
映画3.ライブイメージング aurB メートル/メートルの 胚は、染色体のミスを明らかにegregationは、（右クリックしてダウンロード）細胞質分裂、および小核形成に失敗しました。原子力封筒の内訳は、核の不規則な外観から推測され、染色体が適切な中期板を形成することができませんでし反対の極に飛散し、分裂を延びる軸に回転するように進んでくださいセルの時間。細胞質分裂は4Nセルと複数の小核の結果発生しません。
映画4.会合の欠陥が観察される esco2 + / m個の 胚 （右クリックしてダウンロード）。核膜崩壊は核の不規則な外観によって推測されます。中期板を形成した後、いくつかのINDIvidual染色体はどちらかの側に飛散します。右の染色体が中期板の外に出たままと後期の開始時に姉妹染色分体を分離見ることができますしながら、左にオフOne個々の染色体は、最終的には中期板に引き戻されます。細胞は、潜在的な小核形成と長期の分割時間が、究極の格差を示します。
映画5. マルチ極性分割が esco2 + / m個の 胚 で観察された （右クリックしてダウンロード）。核膜崩壊は核の不規則な外観によって推論された後、染色体はY字型を形成するためにマージindicativ3-紡錘体極の電子。細胞は、長期の分割時間を示すが、最終的に3の娘細胞に分割します。
映画6. 早期の姉妹染色分体の分離および後期ブリッジ形成は （右クリックしてダウンロード）esco2 メートル/メートル胚 で観察されている 。核膜崩壊が核の不規則な外観から推測してから形成することができませんでしセル全体に散乱を染色体れます適切な中期板。クロマチンは、前分裂へと細胞が分裂としてdecondenses 2セル間の後期ブリッジを作成します。
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Discussion
この方法を使用すると、1が生体内および時間依存的に二つの新しい細胞を形成するために核エンベロープの崩壊、微小管動原体の添付ファイルによって中期板の形成、及び姉妹染色分の分離を推測することができます。細胞は天然の生理学で撮像されているので、ゼブラフィッシュで有糸分裂を観察する能力は、固定サンプル、細胞培養系に比べて有利であり、組織は、使用する蛍光タンパク質を可能にする透明であり、それらが比較的速く開発し、タイムラプスイメージング取得することができます。このプロトコルのための大人のゼブラフィッシュの使用は、皮膚や目ではない厚い組織のために取得することができる限られたZ-深さに制限されています。 H2A.F / Z-EGFPおよびmCherryを-CAAXを発現するトランスジェニック動物は、同じ目的のために使用することができるが、異なる変異体ゼブラフィッシュへのmRNAの注入の汎用性と使いやすさは、遺伝的交雑よりも有利です。有糸分裂の分析である状況で3日後に受精（DPF）以降の胚に必要な、トランスジェニック動物が原因で、この急速に発展する生物におけるRNAの半減期に必要であろう。
有糸分裂を可視化するための他の蛍光タンパク質は、このプロトコルに適しています。例えば、H2B-GFPのmRNAは、クロマチンのためH2A.F / Z-EGFPの代替であり、同様のラベル付けを提供します。この手法で使用することができる他の蛍光標識タンパク質は、それぞれ、核膜、中心小体、プラス端微小管、動原体、および微小管のライブで、胚イメージングを可能にするであろうPOM121、centrin、Eb1と、Hec1、およびEMTBを含みます32,47-51。
このプロトコルは、品質の結果を達成するために実行しなければならないいくつかの重要なイメージング手順があります：1）できるだけ明るい蛍光と全く毒性を得たmRNAの品質と濃度を最適化することを確認します。より多くの蛍光が少ないレーザー露光、したがって、より少ないphotobleaにつながりますチンと光毒性。 2）胚は完全に麻酔し、寒天で安全でなければなりません。マイナーな動きは、結果を変更し、実験を台無しにする可能性があります。 3）寒天濃度は、画像化されることが望ましい胚の段階に適切でなければなりません。 24 HPFで、さらに、1％低融点アガロースが好適です。イメージング12 HPF時またはそれ以前の場合は、0.3％アガロース溶液は39を使用する必要があります。 4）胚におけるROIはできるだけカバーガラスの近くに配置してください。このステップは、尾を画像化するために、1つを制限するものではありません。眼、皮膚、背部、卵黄、およびフィン倍は、このプロトコルを使用することができ、他の分野の例です。
