Abstract
Mitose ist entscheidend für organismal Wachstum und Differenzierung. Der Prozess ist sehr dynamisch und erfordert Ereignisse bestellt richtige Chromatin-Kondensation, Mikrotubuli-kinetochore Befestigung, Chromosomensegregation und Zytokinese in einem kleinen Zeitrahmen zu erreichen. Fehler in der heiklen Prozess kann in der menschlichen Krankheit, einschließlich Geburtsschäden und Krebs führen. Traditionelle Ansätze menschlicher Zustände mitotischen Krankheit untersuchen verlassen sich oft auf Zellkultursysteme, die die natürliche Physiologie und Entwicklungs / gewebespezifischen Kontext vorteilhaft fehlt, wenn die menschliche Krankheit zu studieren. Dieses Protokoll überwindet viele Hindernisse, die durch einen Weg, um sichtbar zu machen, mit hoher Auflösung, Chromosomendynamik in einem Wirbeltier-System, das Zebrafisch. Dieses Protokoll wird ausführlich ein Ansatz, der verwendet werden kann , dynamische Bilder von sich teilenden Zellen zu erhalten, die Folgendes umfassen: In - vitro - Transkription, Zebrabärbling Zucht / Sammeln, Embryo Einbettung und Zeitraffer-Bildgebung. Optimierung und modifikationen dieses Protokolls werden ebenfalls untersucht. Mit H2A.F / Z-EGFP (Etiketten Chromatin) und mCherry-CAAX (Etiketten Zellmembran) mRNA-injizierten Embryonen, die Mitose in AB - Wildtyp, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 Mutante Zebrabärbling visualisiert. Hochauflösende Live-Bildgebung in Zebrabärbling ermöglicht eine mehrere Mitosen zu beobachten, statistisch zu mitotischen Defekten und den Zeitpunkt der mitotischen Progression zu quantifizieren. Darüber hinaus Beobachtung der qualitativen Aspekte , die unsachgemäß mitotische Prozesse definieren (dh congression Defekte, missegregation der Chromosomen, etc.) und falsche Chromosomen Ergebnisse (dh Aneuploidie, Polyploidie, Mikronuklei, etc.) beachtet werden . Dieser Assay kann zur Beobachtung der Gewebedifferenzierung / Entwicklung angewendet werden und ist zugänglich für die Verwendung von mutierten Zebrafisch und pharmakologischen Mitteln. Visualisierung, wie Mängel in der Mitose zu Krebs und Entwicklungsstörungen führen wird starkVerständnis der Pathogenese der Krankheit zu verbessern.
Introduction
Mitose ist ein wichtiger zellulärer Prozess essentiell für das Wachstum, Differenzierung und Regeneration in einem lebenden Organismus. Von der genauen Zubereitung und Replikation von DNA in der Interphase, wird die Zelle zu unterteilen grundiert. Die erste Phase der Mitose Prophase, wird durch die Aktivierung von Cyclin B / Cdk1 eingeleitet. Prophase wird durch Kondensation von Chromatin Material in Chromosomen charakterisiert. Kernhülle Schlag erfolgt am Übergang zwischen der Prophase und Prometaphase. In Prometaphase, Zentrosomen, die Keimzentrum für Spindelbildung, beginnen zu entgegengesetzten Polen während Verlängerung Mikrotubuli auf der Suche nach kinetochore Anlage zu migrieren. Nach Befestigung, bis Ende auf Conversions Mikrotubuli Befestigung und Spannungskräfte orientieren die Chromosomen eine Metaphaseplatte 1 bildet. Wenn alle Chromosomen korrekt, wird die Spindelanordnung Kontrollpunkt zufrieden, cohesin Ringe halten die Schwesterchromatiden zusammen gespalten gebunden sind, und Mikrotubuli verkürzen Schwester zu ziehenChromatiden zu entgegengesetzten Polen während der Anaphase 2,3. Die letzte Phase, Telophase beinhaltet Dehnung der Zelle und Rückbildung der Kernhülle um die beiden neuen Kernen. Zytokinese vervollständigt den Teilungsprozess durch das Zytoplasma der beiden neuen Tochterzellen 4-6 trennt. Änderung der Schlüssel mitotischen Wege (dh Spindelanordnung Kontrollpunkt, Zentrosom Vervielfältigung, Schwester-Kohäsion, usw.) Kann in der Metaphase Verhaftung missegregation von Chromosomen führen, und genomische Instabilität 7-10. Letztlich können Defekte in Wege steuern Mitose verursachen Entwicklungsstörungen und Krebs, erfordert die Visualisierung von Mitose und ihre Mängel in einem Live, Wirbel mehrzelligen Organismus 16.10.
Zebrabärbling-Embryonen dienen als große Modellorganismus für die Live-Darstellung aufgrund des transparenten Gewebe, einfache Mikroinjektion und schnelle Entwicklung. Mit Zebrabärbling, ist das übergeordnete Ziel dieses Manuskriptein Verfahren der lebenden 5D (Abmessung X, Y, Z, Zeit und Wellenlänge) Abbilden von Mitose 17 (1C) beschreiben. Die Verwendung von Mutanten Zebrabärbling defekt in verschiedenen mitotischen Bahnen zeigen die Folge solcher Defekte. Für dieses Protokoll, Aurora B und ESCO2 Mutanten wurden diese Mängel zu illustrieren gewählt. Aurora B ist eine Kinase, die ein Teil des Chromosoms Fahrgast Komplex (CPC), die zur Spindelbildung und Mikrotubuli Befestigungs ist. Es ist auch für Spaltungsfurche Bildung in Zytokinese 18,19 erforderlich. In Zebrabärbling führt Aurora - B - Mangel zu Defekten in Furche Induktion, Zytokinese und Chromosomensegregation 20. ESCO2, andererseits ist eine Acetyltransferase, die Schwester - Chromatid - Kohäsions 21,22 wesentlich ist. Es acetyliert cohesin auf dem SMC3 Abschnitt des Rings so cohesin 23 korrekte Chromosomensegregation in der Metaphase-Anaphase Übergang zu gewährleisten stabilisieren. Der Verlust der ESCO2 in Zebrabärbling führt zu chromosome missegregation, vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden, genomische Instabilität und p53-abhängige und unabhängige Apoptose 24,25. Aufgrund der Verfügbarkeit, auroraB hi1045 und ESCO2 hi2865 mutant Zebrabärbling (nachfolgend als Aurb m / m und ESCO2 m / m, jeweils) werden verwendet , um 25-27 um diese Technik zu veranschaulichen.
