Abstract
La mitose est critique pour la croissance de organismal et la différenciation. Le processus est très dynamique et nécessite ordonné des événements pour accomplir la condensation appropriée de la chromatine, l'attachement des microtubules-kinétochore, la ségrégation des chromosomes, et la cytokinèse dans un petit cadre de temps. Des erreurs dans le délicat processus peut entraîner des maladies humaines, y compris des malformations congénitales et le cancer. Les approches traditionnelles de l'enquête états pathologiques mitotique humains reposent souvent sur des systèmes de culture cellulaire, qui manquent de la physiologie naturelle et contexte de développement / tissu-spécifique avantageux lors de l'étude des maladies humaines. Ce protocole permet de surmonter de nombreux obstacles en fournissant un moyen de visualiser, avec une haute résolution, la dynamique des chromosomes dans un système de vertébrés, le poisson zèbre. Ce protocole détaille une approche qui peut être utilisée pour obtenir des images dynamiques de cellules en division, qui comprennent: la transcription in vitro, l' élevage du poisson zèbre / collecte, embryon plongement et imagerie time-lapse. Optimisation et modifications de ce protocole sont également explorées. Utilisation de H2A.F / Z-EGFP (étiquettes chromatine) et mCherry-CAAX (de la membrane cellulaire des étiquettes) des embryons d'ARNm-injecté, mitose dans de type sauvage AB, auroraB hi1045 et hi2865 de esco2 zebrafish mutant est visualisé. Imagerie haute résolution en direct chez le poisson zèbre permet d'observer plusieurs mitoses à quantifier statistiquement défauts mitotiques et le timing de la progression mitotique. En outre, l' observation des aspects qualitatifs qui définissent les processus inappropriés mitotiques ( par exemple, des défauts de congression, de chromosomes mauvaise ségrégation, etc.) et les résultats chromosomiques incorrecte (ie, aneuploïdie, polyploïdie, micronoyaux, etc.) sont respectées. Cet essai peut être appliqué à l'observation de la différenciation tissulaire / développement et se prête à l'utilisation du poisson zèbre mutant et agents pharmacologiques. Visualisation de la façon dont les défauts en mitose conduisent à des troubles du cancer et de développement sera grandementaméliorer la compréhension de la pathogenèse de la maladie.
Introduction
La mitose est un processus essentiel du cellulaire critique pour la croissance, la différenciation et la régénération dans un organisme vivant. Lors de la préparation précise et la réplication de l'ADN en interphase, la cellule est amorcée à se diviser. La première phase de la mitose, la prophase, est initiée par l'activation de la cycline B / Cdk1. Prophase est caractérisé par la condensation de la matière de la chromatine dans les chromosomes. répartition de l'enveloppe nucléaire se produit à la transition entre prophase et prométaphase. Dans prométaphase, centrosomes, le centre de nucléation pour la formation du fuseau, commencent à migrer vers les pôles opposés tout en étendant microtubules à la recherche de l'attachement kinétochore. Lors de la fixation, les conversions pour mettre fin sur l' attachement des microtubules et des forces de tension orientent les chromosomes formant une plaque de métaphase 1. Si tous les chromosomes sont correctement fixés, le point de contrôle de l'ensemble de la broche est satisfaite, les anneaux de cohésine tenant les chromatides sœurs ensemble sont clivés et microtubules raccourcir pour tirer soeurchromatides à des pôles opposés pendant anaphase 2,3. La phase finale, télophase, implique un allongement de la cellule et de la réforme de l'enveloppe nucléaire autour des deux nouveaux noyaux. Cytokinèse achève le processus de division en séparant le cytoplasme des deux nouvelles cellules filles 4-6. Altération des principales voies mitose (c. -à- broche ensemble checkpoint, duplication centrosome, soeur chromatides cohésion, etc.) Peut entraîner la métaphase arrestation, de chromosomes mauvaise ségrégation, et de l' instabilité génomique 7-10. En fin de compte, les défauts dans les voies de la mitose contrôle peuvent provoquer des troubles du développement et cancer, nécessitant la visualisation de la mitose et ses défauts dans un vertébré, organisme multicellulaire en direct 10-16.
embryons de poisson zèbre servent comme un grand organisme modèle pour l'imagerie en direct en raison du tissu transparent, la facilité de microinjection, et le développement rapide. En utilisant zebrafish, l'objectif global de ce manuscrit est dedécrivent un procédé de 5D en temps réel (dimensions X, Y, Z, du temps et de longueur d' onde) d' imagerie de la mitose 17 (figure 1C). L'utilisation de zebrafish mutant défectueux dans différentes voies mitose démontrer la conséquence de tels défauts. Pour ce protocole, les mutants Aurora B et Esco2 ont été choisis pour illustrer ces défauts. Aurora B est une kinase qui fait partie du complexe chromosome de passagers (CPC) impliqués dans la formation du fuseau et de l'attachement des microtubules. Il est également nécessaire pour la formation de clivage de sillon dans cytokinesis 18,19. Chez le poisson zèbre, un déficit Aurora B conduit à des défauts dans l' induction sillon, cytocinèse, et la ségrégation des chromosomes 20. Esco2, d'autre part, est une acétyltransférase qui est essentiel pour la cohésion des chromatides sœurs 21,22. Il acétyle cohesin sur la partie SMC3 de l'anneau stabilisant ainsi cohesin pour assurer la séparation des chromosomes lors de la transition métaphase-anaphase 23. Perte de Esco2 chez le poisson zèbre conduit à chromosome mauvaise ségrégation, prématurée des chromatides sœurs séparation, l' instabilité génomique, et p53-dépendante et l' apoptose indépendante 24,25. En raison de la disponibilité, auroraB hi1045 et hi2865 de esco2 zebrafish mutant (ci - après dénommé aurB m / m et esco2 m / m, respectivement) sera utilisé pour illustrer cette technique 25-27.