時間は、イメージング、固定胚または組織からこのプロトコルを分ける定義する要因です。 Zスタック、Z-間隔、タイムラプス間隔、タイムラプス継続時間を設定するとき、心の中で実験（ 図1C）のコンテキストを維持することが重要です。野生型の細胞分裂は、通常24 HPFで約25分続きます。目でインスタンスは二時間、2分の時間間隔で、Zスタック内の組織の40μmとし、カバー2ミクロンのZ間隔が有効であることが証明されています。また、不良品有糸分裂と胚において、有糸分裂停止中の細胞は最も可能性の高い大幅に細胞分裂の回数を増やす、存在するであろう。複数の完全な部門を取得するために、持続時間は2時間から4時間に、 すなわち 、増加させるべきです。より長い取得時間は、複数のレーザパワーに試料を露出し、光退色および光毒性の危険性を増加させます。この場合、各Zスタックの間の時間間隔を増加させるべきです。動的染色体の動きは、Zスタックの間の時間間隔を増加させることによって屠殺するが、持続時間が得られます。 2時間にわたって続く可能性が細胞分裂を撮像する際に必要です。
それは直接議論されなかったが、このプロトコルは、より正確に個々の染色体のMOを視覚化するために、Z平面内で高解像度の画像を得るために最適化することができますvements。例えば、 図4A二つmissegregated染色体が観察されます。 （太い矢印で示される）右に染色体が最初に明るく、ピントが合っているが、最後の数フレームに暗くなり。 2ミクロンのZ-間隔で、uncongressed染色体はZ-インターバルの間に落ちます。微小な動きをキャプチャし、単一の染色体イベントは、Z平面の解像度を増加させることによって達成することができます。これを行うには、A1スキャン領域のツールを使用して、個々のセルにズームイン。 Z-スタックパラメータを設定する場合、小さいZ-間隔距離を使用しています。 1ミクロン - 推奨範囲は0.5です。また、各Zスタックの間の時間間隔を減少させるには、2つの分から30秒まで、 すなわち 、各時間フレームの間に滑らかな遷移を作成する- 1分。イメージングのこのタイプの一つの注意点を達成することができる限られたZ深さです。より小さなZ間隔および時間間隔に、多くの組織は、より短い時間枠内でレーザーに曝されます。この、SMを克服するためにAllerの時間期間を使用することができます。しかし、これはまた、研究者が部門をキャプチャしたいと思いますどのくらいの時間に依存しています。
これらの修正に役立つかもしれアナロジーはアコーディオンのようにZスタックを考えることです。ベローズの各プリーツの間の距離はZ間隔であり、Z深度はアコーディオンの長さで表されます。 1は、試料に任意のより多くのレーザー露光を計上するのは嫌だ事例では、アコーディオンストレッチ（Z-深さを増加させる）ように、ベローズ（Z-間隔）のプリーツの間の距離も同様に増加しなければなりません。逆アコーディオン契約などの点で真である、Z-深さが減少します。ベローズ契約のプリーツだけでなく、Z-間隔の減少に対応します。この類似性は、固定された、ライブのサンプルに適用することができます。時間式に追加されたときの複雑さは、このプロトコルで増加します。アコーディオン拡張またはアコーディオンを契約することができ有限の時間があります。このrepresen時間間隔Ts。より距離（Z深度）をカバーするために、時間間隔が増加しなければなりません。同様に、より多くの音楽を聞くために、1は、より多くの細胞分裂を目撃するためには、持続時間が増加しなければならない、このプロトコルの観点では、時間の長い量（持続時間）をリッスンする必要があります。心に留めておくべき配合要因は、再生されるより多くの音楽、より疲れアコーディオン。これは最終寸法、蛍光に類似しています。サンプルが与えられているより多くのレーザー露光は、より多くの光退色や光毒性（疲労）が問題となります。
要約すると、このプロトコルは、異なる分析に適用ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂を可視化する方法を詳述します。 1）分割数2）分割時間3）分割運命と4）高解像度のクロマチンダイナミクス。微小管動原体の添付ファイルから中心小体のダイナミクスまでの有糸分裂のコンポーネントを可視化するための複数の可能性を適用することができます。の機能を組み合わせることゼブラフィッシュにおけるゲノム編集の最近の進歩とin vivoでのイメージング有糸分裂は、簡単脊椎動物25,26,52-56にヒト疾患をモデル化するために、有糸分裂のさまざまな側面での変異体を生成するようになります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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