Die Kopplung der konfokalen Mikroskopie mit Fluoreszenz-markierten Zellmaschinerie hat Forscher aktiviert Chromatin und Zellmembran Dynamik während der Mitose 25,28,29 visualisieren. Fluorescent-markierte Histone haben in der Vergangenheit verwendet wurden Chromatin sichtbar zu machen. Histone sind Kernproteine bestehen aus vier verschiedenen Paaren (H2A, H2B, H3 und H4), die für die Nukleosomenstruktur verantwortlich sind, die 30 Chromosomen komponiert. Während H2B ist wohl das am häufigsten verwendete Histon für fluoreszierende ProteineMaus und Zellkultur, die Verwendung von Histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) ist für den Einsatz in Zebrabärbling 31,32 gut bewährt. Concanavalin A und Casein - Kinase - 1-gamma beispielsweise lokalisiert auf der Zellmembran und haben in Visualisierung der Zellmembran in Seeigeln und drosophila 33,34 vorher wirksam erwiesen. Andere Studien haben gezeigt , dass die CAAX fluoreszierend-markierte Protein bezeichnet die Zellmembran und war erfolgreich in Zebrabärbling 31. CAAX ist ein Motiv, das durch post-translationale Modifikationsenzyme wie Farnesyltransferasen und geranylgeranyltransferases erkannt wird. Änderungen durch diese Enzyme verursachen Proteine membranassoziiertes zu werden, wodurch die Zellmembran Markierung 35.
Aufgrund der Vorbenutzung in Zebrabärbling, wählte dieses Protokoll H2A.F / Z und CAAX zu etikettieren Chromatin und die Zellmembran zu verwenden. Die Anwendung dieser Methode ermöglicht es dem Forscher Mitose auf Einzelzellebene zu überwachen einzelnen Chromosom zu beobachtenDynamik, sowie gleichzeitig mehrere Zellteilungen zu überwachen, die Gewebedifferenzierung und Entwicklung auswirken können. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Abbildung der Dynamik von Chromosomensegregation während der Mitose auf Einzelzellebene. Innerhalb dieses Manuskript, die Fähigkeit, mehrere mitotische Teilungen zu beobachten, Teilungszeit berechnen und die mitotische Phänotypen entziffern wird dargestellt und diskutiert werden. Durch die Verwendung dieser Parameter kann, physiologisch relevanten Daten durch mitotische Mängel betroffen mehrere Krankheitszustände gesammelt und angewendet werden.
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Protocol
1. In Vitro Transcription
- Linearisieren pCS2-H2A.F / Z-EGFP und / oder pCS2-mCherry-CAAX Vektoren durch NotI - Restriktionsenzym 31 verdauen. Unter Verwendung einer RNA in vitro - Transkription - Kit, erzeugen 5 'mRNA mit Cap - Produkte aus jeder Vorlage, nach dem Protokoll des Herstellers.
- Reinige die verkappte mRNA eine Reinigung Kit. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Eluieren mit RNase-freiem H 2 O.
- Bestimmung der RNA-Konzentration durch Absorption bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. (OD 260 x Verdünnung x 40 & mgr; g / ml).
- Verdünnen Sie die RNA zu 100 ng / & mgr; l für jede H2A.F / Z-EGFP und mCherry-CAAX mit RNase-freiem H 2 O. Wenn die RNA-Konzentration zu niedrig ist, wird die Fluoreszenz vermindert oder abwesend sein. Hellere Proben werden die Bedenken hinsichtlich einer Phototoxizität und Photobleaching verringern. Auf der anderen Seite kann zu viel RNA toxisch und / oder verursachen Tor Wirkungen.
Hinweis: Bewahren Sie die restlichengereinigte mRNA in -80 ° C Gefrierschrank.
2. Zebrabärbling Zucht, Besamungs und mRNA Injection 36-38
- Montieren Zuchtbecken mit einer Barriere, den Tank in zwei Bereiche zu trennen und jede Zuchtbecken mit Fischzuchtanlage Wasser zu füllen in der Zebrabärbling-Anlage eingesetzt.
- Um vorzeitige Zucht zu verhindern, legen Sie zwei männliche Fische auf einer Seite der Barriere und zwei weiblichen Fische auf der anderen Seite in der Nacht vor der Zucht.
- Am nächsten Tag, tauen die vorher hergestellten mRNA Mischung auf Eis. Ersetzen Sie das Wasser in Zuchtbecken mit frischem Wasser Aquakultur System und die Hindernisse zu beseitigen. Unmittelbar nachdem die Schranken gezogen werden, erwärmen eine Spritzgießform auf 28,5 ° C und die Ausrüstung für die Mikroinjektion eingerichtet.