Couplage microscopie confocale à fluorescence machinerie cellulaire étiquetée a permis aux chercheurs de visualiser la chromatine et la membrane cellulaire lors de la mitose dynamique 25,28,29. histones fluorescents marqués ont été historiquement utilisé pour visualiser la chromatine. Les histones sont des protéines nucléaires composées de quatre paires différentes (H2A, H2B, H3 et H4) qui sont responsables de la structure des nucléosomes qui compose les chromosomes 30. Alors que H2B est sans doute le histone le plus utilisé pour des protéines fluorescentes dansla souris et de la culture cellulaire, l' utilisation de Histone 2A, Z de famille (H2A.F / Z) a bien prouvé pour une utilisation dans zebrafish 31,32. Concanavaline A et la caséine kinase 1-gamma par exemple, à localiser la membrane cellulaire et ont été précédemment montré efficace pour la visualisation de la membrane cellulaire dans les oursins et 33,34 drosophile. D' autres études ont montré que la protéine fluorescente CAAX étiquetée étiquettes de la membrane cellulaire et a réussi à 31 zebrafish. CAAX est un motif qui est reconnu par les enzymes de modification post-traductionnelles telles que farnesyltransferases et geranylgeranyltransferases. Modifications par ces enzymes provoquent des protéines à devenir associées à la membrane, ainsi le marquage de la membrane cellulaire 35.
En raison de l'utilisation préalable zebrafish, ce protocole a choisi d'utiliser H2A.F / Z et CAAX pour marquer la chromatine et la membrane cellulaire. L'application de cette méthode permettra au chercheur de surveiller la mitose au niveau de la cellule individuelle pour observer le chromosome individueldynamique, comme le suivi ainsi que simultanément plusieurs divisions cellulaires qui peuvent influer sur la différenciation et le développement des tissus. Cet article se concentrera sur l'imagerie de la dynamique de la ségrégation des chromosomes lors de la mitose au niveau de la cellule individuelle. Dans ce manuscrit, la capacité d'observer plusieurs divisions mitotiques, calculer le temps de division, et de déchiffrer les phénotypes mitotiques sera illustrée et discutée. En utilisant ces paramètres, physiologiquement les données pertinentes peuvent être collectées et appliquées à plusieurs états pathologiques affectés par des défauts mitotiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transcription in vitro
- Linéariser pCS2-H2A.F / Z-EGFP et / ou vecteurs pCS2-mCherry-CAAX par restriction Notl enzyme digérer 31. L' utilisation d' un ARN dans le kit de transcription in vitro, de générer des produits 5 'd'ARNm coiffés à partir de chaque modèle, selon le protocole du fabricant.
- Purifier l'ARNm coiffés en utilisant un kit de purification. Suivez les instructions du fabricant. Eluer avec RNase-H 2 O.
- Déterminer la concentration d'ARN par absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. (DO 260 x dilution x 40 ug / ml).
- Diluer l'ARN à 100 ng / pl pour chaque H H2A.F / Z-EGFP et mCherry-CAAX avec RNase 2 O. Si la concentration en ARN est trop faible, la fluorescence sera diminuée ou absente. échantillons Brighter diminuera les inquiétudes sur phototoxicité et photoblanchiment. D'autre part, trop d'ARN peuvent être toxiques et / ou provoquer des effets hors cible.
Remarque: Conservez le resteARNm purifié à -80 ° C congélateur.
2. Elevage Zebrafish, Embryon Collection, et l' ARNm Injection 36-38
- Assembler bassins d'élevage avec une barrière pour séparer le réservoir en deux régions et remplir chaque réservoir d'élevage avec de l'eau du système d'aquaculture utilisé dans l'établissement zebrafish.
- Afin d'éviter la reproduction prématurée, placer deux poissons mâles d'un côté de la barrière et deux poissons femelles de l'autre côté de la nuit avant la reproduction.
- Le lendemain, décongeler le mélange d'ARNm préparé précédemment sur la glace. Remplacer l'eau dans des réservoirs d'élevage avec de l'eau du système d'aquaculture fraîche et éliminer les obstacles. Immédiatement après les barrières sont tirés, réchauffer un moule d'injection à 28,5 ° C et mettre en place l'équipement pour la microinjection.
Note: Pour plus d' informations sur les moules d'injection, s'il vous plaît se référer à Gerlach 36. - Collecter les œufs tous les 10 - 15 min en utilisant une passoire à thé et rincer les œufs dans un 100 x 15 mm plat propre Petri avec E3 Bleu (5 mM de NaCl, KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% bleu de méthylène). E3 bleu est utilisé pour empêcher la croissance fongique et d'assurer le bon développement des larves de poissons. Pour plus d' informations sur l' accouplement et la collecte d'embryons, voir Gerlach 36 et Porazinkski 37.
- Intégrer une cellule mise en scène d' embryons dans un moule d'injection chauffé et injecter de l'ARN dans le jaune d' oeuf dans la quantité souhaitée d'embryons (figure 1A). Compte pour la mort embryonnaire naturelle et d'embryons non fécondés en effectuant des injections embryonnaires sur 15% plus d'embryons que nécessaire pour l'expérience. Pour plus de détails sur microinjection d'embryons de poisson zèbre, s'il vous plaît se référer à Gerlach 36 et Porazinkski 37.
NOTE: Pour la première utilisation de l'ARNm, effectuer une analyse dose-courbe pour déterminer la dose optimale pour la fluorescence et la viabilité (définie comme l'absence de défauts de développement bruts jusqu'à 5 dpf) avant d'effectuer l'imagerie 5D. 150-200 ng / ulinjecté dans des embryons est souvent la concentration optimale, il est donc un bon point de départ pour la concentration finale. - extraire soigneusement les embryons injectés du moule à l'aide d'un 9 "pipette Pasteur en verre modifiée. Pour modifier la pipette, faire fondre l'extrémité à l'aide d'un brûleur Bunsen jusqu'à ce qu'elle forme une boule.
- Placez embryons injectés dans une boîte de Pétri de 100 x 15 mm à l'E3 Bleu et la maison dans un incubateur à 28,5 °.
- Six heures après l'injection, enlever les embryons morts ou non fécondés des plaques et ajouter propre E3 Bleu. Maison des embryons à 28,5 ° C.
3. Préparation et incorporation de Live Zebrafish Embryons Imaging (figure 1B)
- Deux heures avant l'imagerie, dépister les embryons injectés pour la GFP en utilisant un microscope à dissection fluorescent. Placer les embryons exprimant la GFP vert vif dans une nouvelle boîte de 100 mm x 15 Petri avec E3 Bleu.
- Faire bouillir une solution stock de 1% d'agarose à faible fusion en ajoutant 1 g de bas point de fusion d'agarose à 100 ml d'E3 Bleu. Après avoir utilisé l'agarose, couvrir le ballon avec une feuille d'aluminium. La solution mère reste utile pour jusqu'à un mois.
- Aliquote de 3 ml de la gélose fondue dans un tube de culture de 17 x 100 mm. Gardez au chaud agarose en plaçant le tube de culture dans un bain d'eau C 42 ° jusqu'à utilisation. Préparer une solution à 15 mM Tricaine dans de l' eau déminéralisée pour anesthésier les embryons de poisson zèbre 36.
REMARQUE: si l' imagerie aux points de temps antérieurs est désiré, la concentration d'agar - agar peut être diminuée aussi faible que 0,3% 39. - Amener le mM Tricaine 15, les embryons dépistés, agarose à faible fusion, E3 Bleu, et une lamelle de verre culture sur le fond plat de 35 mm pour un microscope optique de dissection. Retirez délicatement le chorion de l'embryon avec # 5 pinces. Pour ce faire, trois embryons.
- Placer les embryons dechorionated dans un récipient séparé pour être anesthésiés. Le couvercle de la cuvette du fond de lamelle couvre-objet est souvent utilisé à cette fin. En utilisant une pipette de transfert, ajouter trois gouttes (environ 150 pi)mM Tricaine 15 à l'antenne de 5 ml E3 bleu (si en utilisant le couvercle de la boîte de fond de lamelle) ou jusqu'à ce que les embryons ont été suffisamment anesthésiés. En outre, d'ajouter 3-4 gouttes (environ 150-200 pi) d'une solution 15 mM Tricaine au tube d'agarose fondu à 1%.
- En utilisant une pipette P200 avec 1 cm de la pointe de la pipette coupée; transférer les embryons anesthésiés à l'antenne de la lamelle à fond. Retirez tout excès E3 bleu: solution Tricaine.
- Ajouter lentement 5 - 10 pi d'agarose à faible fusion: solution Tricaine sur les embryons, en gardant chaque goutte séparée pour assurer les embryons ne dérivent pas accidentellement près de l'autre.
Attention: Si l'agarose est trop chaud, il va endommager l'embryon. Une bonne température pour maintenir la gélose à 42 ° C est. - En utilisant une aiguille 21 G 1 ½, orienter doucement l'embryon dans l'agarose à la position désirée. Lors de l'utilisation d'un microscope inversé pour l'imagerie time-lapse, orienter la région d'intérêt (ROI) aussi proche de la lamelle comme possible.