Hinweis: Weitere Informationen zu Spritzgießwerkzeugen entnehmen Sie bitte Gerlach 36. - Sammeln Sie alle Eier 10 bis 15 min ein Teesieb mit und spülen Sie die Eier in einen sauberen 100 x 15 mm Petrischale mit E3 Blau (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 mM MgSO 4, 10 -5% Methylenblau). E3 Blau wird verwendet, Pilzwachstum zu verhindern und die richtige Entwicklung von Fischlarven zu gewährleisten. Weitere Informationen über die Paarung und Embryo - Entnahme siehe Gerlach 36 und Porazinkski 37.
- Einbettungs one-Zelle statt Embryonen in einer Spritzgußform erwärmt und die RNA in den Dotter in der gewünschten Menge von Embryos (1A) einzuspritzen. Konto für natürliche Absterben von Embryonen und befruchteten Embryonen, die durch embryonale Injektionen auf 15% mehr Embryonen durchführen als für das Experiment benötigt. Weitere Einzelheiten über die Mikroinjektion von Zebrafischembryonen, finden Sie in Gerlach 36 und Porazinkski 37.
HINWEIS: Bei der ersten Verwendung von mRNA, führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve Analyse die optimale Dosis für die Fluoreszenz und die Lebensfähigkeit (definiert als keine grobe Entwicklungsstörungen bis zu 5 dpf) vor der Durchführung der 5D-Bildgebung zu bestimmen. 150-200 ng / ulInjektion in Embryonen ist oft die optimale Konzentration, daher ist es ein guter Startpunkt für die Endkonzentration ist. - unter Verwendung eines modifizierten 9 "Glas Pasteur Pipette vorsichtig die injizierten Embryonen aus der Form zu extrahieren. Die Pipette zu ändern, schmelzen das Ende einen Bunsenbrenner, bis er eine Kugel bildet.
- Legen Sie injizierten Embryonen in einer 100 x 15 mm Petrischale in der E3-Blau und Haus in einem 28,5 ° C Inkubator.
- Sechs Stunden nach der Injektion, entfernen Sie alle tot oder unbefruchtete Embryonen aus den Platten und fügen Sie auch saubere E3 Blau. Haus die Embryonen bei 28,5 ° C.
3. Herstellung und Einbettung von Live-Zebrafischembryonen für Imaging (Abbildung 1B)
- Zwei Stunden vor der Bildgebung, Bildschirm die injizierten Embryonen für die GFP ein fluoreszierendes Binokular mit. Legen Sie hellgrünes GFP-exprimierenden Embryonen in einem neuen 100 x 15 mm Petrischale mit E3-Blau.
- Kochen Sie eine Stammlösung von 1% niedriger Schmelz Agarose durch Zugabe von 1 g niedrigschmelzende Agarose zu 100 ml E3 Blau. Nach der Verwendung des Agarose, decken den Kolben, der mit Aluminiumfolie. Die Stammlösung bleibt für bis zu einem Monat nützlich.
- Aliquot 3 ml der geschmolzenen Agar in einer 17 x 100 mm Kulturröhrchen. in einem 42 ° C Wasserbad bis zur Verwendung Halten Sie die Agarose warm, indem die Kulturröhrchen platzieren. Bereiten Sie eine 15 mM Tricaine Lösung in VE - Wasser , um die Genaktivität zu betäuben 36.
HINWEIS: Wenn Bildgebung zu früheren Zeitpunkten gewünscht wird, kann die Konzentration von Agar als niedrig 39 als 0,3% verringert werden. - Bringen Sie die 15 mM Tricaine, abgeschirmt Embryonen, niedrige Schmelz Agarose, E3 Blau, und ein 35 mm Deckglas Boden Kulturschale zu einer Dissektion Lichtmikroskop. Sorgfältig das Chorion mit # 5 Pinzette des Embryos zu entfernen. Tun Sie dies für drei Embryonen.
- Legen Sie die dechorionated Embryonen in einem separaten Behälter betäubt werden. Der Deckel des Deckglases Bodenschale wird oft für diesen Zweck verwendet. Mit Hilfe einer Transferpipette, fügen Sie drei Tropfen (ungefähr 150 ul)von 15 mM Tricaine in die Schale von 5 ml E3 blau (wenn Sie den Deckel des Deckbodenschale verwenden) oder bis Embryonen ausreichend betäubt wurden. Darüber hinaus fügen Sie 3-4 Tropfen (ca. 150 bis 200 & mgr; l) von 15 mM Tricaine Lösung für das 1% geschmolzener Agarose Rohr.
- Mit einer p200 Pipette mit 1 cm der Pipettenspitze abgeschnitten; übertragen Sie die narkotisierten Embryonen auf dem Deckglas Boden Gericht. Entfernen Sie überschüssiges E3 Blau: Tricaine Lösung.
- Langsam von 5 bis 10 & mgr; l von niedrigschmelzende Agarose: Tricaine Lösung über die Embryonen, jeden Tropfen zu halten trennen die Embryonen versehentlich geschlossen haben, um sicherzustellen, nicht driften zueinander.
Achtung: Wenn die Agarose zu warm ist, wird es den Embryo schädigen. Eine gute Temperatur des Agar zu halten, bei 42 ° C. - Unter Verwendung einer 21 G 1 ½ Nadel auszurichten sanft den Embryo in der Agarose auf die gewünschte Position. Wenn ein inverses Mikroskop für Zeitraffer-Bildgebung unter Verwendung richten Sie die Region of Interest (ROI) so nah an dem Deckglas als possible.
Anmerkung: Für allgemeine Zwecke, der Schwanzbereich bietet eine einfache Ausrichtung und Klarheit aufgrund der relativ dünnen Gewebe (1A). Andere Gewebe, wie beispielsweise die Epithelschicht umgeben Eigelb und fin Falten können 28,29 verwendet werden. Diese Gewebe bieten große Klarheit, aber diese Regionen sind nur wenige Zellschichten dick. Für den Zweck dieses Protokolls ist es dem Bild vorteilhaft Schwanzbereich, um so viele Zellteilungen wie möglich erfassen. - Lassen Sie ein paar Minuten zur teilweisen Verfestigung des Agar. Verwenden Sie die Nadel ein kleines Stück Agar auseinander zu brechen, um seine Verfestigung zu testen. Wann kann ein Stück Agar weg aus dem Drop gezogen werden, gehen Sie zum nächsten Schritt.