Remarque: Pour des fins générales, la région de queue offre une facilité d'orientation et de clarté en raison du tissu relativement mince (figure 1A). D' autres tissus, comme la couche épithéliale entourant le jaune d' oeuf et des plis d' ailettes, peuvent être utilisées 28,29. Ces tissus offrent une grande clarté, mais ces régions ne sont que quelques couches de cellules d'épaisseur. Aux fins de ce protocole, il est bénéfique pour l'image de la région de la queue pour acquérir autant de divisions cellulaires que possible. - Attendez quelques minutes pour la solidification partielle de l'agar-agar. Utilisez l'aiguille pour briser un petit morceau de gélose pour tester sa solidification. Quand un morceau de gélose peut être arrachée de la goutte, passez à l'étape suivante.
- Couvrir l'ensemble lamelle avec de l'agar bas point de fusion formant un dôme sur les embryons embarqués. Laisser la gélose se solidifier avant de déplacer le plat pour l' imagerie confocale (figure 1A).
- Au cours du processus de solidification de la gélose (il faut environ 10 minutes), préparer 3 ml de of E3 solution bleue avec cinq gouttes (environ 250 pi) à 15 mM Tricaine être placé sur les embryons incorporés lors de l'imagerie.
4. 5D imagerie confocale de Live Zebrafish Embryons 40,41
NOTE: Voir Ariga 40 et O'Brien 41 pour plus de détails sur la façon d'effectuer l' imagerie 5D en utilisant d' autres systèmes confocaux. Pour Z-intervalle, Z-stack, Z-profondeur, intervalle de temps, et les définitions 5D voir la figure 1C.
- Ouvrez le logiciel d'imagerie et régler le microscope à 60x NA 1.4 objectif. Appliquer de l'huile d'immersion à l'objectif et placer la boîte de culture dans le porte-lame sur la platine du microscope. L'utilisation du contrôleur d'axe, l'embryon centre d'intérêt au-dessus de la lentille d'objectif et amener la lentille d'objectif vers le haut pour atteindre la boîte de culture.
- Cliquez sur l'icône de l'oculaire et de passer au filtre de la GFP sur le microscope. Focus sur le ROI. En se concentrant sur le tissu le plus proche de la lamelle sera offer les meilleurs résultats d'imagerie.
- Retirez le verrouillage. Sélectionnez les canaux GFP et mCherry (préétablies longueurs d'onde dans le logiciel) et définir la ligne option normale moyenne.
- Utilisez "Controls Voir / Acquisition / Zone de numérisation A1" commande pour ouvrir l'outil A1 Zone de numérisation.
- Commencez la numérisation. À l'aide de l'axe de commande, placer l'embryon de telle sorte que la zone de balayage est rempli avec autant de poisson-zèbre que possible. La puissance du laser n'a pas besoin d'être optimale à ce stade. Abaisser la puissance du laser pour éviter photoblanchiment inutile.
- Utilisez les «Contrôles Voir / Acquisition / acquisition ND" commande pour ouvrir le panneau de commande d'acquisition ND.
- Commencez le balayage pour définir les paramètres Z-stack. Réglez la limite supérieure Z-pile à l'endroit où les cellules ne sont pas au point et limite inférieure à l'endroit où les cellules ne sont plus visibles. Prévoir un espace de 3 pm au-dessus de l'échantillon pour la croissance et le mouvement des cellules, ce qui peut se développer dans le domaine de l'imagerie. Le Z-pile pour les chiffres présentés dans ce protocol couvrait une Z-profondeur de 40 um dans la queue de l'embryon.
- Définissez la taille de l'étape Z-intervalle à 2 pm. En moyenne, une cellule est de 10 um de diamètre; donc 2 um produira cinq intervalles de données d'imagerie à analyser pour chaque cellule.
REMARQUE: La profondeur de l'image pouvant être acquise dépend de l'intervalle Z. résolution Z est sacrifié à gagner en profondeur globale dans la dimension Z pour l'image autant de cellules en mitose que possible (grande profondeur Z). L'inverse est vrai dans la mesure où, en diminuant la taille de l'étape, la résolution Z est acquise, alors que la profondeur Z est sacrifiée (petite profondeur Z). - Réglez la puissance image laser, HV, et le décalage des niveaux. Pour les expériences ont démontré dans ce protocole, utiliser la puissance du laser suivant, HV, et le décalage des niveaux fixés aux niveaux correspondants, respectivement, pour le canal de la GFP; 2-5, 120-140, et de -9 à -11. Pour le canal mCherry, utiliser la puissance du laser suivant, HV, et le décalage des niveaux, respectivement; 3 - 6, 120-140 et -3-8. Une fois que les paramètres sont réglés, arrêtez le balayage pour éviter l'exposition au laser inutiles qui peuvent causer des phototoxicité et photoblanchiment de l'échantillon.
- Sélectionnez l'icône de la moyenne 2x ligne. "Aucune moyenne" produit une image granuleuse en "ligne de 4x en moyenne" augmente considérablement le temps de balayage. L'utilisation de 2x la ligne moyenne fournit la meilleure qualité d'image et le temps le plus rapide de balayage.
- Sélectionnez la durée appropriée de l'intervalle et le temps temps nécessaire pour l'expérience. Pour les divisions de type sauvage, des intervalles de temps de deux minutes pendant 2 heures est le meilleur pour la détermination de la durée mitotique (utilisé dans les figures 1, 2, 3A et 3B). Divisions qui activent le point de contrôle de l' ensemble de la broche pendant plus de 30 min sont plus appropriés pour des intervalles de cinq minutes pour quatre heures afin de préserver la fluorescence comme le montre la figure 3C.
- Cochez la case "enregistrer le fichier" et nommez le fichier pour enregistrer automatiquement le fichier tel qu'il est en cours d'acquisition. Double contrôle tous les paramètres sont réglées correctement et appuyez sur "démarrer run".
- Après l'acquisition est terminée, pour afficher le fichier dans un format en trois dimensions, cliquez sur l'icône du seuil de volume.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 2 montre la capacité d'observer de nombreuses divisions cellulaires en utilisant une large vue d'un AB de type sauvage queue de poisson zèbre champ. Plus de sept cellules en mitose sont imagés dans un laps de temps de 14 min (Movie 1). Dans les deux heures de temps bien sûr, plus de 40 événements mitotiques ont été capturés. En moyenne, 50 cellules en division ont été observées dans l'AB et 30 cellules qui se divisent en aur B m / m embryons (Figure 2B). Pour tenir compte du nombre de cellules imagées, le rapport des cellules en mitose au nombre de cellules a été calculé imagées (figure 2C). Ces données suggèrent qu'il n'y a pas un nombre inférieur de cellules en passant par la mitose dans les aur B m / m embryons (Figure 2B) mais moins grand nombre de cellules étant imagée. La capacité d'acquérir un nombre statistiquement significatif d'événements comme celui-ci contribuera à la puissance statistique.
Figure 3 développe cette technique pour inclure la quantification durée mitotique. Une fois qu'une session time-lapse est acquise, une cellule individuelle peut être analysé pour le temps passé dans la mitose avec une résolution adéquate en utilisant l'outil de zoom (figure 3A, B). durée mitotique est calculé en comptant manuellement le nombre d'intervalles de temps prennent une division cellulaire. Le nombre d'intervalles de temps est ensuite multiplié par l'intervalle de temps entre chaque Z-stack. Par exemple, dans la figure 3C, la division a pris 12 intervalles de temps et l'intervalle de temps entre chaque Z pile était de 2 min. Par conséquent, le temps de division pour cette cellule était de 24 min. L'AB temps moyen de type sauvage division est de 25 min et 58 min pour aurB m / m (figure 3B). Un temps de division prolongée comme on le voit dans le aurB m / m suggère que le point de contrôle de l' ensemble de la broche n'a pas été satisfaite en raison de kine erronéeles pièces jointes tochore 1,2. Regardons de plus près au zoom dans des embryons de type sauvage, chaque phase mitotique peut être distingué (figure 3C, Movie 2). En outre, les défauts mitotiques peuvent être observés dans le aurB m / m embryon qui comprennent un arrêt mitotique et échoué cytokinesis résultant dans une cellule binucléées et formation subséquente d'un micronoyau (Figure 3D, Film 3). Ce zoom dans l' analyse présentant des défauts mitotiques soutient l'augmentation du temps de division acquise dans la figure 3B.
Divers autres défauts mitotiques diverse et le destin des cellules qui peuvent être rencontrés sont explorés à la figure 4; démontré dans le esco2 + / m et esco2 m / m embryons. Dans un esco2 + / m d' embryons, les mouvements de chromosomes erronés sont saisis et peuvent être définis comme des défauts de congressions. défauts de congression se produisent lorsque les pièces jointes des microtubules inappropriées sont faites. Ces défauts provoquent l'échec des chromosomes à migrer vers la plaque de métaphase. chromatides sœurs appariées, en particulier identifiables au min 20 et 46, qui ne sont pas congressed vers la plaque de métaphase peuvent être observés pour la première au min 14. Anaphase apparition sépare les chromatides sœurs alignés sur la plaque de métaphase, ainsi que les chromatides sœurs appariées à droite, observé à la minute 50. en outre, la formation de micronoyaux possible est observé que ces chromatides sœurs séparés restent isolés en dehors du noyau (T = 50, la figure 4A, Film 4). Sur la figure 4B, une division multi-polaire est visualisé (Film 5). Divisions multi-polaires se produisent souvent en raison de l' amplification centrosome, mais peuvent se produire par d' autres moyens 42. Dans la figure 4C, un esco2 m / m cellulaire démontre d' abord soeur prématurée chromatides separation et de la broche de rotation 9,43,44. Un autre destin cellulaire démontré dans ce panneau est un pont anaphase dans lequel les pièces jointes ne sont pas résolus merotelic 45,46. Le pont anaphase peut être vu d'abord à la minute 62. La chromatine semble prématurément decondense tandis que la cellule est en cours de cytokinèse. Comme cytocinèse se produit, le sillon de clivage empiète sur les chromosomes décondensée et, comme abscission se produit, tire le matériau de la chromatine pour former un pont anaphase (figure 4C, Film 6). Bien que non représenté ici, afin de quantifier les destins cellulaires, enregistrer toutes les divisions mitotiques dans chaque trame et le type de destin des cellules qu'ils présentent. Diviser le nombre de cellules dans chaque sort par le nombre total de divisions enregistrées et multiplier par 100 pour calculer le pourcentage du destin cellulaire.