- Decken Sie die gesamte Deck mit niedriger Schmelz Agar eine Kuppel über den eingebetteten Embryonen zu bilden. Lassen Sie das Agar , bevor die Schale für die konfokale Abbildung (Abbildung 1A) zu festigen.
- Während der Agar Erstarrungsprozesses (ca. 10 min dauert), bereiten Sie 3 ml of E3 Blaue Lösung mit fünf Tropfen (etwa 250 & mgr; l) 15 mM Tricaine auf über den eingebetteten Embryonen während der Bildgebung platziert werden.
4. 5D konfokale Bildgebung von Live Zebrafischembryonen 40,41
HINWEIS: Siehe Ariga 40 und O'Brien 41 für Details, wie 5D Bildgebung mit anderen konfokale Systeme durchzuführen. Für Z-Intervall, Z-Stack, Z-Tiefe, Zeitintervall und 5D Definitionen siehe Abbildung 1C.
- Öffnen Sie die Imaging-Software und stellen Sie das Mikroskop 60x NA 1,4 Objektivlinse. Bewerben Sionsöl auf die Objektivlinse und legen Sie die Kulturschale in den Diahalter auf dem Mikroskoptisch. Mit Hilfe der Achsensteuerung, zentriert um den Embryo von Interesse über der Objektivlinse und bringen nach oben in die Objektivlinse die Kulturschale zu erfüllen.
- Klicken Sie auf das Okular-Symbol und wechseln Sie in das GFP-Filter auf dem Mikroskop. Konzentrieren Sie sich auf den ROI. Die Konzentration auf das Gewebe am nächsten an der Deck wird offer die besten Bildergebnisse.
- Entfernen Sie die Verriegelung. Wählen Sie die GFP und mCherry Kanäle (voreingestellten Wellenlängen in Software) und stellen Sie die Zeile mit durchschnittlich Option normal.
- Verwenden Sie "Ansicht / Erfassungs-Bedienelemente / A1 Scanbereich" Befehl auf der A1 Scanbereich Werkzeug zu öffnen.
- Beginnen Sie das Scanning. Unter Verwendung des Achs-Controller, positionieren Sie den Embryo, so dass der Scan-Bereich mit so viel von der Zebrabärbling wie möglich gefüllt ist. Die Laserleistung muss nicht zu diesem Zeitpunkt optimal. Senken Sie die Laserleistung, um unnötige Photobleichens vermeiden.
- Verwenden Sie die "Ansicht / Acquisition Kontrollen / ND Erwerb" Befehl, um die ND Erwerb Systemsteuerung zu öffnen.
- Beginnen Sie das Scannen der Z-Stack-Parameter einzustellen. Stellen Sie den Z-Stack obere Grenze, wo die Zellen sind nicht im Fokus und untere Grenze, wo Zellen sind nicht mehr sichtbar. Ermöglichen eine 3 um Raum oberhalb der Probe für das Wachstum und die Zellbewegung, die in das Bildfeld erweitern kann. Der Z-Stack für die Figuren in diesem Pro gezeigtkoll bedeckt eine Z-Tiefe von 40 & mgr; m im Embryo Schwanz.
- Stellen Sie den Z-Intervall bis 2 um Schrittweite. Im Durchschnitt eine Zelle ist 10 & mgr; m im Durchmesser; daher 2 & mgr; m werden fünf Intervallen von Abbildungsdaten zu erzeugen für jede Zelle analysiert werden.
HINWEIS: Die Tiefe des Bildes, das abhängig von der Z-Intervall erfasst werden können. Z Auflösung wird geopfert Bild so viele Zellen, um die Gesamttiefe in der Z-Dimension zu gewinnen Mitose wie möglich (große Z-Tiefe) unterzogen. Die inverse wahr ist, daß durch die Schrittgröße abnimmt, wird Z Auflösung gewonnen, während Z-Tiefe (kleine Z-Tiefe) geopfert wird. - Stellen Sie das Bild Laserleistung, HV, und Ebenen ausgeglichen. Für die Experimente in diesem Protokoll demonstriert, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Pegel an den entsprechenden Ebenen versetzt sind, jeweils für die GFP-Kanal; 2 bis 5, 120-140, und -9 bis -11. Für den mCherry Kanal, verwenden Sie die folgende Laserleistung, HV, und Offset-Pegel sind; 3 bis 6, 120-140, und -3 bis-8. Nachdem die Parameter eingestellt sind, schalten Sie die Scan unnötig Laserbelichtung zu verhindern, die Phototoxizität und Photobleaching der Probe führen kann.
- Wählen Sie die Mittelungs Symbol 2x Linie. "Nein Lungs" erzeugt ein körniges Bild, während "4x Linie durchschnittlich" drastisch erhöht die Scan-Zeit. Die Verwendung von 2x Linie Lungs bietet die beste Bildqualität und schnellste Scan-Zeit.
- Wählen Sie das entsprechende Zeitintervall und Zeitdauer, die für das Experiment. Für Wildtyp - Divisionen, zwei-Minuten - Zeitintervalle für 2 Stunden ist am besten für mitotische Dauer Bestimmung (verwendet in den 1, 2, 3A und 3B). Räume, die die Spindelanordnung Kontrollpunkt für länger als 30 Minuten sind besser geeignet für alle fünf Minuten für vier Stunden aktivieren , um Fluoreszenz zu erhalten , wie in 3C gezeigt.