Figure 1: Protocole Dessins Outline. (UNE) (B) Schéma du processus d'intégration embryon. Les embryons injectés doivent être dechorionated et anesthésiés. Les embryons sont ensuite transférés dans le plat de lamelle-fond et l'excès E3 Bleu est retiré. agar bas à l'état fondu est utilisé pour créer des dômes séparés couvrant chaque embryon. Orientez les embryons de sorte que la queue est plus proche de la lamelle. Attendez deux minutes avant d'ajouter l'agar couvrant l'ensemble lamelle. Attendez jusqu'à ce que l'agar - agar est solidifié avant de passer à l' image. (C) Schéma de définir les termes Z-intervalle, Z-stack, Z-profondeur, intervalle de temps, la durée de temps et 5D qui sont utilisés dans le protocole et la discussion. Z intervalle est défini comme étant la distance entre chaque image de microscope se déplace profondément dans l'échantillon pour créer une pile en Z. Z pile est l'ensemble des images prises par unéchantillon au Z-intervalle défini. La distance parcourue dans un Z-stack définit la profondeur Z. L'intervalle de temps est la quantité de temps entre un Z-stack et la prochaine Z-stack pour créer une image time-lapse. durée Le temps est la quantité totale de temps utilisé pour l'image. 5D est défini comme étant les dimensions X, Y, Z, le temps et l' émission de fluorescence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Time-Lapse Imaging Capture des événements mitotiques multiples dans un embryon de poisson zèbre Live. (A) alambics Time-lapse d'une expérience dans un zoom arrière de type sauvage AB, 24 HPF zebrafish montrant plusieurs événements mitotiques. Les astérisques pointent vers sept cellules en mitose. t = temps écoulé en min. Barre d'échelle = 5 um. (B) Le nombre de CE mitotiquells observées dans AB et aurB m / m queue de poisson zèbre à 24 HPF. Moyenne ± st. dev., n = 3 embryons / génotype. (C) Le rapport des cellules en mitose par le nombre total de cellules dans AB et aurB m / m queue de poisson zèbre à 24 HPF. Moyenne ± st. dev., n = 3 embryons / génotype. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Cellule individuelle Analyse Captures Chaque phase mitotique et mitotique Durée. (A) Une cellule sélectionnée de la vue large de type sauvage AB champ, 24 HPF zebrafish embryon représenté sur la figure 2A. (B) Le temps de la division est observée pour AB et aurB m / m cellules et calculée à partir de inférer enveloppe nucléaire repakdown (ONÉ) lors de la première observation de la chromatine condensée dans une cellule à la formation de deux nouvelles cellules filles. n = 3 embryons / génotype, n = 66 divisions pour AB, n = 29 divisions pour aurB m / m, *** p <0,001. (C) AB cellule de type sauvage est recadrée pour visualiser la progression de la phase à travers la mitose . t = min. Barre d'échelle = 5 um. (D) aurB m / m cellulaire est recadrée pour visualiser la progression mitotique par mitose qui comprend un arrêt mitotique entraînant une défaillance de la cytocinèse et la formation de micronoyaux. Les flèches pointent vers le micronoyaux. t = temps écoulé en min. Barre d' échelle = 5 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 4.Simple d' imagerie cellulaire en direct Capture Défauts mitotiques multiples associés à Chromosome Division Ségrégation et mitotique Mutant Zebrafish. (A) l' image d'une cellule subissant des défauts de congression dans un esco2 + / m embryon A recadrée. La flèche mince surveille le chromosome gauche qui est tiré vers l'arrière dans la plaque de métaphase. La flèche épaisse surveille le bon chromosome qui est pas tiré vers l'arrière dans la plaque métaphase et inférée pour former un micronoyau. La double flèche montre la séparation du droit chromosome qui n'a pas le congrès au début de l'anaphase. Insets montrent des vues agrandies des chromosomes qui ont échoué au Congrès. Insets ont été coupées et la luminosité améliorée pour une meilleure visualisation. CAAX fluorescence a été enlevé pour visualiser les chromosomes plus facilement. Barre d'échelle = 5 um. (B) l' image d'une cellule A recadrée subissant un arrêt mitotique qui se traduit par une division multi-polaire dans un esco2 + / M embryon. Barre d'échelle = 5 um. (C) Une image recadrée d'une cellule subissant la cohésion fatigue entraînant la formation de pont anaphase vu par le fil comme tirant entre les deux noyaux relevés par les crochets. Barre d'échelle = 5 um. t = temps écoulé en min. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1. divisions multiples de cellules peuvent être visualisées dans une large vue d'un embryon de poisson zèbre de type sauvage injecté (clic droit pour télécharger).
Film 2. Phases de la mitose peuvent facilement être visualisées dans un embryon de poisson zèbre de type sauvage (r ight cliquez pour télécharger). Répartition de l' enveloppe nucléaire est déduite par l'aspect irrégulier du noyau et se poursuit vers congression des chromatides sœurs pour former une plaque de métaphase . la ségrégation précise se produit et donne deux nouvelles cellules filles.
Film 3. imagerie en direct de aurB m / m embryon révèle chromosome manqueregregation, échoué cytocinèse et la formation de micronoyaux (clic droit pour télécharger). répartition de l' enveloppe nucléaire est déduite par l'aspect irrégulier du noyau, les chromosomes se dispersent vers les pôles opposés incapables de former une plaque de métaphase appropriée, et procéder à une rotation sur l' axe prolongeant la division temps de la cellule. Cytokinèse ne se produit pas pour résultat une cellule de multiples 4N et des micronoyaux.
Film 4. défauts de congression sont observés chez un esco2 + / m embryon (clic droit pour télécharger). Répartition de l' enveloppe nucléaire est déduite par l'aspect irrégulier du noyau. Après que la plaque métaphase est formée, quelques indichromosomes individuels dispersent de chaque côté. Un chromosome individuel vers la gauche est finalement tiré vers l'arrière dans la plaque de métaphase tandis que le chromosome vers la droite reste en dehors de la plaque de métaphase et peut être vu la séparation des chromatides sœurs au début de l'anaphase. La cellule présente un temps de division prolongée mais divise ultimes avec la formation de micronoyaux potentiel.
Film 5. division multi-polaire est observée dans un esco2 + / m embryon (clic droit pour télécharger). Répartition de l' enveloppe nucléaire est déduite par l'aspect irrégulier du noyau, puis les chromosomes fusionnent pour former un indicativ Y-formee des poteaux 3-broche. La cellule présente un temps de division prolongée, mais divise finalement en 3 cellules filles.
Film 6. soeur prématurée séparation des chromatides et la formation de ponts de anaphase sont observés dans un esco2 m / m embryon (clic droit pour télécharger). Répartition de l' enveloppe nucléaire est déduite par l'aspect irrégulier du noyau et les chromosomes se dispersent dans toute la cellule incapable de former un plaque de métaphase appropriée. La chromatine decondenses avant la cytocinèse et que la cellule se divise, crée un pont entre les deux anaphase cellules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L' utilisation de ce procédé permet de déduire une rupture de l' enveloppe nucléaire, la formation d'une plaque métaphase par des attaches microtubules kinétochore, et la ségrégation des chromatides sœurs pour former deux nouvelles cellules in vivo et d'une manière dépendante du temps. La capacité à observer mitose chez le poisson zèbre est avantageuse par rapport à des échantillons fixes et des systèmes de culture cellulaire, car les cellules sont imagées dans la physiologie naturelle, le tissu est transparent ce qui permet des protéines fluorescentes à utiliser, ils développent relativement rapide, et imagerie time-lapse peut être acquise. L'utilisation de poisson zèbre adulte pour ce protocole est limitée en raison de la Z-profondeur limitée qui peut être acquis en raison du tissu plus épais qui ne sont pas la peau ou les yeux. Alors que les animaux transgéniques exprimant H2A.F / Z-EGFP et mCherry-CAAX peuvent être utilisés dans le même but, la souplesse et la facilité de l'injection d'ARNm dans différents poisson zèbre mutant est avantageuse par rapport à des croisements génétiques. Dans les situations où l'analyse mitotique estnécessaire dans trois jours la fécondation post (dpf) ou d'embryons plus tard, les animaux transgéniques seraient nécessaires en raison de la demi-vie de l'ARN dans cet organisme qui se développe rapidement.
D'autres protéines fluorescentes pour visualiser la mitose se prêtent à ce protocole. Par exemple, l'ARNm H2B-GFP est une alternative à H2A.F / Z-EGFP pour la chromatine, et fournit un étiquetage similaire. D'autres protéines fluorescentes marqués qui peuvent être utilisés dans cette technique comprennent POM121, centrine, Eb1, HEC1 et EMTB qui permettrait en direct imagerie embryon des microtubules enveloppe nucléaire, centrioles, plus-gamme, kinétochore et microtubules, respectivement 32,47-51.
Ce protocole comporte plusieurs étapes d'imagerie clés qui doivent être exécutées pour obtenir des résultats de qualité: 1) Assurez-vous d'optimiser la qualité de l'ARNm et de la concentration pour obtenir la plus brillante fluorescence et aucune toxicité possible. Plus fluorescence conduira à une moindre exposition au laser et par conséquent, moins photobleaching et phototoxicité. 2) L'embryon doit être totalement sécurisé anesthésié et dans l'agar. mouvements mineurs vont modifier les résultats et pourraient ruiner l'expérience. 3) La concentration d'agar doit être approprié pour le stade de l'embryon désiré à imager. A 24 HPF et de plus, 1% à faible masse fondue agarose convient. Si l' imagerie à 12 HPF ou plus tôt, une solution d'agarose à 0,3% doit être utilisé 39. 4) Le retour sur investissement dans l'embryon doit être aussi proche que possible de la lamelle. Cette étape ne limite pas l'un à l'imagerie de la queue. Les yeux, la peau, la région dorsale, le jaune, et pliage fin sont des exemples d'autres domaines qui peuvent utiliser ce protocole.