- Überprüfen Sie die "Datei speichern" ein und benennen Sie die Datei automatisch die Datei zu speichern, wie es erworben wird. Überprüfen Sie alle pametern richtig und drücken Sie "Start Run" gesetzt.
- Nach dem Erwerb abgeschlossen ist, wird die Datei in einem dreidimensionalen Format, klicken Sie auf die Lautstärkeschwelle Symbol anzuzeigen.
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Representative Results
Abbildung 2 zeigt die Fähigkeit , viele Zellteilungen mit einem weiten Feld Ansicht eines AB Wildtyp Zebrabärbling Schwanz zu beobachten. Über sieben mitotischen Zellen werden in einem 14 min Zeitrahmen (Film 1) abgebildet. Innerhalb der zwei Stunden Zeitverlauf über 40 mitotische Ereignisse wurden gefangen genommen. Im Durchschnitt 50 teilende Zellen wurden in der AB und 30 teilende Zellen in aur B m / m Embryonen (2B) beobachtet. Zur Berücksichtigung der Anzahl der Zellen abgebildet wird , abgebildet wird das Verhältnis von mitotischen Zellen zu Anzahl der Zellen wurde berechnet (Abbildung 2C). Diese Daten legen nahe , dass es nicht eine geringere Anzahl von Zellen ist durch Mitose in den aur B m / m Embryonen (2B) , jedoch eine geringere Anzahl von Zellen abgebildet werden würde. Die Fähigkeit, eine statistisch signifikante Anzahl von Veranstaltungen wie diese zu erwerben, wird die statistische Aussagekraft unterstützen.
3 erweitert auf diese Technik mitotischen Dauer enthalten zu quantifizieren. Sobald eine Zeitraffer-Sitzung erworben wird, kann eine einzelne Zelle für Zeit in der Mitose mit ausreichender Auflösung mit dem Zoom - Werkzeug (3A, B) ausgegeben werden analysiert. Mitotischen Dauer wird manuell berechnet durch Zählen, wie viele Zeitintervalle eine Zellteilung in Anspruch nehmen. Die Anzahl der Zeitintervalle wird dann durch das Zeitintervall zwischen jedem Z-Stapel multipliziert. Beispielsweise in 3C hat die Abteilung 12 Zeitintervalle und das Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stapel betrug 2 min. Daher wurde die Teilungszeit für diese Zelle 24 min. Die durchschnittliche AB Wildtyp Teilungszeit beträgt 25 min und 58 min für Aurb m / m (3B). Eine verlängerte Teilungszeit wie im Aurb m gesehen / m legt nahe , dass die Spindelanordnung checkpoint nicht durch fehlerhafte kine erfüllt wordentochore Anhänge 1,2. Einen genaueren Blick auf die gezoomt in Wildtyp - Embryonen, kann jede mitotischen Phase unterscheiden (3C, Movie 2). Darüber hinaus können mitotischen Defekten in der Aurb m / m Embryo beobachtet werden , die mitotischen Arrest umfassen und scheiterte in einer zweikernigen Zelle cytokinesis resultierende und die anschließende Bildung einer Mikrokern - (3D, Movie 3). Diese in der Analyse gezoomt zeigt mitotischen Defekte unterstützt die erhöhte Teilungszeit in 3B erworben.
Verschiedene andere diverse mitotischen Defekte und Zellschicksale , die 4 in erforscht Figur begegnet werden kann; im ESCO2 + / m und ESCO2 m / m Embryonen nachgewiesen. In einem ESCO2 + / m Embryo, sind fehlerhafte Chromosomenbewegungen erfasst und kann als congression Defekt definiert werdens. Congression Defekte auftreten, wenn unsachgemäße Mikrotubuli Anhängen werden. Diese Defekte verursachen den Ausfall der Chromosomen in Richtung der Metaphaseplatte zu migrieren. Gepaart Schwesterchromatiden, besonders erkennbar an mindestens 20 und 46, die nicht in Richtung der Metaphaseplatte congressed haben zunächst bei min 14. Anaphase beobachtet werden Beginn der Schwesterchromatiden trennt an der Metaphaseplatte sowie die paarigen Schwesterchromatiden nach rechts ausgerichtet ist, in Minute beobachtet 50. Zusätzlich ist möglich Mikronukleus - Bildung , da diese getrennt Schwesterchromatiden beobachtet bleiben außerhalb des Zellkerns (T = 50, 4A, Film 4) isoliert. In Figur 4B ist ein multipolares Teilung visualisiert (Movie 5). Multi-polar Divisionen treten häufig aufgrund von Zentrosomen Verstärkung, aber auftreten können , durch andere 42 bedeutet. In 4C ist ein ESCO2 m / m Zelle zeigt zunächst eine vorzeitige Schwesterchromatiden separatIon und Spindeldreh 9,43,44. Eine weitere Zelle Schicksal in diesem Panel zeigte eine anaphase Brücke , in dem merotelic Anlagen ungelöst 45,46 sind. Die anaphase Brücke kann erst in Minute zu sehen ist 62. Das Chromatin erscheint vorzeitig decondense, während die Zelle cytokinesis unterliegt. Als Zytokinese tritt, trifft der Teilungsfurche auf den dekondensiert Chromosomen und, wie abscission auftritt, das Chromatin Material zieht eine Anaphase Brücke (4C, Film 6) zu bilden. Obwohl hier nicht gezeigt, um die zellulären Schicksale zu quantifizieren sind, erfassen alle mitotischen Teilungen in jedem Rahmen und die Art des Zellschicksals sie zeigen. Teilen Sie die Anzahl von Zellen in jedem Schicksal durch die Gesamtzahl der Divisionen erfasst und mit 100 multipliziert das Zellschicksal Prozentsatz zu berechnen.
Abbildung 1: Protokoll Zeichnungen Gliederung. (EIN) (B) Schematische Darstellung des Embryos Einbettungsprozess. Die injizierten Embryonen müssen dechorionated und betäubt werden. Embryos werden dann an dem Deckglas-Bodenschale überführt und überschüssiges E3 Blau entfernt wird. Niedrige Schmelz Agar wird verwendet, getrennte Kuppeln zu schaffen jeden Embryo bedeckt. Richten Sie die Embryonen so der Schwanz der Nähe des Deckglases ist. Warten Sie zwei Minuten vor der Zugabe von Agar die ganze sie abgedeckt werden. Warten Sie, bis der Agar , bevor er nach Bild verfestigt wird. (C) Schematische Darstellung der Begriffe Z-Intervall, Z-Stack, Z-Tiefe, Zeitintervall, Zeitdauer und 5D zu definieren , die in dem Protokoll und Diskussion verwendet werden. Z-Intervall wird als der Abstand zwischen jedem Bild definiert als das Mikroskop tiefer in die Probe bewegt, um eine Z-Stapel zu erstellen. Z-Stapels alle Bilder durch ein aufgenommenesProbe an der Z-Intervall definiert. Die zurückgelegte Strecke in einer Z-Stack definiert die Z-Tiefe. Zeitintervall ist die Menge an Zeit zwischen einem Z-Stapel und dem nächsten Z-Stapel eine Zeitraffer-Bild zu erzeugen. Zeitdauer ist die Gesamtzeitmenge zu Bildes verwendet. 5D ist als die Dimensionen X, Y, Z, Zeit definiert, und Fluoreszenzemission. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Time-Lapse - Imaging Erfasst Multiple mitotische Ereignisse in einem Live - Embryo Zebrabärbling. (A) Zeitrafferbilder aus einem Experiment heraus gezoomt in einer AB - Wildtyp, 24 HPF Zebrabärbling mehrere mitotische Ereignisse zeigt. Sterne weisen auf sieben Zellen in der Mitose. t = Zeit in min verstrichen ist. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. (B) Die Anzahl der mitotischen cells in AB und Aurb m / m Zebrabärbling Schwänze bei 24 HPF beobachtet. Mittelwert ± st. dev., n = 3 Embryonen / Genotyp. (C) Das Verhältnis von mitotischen Zellen pro Gesamtzahl der Zellen in AB und Aurb m / m Zebrabärbling Schwänze bei 24 HPF. Mittelwert ± st. dev., n = 3 Embryonen / Genotyp. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Einzelzellanalyse Captures Jede mitotischen Phase und mitotischen Dauer. (A) Eine Zelle aus dem weiten Feld Ansicht von AB Wildtyp ausgewählt, 24 HPF Zebrafischembryo in 2A gezeigt. (B) der Division Zeit für AB beobachtet und Aurb m / m Zellen und von Folgern Kernhülle bre berechnetakdown (NEB) bei der ersten Beobachtung von kondensiertem Chromatin in einer Zelle zur Bildung von zwei neuen Tochterzellen. n = 3 Embryonen / Genotyp, n = 66 Divisionen für AB, n = 29 Divisionen für Aurb m / m, *** p-Wert <0,001. (C) AB Wildtyp - Zelle wird zugeschnitten , um die Phasenprogression durch Mitose zu visualisieren . t = min. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. (D) Aurb m / m Zelle abgeschnitten wird mitotischen Progression durch Mitose zu visualisieren, die in cytokinesis Versagen und Kernbildung resultierende mitotischen Arrest enthält. Die Pfeile zeigen auf die Mikronuklei. t = Zeit in min verstrichen ist. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4.Single Cell Live - Imaging Erfasst Multiple mitotischen Defekte Verbunden mit Chromosome Segregation und der Division in mitotischen Mutant Zebrabärbling. (A) Ein zugeschnittene Bild einer Zelle unterzogen congression Defekte in einem ESCO2 + / m Embryo. Der dünne Pfeil überwacht die linke Chromosom, das wieder in die Metaphaseplatte gezogen wird. Der dicke Pfeil überwacht die richtige Chromosom, das nicht zurück in die Metaphaseplatte gezogen wird und geschlossen ein Mikrokern zu bilden. Der Doppelpfeil zeigt die Trennung des rechten Chromosom, das in der Anaphase Einsetzen nicht Kongress tat. Einschübe zeigen in Ansichten der Chromosomen gezoomt, der Kongress gescheitert. Einfügungen wurden abgeschnitten und Helligkeit für eine bessere Visualisierung verbessert. CAAX Fluoreszenz wurde die Chromosomen leichter zu visualisieren entfernt. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. (B) A zugeschnittene Bild einer Zelle die Mitose unterziehen , die in einem ESCO2 in einer multipolaren Division Ergebnisse + / M embryo. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. (C) Ein beschnittene Bild einer Zelle erfährt Müdigkeit Zusammenhalt was anaphase Brückenbildung durch den fadenförmigen Ziehen zwischen den beiden Kernen festgestellt durch die Klammern gesehen. Maßstabsbalken = 5 & mgr; m. t = Zeit in Minuten vergangen sind . Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1. Mehrere Zellteilungen können in einem weiten Blick eines injizierten Wildtyp Zebrafischembryo sichtbar gemacht werden (rechts Download anklicken).
Film 2. Phasen der Mitose kann leicht in einem Wildtyp - Zebrafischembryo sichtbar gemacht werden (r ight Download anklicken). Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns und geht in Richtung congression der Schwesterchromatiden gefolgert eine Metaphaseplatte zu bilden . Genaue Entmischung und liefert zwei neue Tochterzellen.