Le temps est le facteur déterminant qui sépare ce protocole d'imagerie fixe embryons ou de tissus. Lors de la mise en place de la Z-stack, Z-intervalle, l' intervalle de temps écoulé, et la durée time-lapse, il est important de garder à l' esprit le contexte de l'expérience (figure 1C). Une division cellulaire de type sauvage dure habituellement environ 25 min à 24 HPF. In thest par exemple, un 2 pm Z-intervalle couvrant 40 um de tissu dans un Z-stack, avec un intervalle de temps de deux minutes pendant deux heures a prouvé son efficacité. En outre, dans les embryons avec la mitose défectueuse, les cellules d'un arrêt de la mitose seront très probablement présents, ce qui augmente considérablement les temps de division cellulaire. Pour acquérir de multiples divisions complètes, la durée doit être augmentée, à savoir, de 2 h à 4 h. Un temps d'acquisition plus exposera l'échantillon à plus de puissance laser et augmenter le risque de photoblanchiment et de phototoxicité. Dans ce cas, l'intervalle de temps entre chaque Z-pile doit être augmentée. mouvements chromosomiques dynamiques seront sacrifiés en augmentant l'intervalle de temps entre les Z-piles, mais la durée de temps est acquise. Cela est nécessaire lors de l'imagerie des divisions cellulaires qui peuvent durer plus de deux heures.
Bien que cela n'a pas été examinée directement, ce protocole peut être optimisé afin d'obtenir une image de résolution supérieure dans le plan Z pour visualiser de façon plus précise des chromosomes individuels movements. Par exemple, sur la figure 4A missegregated deux chromosomes sont observés. Le chromosome à droite (noté par la flèche épaisse) est d'abord clair et la mise au point, mais obscurcit au cours des dernières images. Avec 2 pm Z intervalle, le chromosome uncongressed se situe entre le Z-intervalle. les mouvements minute et capturant les événements singuliers de chromosomes peut être accompli en augmentant la résolution dans le plan Z. Pour ce faire, un zoom sur une cellule individuelle à l'aide de l'outil A1 Zone de numérisation. Lors de la configuration des paramètres de Z-pile, utilisez une distance de Z-plus petit intervalle. Une gamme recommandée est de 0,5 à 1 pm. En outre, en diminuant l'intervalle de temps entre chaque pile Z va créer des transitions plus douces entre chaque trame temporelle, soit de deux minutes et 30 secondes - 1 min. Une mise en garde à ce type d'imagerie est le Z-profondeur limitée qui peut être atteint. En raison de la Z-intervalle et l'intervalle de temps plus petit, plus le tissu est exposé aux lasers dans un laps de temps plus petite. Pour y remédier, smaller durée de temps peut être utilisé; mais cela dépend aussi de combien de temps le chercheur souhaite capturer les divisions.
Une analogie qui peut aider avec ces modifications est de penser à un Z-stack comme un accordéon. La distance entre chaque pli de soufflet est la Z-intervalle et la profondeur Z est représenté par la longueur de l'accordéon. Dans un cas où l'on ne voudrait pas courir toute exposition plus laser à l'échantillon, comme les tronçons d'accordéon (augmente Z-profondeur), la distance entre les plis du soufflet (Z-intervalle) doit augmenter. L'inverse est vrai dans ce que les contrats d'accordéon, les Z-profondeur diminue. Les plis du soufflet se contractent ainsi, ce qui correspond à une diminution de Z-intervalle. Cette analogie peut être appliquée à des échantillons fixes et vivantes. La complexité est accrue dans ce protocole lorsque le temps est ajouté à l'équation. Il y a une quantité finie de temps que l'accordéoniste peut étendre ou contracter l'accordéon. Cette représenct l'intervalle de temps. Afin de couvrir plus de distance (Z-profondeur) l'intervalle de temps doit augmenter. De plus, afin d'entendre plus de musique, il faut écouter pour un montant de plus de temps (durée) En termes de ce protocole, afin d'assister à plusieurs divisions cellulaires, la durée doit augmenter. Un facteur aggravant de garder à l'esprit est que plus la musique qui est jouée, le plus fatigué l'accordéoniste. Ceci est analogue à la dimension finale, la fluorescence. L'exposition plus laser l'échantillon est donnée, plus photoblanchiment et de phototoxicité (fatigue) devient un problème.
En résumé, ce protocole détaille une méthode pour visualiser la mitose dans un embryon de poisson zèbre en direct applicable aux différentes analyses; 1) la division numéro 2) de temps de division 3) la division sort et 4) la dynamique de la chromatine haute résolution. De multiples possibilités pour la visualisation des composants mitose allant de pièces jointes microtubules kinétochore à Centriole dynamiques peuvent être appliquées. La combinaison de la capacité deimagerie mitose in vivo avec les avancées récentes dans l' édition du génome chez le poisson zèbre , il sera facile de générer des mutants dans divers aspects de la mitose pour modéliser les maladies humaines dans un organisme vertébré 25,26,52-56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N.
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A.
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J.
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