Film 3. Live - Bildgebung von Aurb m / m Embryo zeigt Chromosom vermissenegregation, scheiterte cytokinesis und Mikronuklei - Bildung (rechts Download anklicken). Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns abgeleitet, streuen Chromosomen zu entgegengesetzten Polen momentan keine passende Metaphaseplatte zu bilden, und gehen Sie auf Achse zu drehen , die Teilung erstreckt Zeit der Zelle. Zytokinese tritt nicht in einer 4N Zelle und mehreren Mikrokerne führt.
Film 4. Congression Defekte in einer beobachtet ESCO2 + / m Embryo (rechts herunterladen anklicken). Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns abgeleitet. Nachdem die Metaphaseplatte gebildet wird, ein paar indizelne Chromosomen streuen zu jeder Seite. Ein einzelnes Chromosom nach links wird schließlich wieder in die Metaphase Platte gezogen, während das Chromosom nach rechts bleibt außerhalb der Platte Metaphase und kann zu Beginn der Anaphase Trenn Schwesterchromatiden zu sehen. Die Zelle weist eine verlängerte Teilungszeit aber ultimative teilt mit potentiellen Mikronukleus-Bildung.
Film 5. Multi-polar Division wird in einer ESCO2 + / m Embryo beobachtet (rechts Download anklicken). Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns entnommen und dann Chromosomen verschmelzen , um eine Y-Form Indikativkurse zu bildene von 3-Spindelpole. Die Zelle weist eine verlängerte Teilungszeit aber schließlich teilt sich in drei Tochterzellen.
Film 6. Vorzeitige Trennung der Schwesterchromatiden und anaphase Brückenbildung in einer ESCO2 m / m Embryo beobachtet werden (Rechtsklick zum Download). Kernhülle Abbau wird durch die unregelmäßige Auftreten des Kerns entnommen und dann streuen Chromosomen in der Zelle nicht in der Lage ein zu bilden richtige Metaphaseplatte. Das Chromatin decondenses vor Zytokinese und wie die Zelle teilt, erzeugt eine Anaphase Brücke zwischen den beiden Zellen.
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Discussion
Die Verwendung dieses Verfahrens ermöglicht eine Kernhülle Abbau, Bildung einer Metaphase Platte durch Mikrotubuli-kinetochore Anhänge und Segregation von Schwesterchromatiden zu schließen zwei neue Zellen in vivo zu bilden , und in einer zeitabhängigen Weise. Die Fähigkeit, die Mitose in Zebrabärbling zu beobachten ist vorteilhaft gegenüber fixierten Proben und Zellkultur-Systeme, da die Zellen in die natürliche Physiologie abgebildet wird, das Gewebe transparent ist, die für fluoreszierende Proteine können verwendet werden, sie entwickeln sich relativ schnell, und Zeitraffer-Bildgebung erworben werden. Verwendung adulter Zebrabärbling für dieses Protokoll beschränkt ist aufgrund der begrenzten Z-Tiefe, die aufgrund des dickeren Gewebe erworben werden kann, der nicht der Haut oder der Augen ist. Während transgene Tiere H2A.F / Z-EGFP und mCherry-CAAX exprimierenden für den gleichen Zweck verwendet werden konnten, ist die Vielseitigkeit und Einfachheit der mRNA-Injektionen in verschiedene mutierte Zebrabärbling vorteilhaft gegenüber genetischen Kreuzungen. In Situationen, in denen mitotischen Analyseerforderlich in drei Tagen nach der Befruchtung (dpf) oder später Embryonen würden transgene Tiere notwendig sein, aufgrund der Halbwertszeit von RNA in diesem sich rasch entwickelnden Organismus.
Andere fluoreszierende Proteine, die für die Mitose Visualisierung sind zu diesem Protokoll zugänglich. Zum Beispiel ist H2B-GFP mRNA eine Alternative zu H2A.F / Z-EGFP für Chromatin und bietet ähnliche Kennzeichnung. Andere fluoreszierend-markierte Proteine, die in dieser Technik verwendet werden können, schließen POM121, Centrin, Eb1, Hec1 und EMTB, die für lebende im Embryo Abbildung der Kernhülle, Centriolen plus-Ende von Mikrotubuli, kinetochore und Mikrotubuli gestatten würde, jeweils 32,47-51.
Dieses Protokoll hat mehrere Abbildungsschritte, die Qualität der Ergebnisse durchgeführt werden müssen, um zu erreichen: 1) Stellen Sie sicher, dass die mRNA Qualität und Konzentration zu optimieren, um die hellste Fluoreszenz und keine Toxizität wie möglich zu erhalten. Je mehr Fluoreszenz wird weniger Laserbelichtung führen und daher weniger photobleaching und Phototoxizität. 2) Der Embryo muss vollständig betäubt und sicher in den Agar. Kleinere Bewegungen werden die Ergebnisse verändern und das Experiment ruinieren könnte. 3) Die Agarkonzentration muss angemessen sein für das Stadium der Embryo abgebildet zu wünschen übrig. Bei 24 HPF und weitere 1% niedrigschmelzende Agarose ist geeignet. Wenn Bildgebung bei 12 HPF oder früher, eine 0,3% Agarose - Lösung sollte 39 verwendet werden. 4) Der ROI im Embryo sollte möglichst nahe an der Deck wie möglich sein. Dieser Schritt schränkt man nicht den Schwanz Bildgebung. Die Augen, der Haut, Rückenbereich, Eigelb und Flossenfaltung sind Beispiele für andere Bereiche, die dieses Protokoll verwenden können.
Zeit ist der entscheidende Faktor, der dieses Protokoll von der Bildgebung fixierte Embryonen oder Gewebe trennt. Wenn die Z-Stapel - Einrichtung, Z-Intervall, Zeitraffer-Intervall, und Zeitraffer-Dauer ist es wichtig , den Kontext des Experiments (1C) im Auge zu behalten. Ein Wildtyp Zellteilung dauert in der Regel ca. 25 min bei 24 HPF. in thBeispiel 2 & mgr; m Z-Intervall in 40 & mgr; m von Gewebe in einem Z-Stack, mit zwei Minuten Zeitintervall für zwei Stunden ist hat sich als wirksam erwiesen. Des Weiteren wird in Embryonen mit defekten Mitose-Zellen in einem mitotischen Arrest am ehesten vorhanden sein, drastisch Zellteilung Zeiten zu erhöhen. Um mehrere volle Divisionen erwerben, sollte die Zeitdauer erhöht werden, dh von 2 h bis 4 h. Eine längere Erfassungszeit wird die Probe auf mehr Laserleistung ausgesetzt werden und das Risiko von Photobleaching und Phototoxizität erhöhen. In diesem Fall sollte das Zeitintervall zwischen jedem Z-Stapel erhöht werden. Dynamische Chromosoms Bewegungen durch Erhöhen des Zeitintervalls zwischen Z-Stapeln geopfert werden, aber Zeitdauer gewonnen wird. Dies ist notwendig, wenn Zellteilungen Bildgebung, die mehr als zwei Stunden dauern kann.
Obwohl es nicht direkt besprochen wurde, kann dieses Protokoll optimiert werden, um ein Bild mit höherer Auflösung in der Z-Ebene zu erhalten, mo, um mehr zu visualisieren genau einzelne Chromosombesserungen. Beispielsweise sind in 4A zwei missegregated Chromosomen beobachtet. Das Chromosom nach rechts (festgestellt durch den dicken Pfeil) zunächst hell und scharf, aber dimmt in den letzten paar Frames. Mit einem 2 & mgr; m Z-Intervall fällt das uncongressed Chromosoms zwischen dem Z-Intervall. Capturing Minute Bewegungen und einzigartige Chromosomenveränderungen kann durch Erhöhung der Auflösung in der Z-Ebene erreicht werden. Um dies zu tun, Zoom auf einer einzelnen Zelle auf der A1 Scanbereich Werkzeug. Wenn die Z-Stack-Parameter einrichten, einen kleineren Z-Intervallabstand verwenden. Eine empfohlene Bereich ist von 0,5 bis 1 & mgr; m. Darüber hinaus zwischen den einzelnen Z - Stack , das Zeitintervall abnimmt werden weichere Übergänge zwischen den einzelnen Zeitrahmen zu erstellen, dh von zwei Minuten auf 30 Sekunden - 1 min. Eine Einschränkung auf diese Art von Bildgebung ist die begrenzte Z-Tiefe, die erreicht werden kann. Aufgrund der kleineren Z-Intervall und das Zeitintervall, mehr Gewebe zu den Lasern in einem kleineren Zeitrahmen ausgesetzt werden. Zur Überwindung dieser, smaller Zeitdauer verwendet werden kann; dies ist jedoch auch davon abhängig, wie lange der Forscher wie Divisionen erfassen würde.
Eine Analogie, die mit diesen Modifikationen kann helfen, ist ein Z-Stack als eine Ziehharmonika zu denken. Der Abstand zwischen jeder Falte des Balges ist die Z-Intervall und die Z-Tiefe wird durch die Länge des Akkordeons dargestellt. In einem Fall, wo man möchte nicht mehr Laser-Exponierung der Probe zufließen, wie die Ziehharmonika Ausdehnungen (erhöht die Z-Tiefe), wobei der Abstand zwischen den Falten des Balgs (Z-Intervall) müssen ebenfalls erhöhen. Die inverse ist, dass als Akkordeon Verträge wahr, die Z-Tiefe abnimmt. Die Falten des Balgs Vertrag als auch zu einer Abnahme in Z-Intervall entspricht. Diese Analogie kann zu festen und Live-Proben angewendet werden. Die Komplexität wird in diesem Protokoll erhöht, wenn die Zeit der Gleichung hinzugefügt wird. Es gibt eine begrenzte Menge an Zeit, die der Akkordeonist verlängern oder das Akkordeon Vertrag. Diese Vertrets das Zeitintervall. Um mehr Abstand (Z-Tiefe) das Zeitintervall abdecken muss wachsen. Wie gut, um mehr Musik zu hören, muss man für einen längeren Zeitraum (Zeitdauer) In Bezug auf dieses Protokoll zu hören, um mehr Zellteilungen zu erleben, muss die Zeitdauer erhöhen. Ein Compoundierung Faktor im Auge zu behalten ist, dass die mehr Musik, die gespielt wird, desto müder die Akkordeonisten. Dies ist analog zu dem Endmaß, Fluoreszenz. Je mehr Laserbelichtung die Probe gegeben wird, wird die mehr Photobleaching und Phototoxizität (Müdigkeit) ein Thema.
Zusammengefasst Details dieses Protokoll eine Methode der Mitose in einer Live Zebrafischembryo für verschiedene Analysen zu visualisieren; 1) Teilungszahl 2) Teilungszeit 3) Division Schicksal und 4) hohe Auflösung Chromatin Dynamik. Mehrere Möglichkeiten für mitotische Komponenten Visualisierung Attachments Bereich von Mikrotubulus-Dynamik kinetochore Zentriol angewendet werden kann. Kombinieren der FähigkeitBildgebungs Mitose in vivo mit den jüngsten Fortschritte in der Genom Bearbeitung in Zebrabärbling wird es leicht Mutanten in verschiedenen Aspekten der Mitose zu erzeugen 25,26,52-56 menschlichen Krankheit in einem Vertebraten Organismus zu modellieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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