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Developmental Biology

एक लाइव zebrafish भ्रूण में mitotic डिवीजन और गतिशीलता अवलोकन

Published: July 15, 2016 doi: 10.3791/54218
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

सूत्रीविभाजन जीवधारी विकास और भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है। प्रक्रिया अत्यधिक गतिशील है और एक छोटे से समय सीमा में उचित क्रोमेटिन संक्षेपण, microtubule-kinetochore लगाव, गुणसूत्र अलगाव, और cytokinesis को पूरा करने का आदेश दिया घटनाओं की आवश्यकता है। नाजुक प्रक्रिया में त्रुटियों जन्म दोष और कैंसर सहित मानव रोग, हो सकती है। पारंपरिक मानव mitotic रोग राज्यों की जांच के दृष्टिकोण अक्सर सेल संस्कृति प्रणाली है, जो प्राकृतिक शरीर विज्ञान और विकास / ऊतक विशेष लाभप्रद संदर्भ में जब मानव रोग का अध्ययन की कमी पर भरोसा करते हैं। इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प, एक कशेरुकी प्रणाली में गुणसूत्र गतिशीलता, zebrafish के साथ, कल्पना करने के लिए एक तरीका प्रदान करके कई बाधाओं पर काबू। इस प्रोटोकॉल एक दृष्टिकोण है कि कोशिकाओं को विभाजित, जिसमें शामिल की गतिशील छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता विस्तार होगा: इन विट्रो प्रतिलेखन, zebrafish प्रजनन / इकट्ठा करने, भ्रूण एम्बेड, और समय चूक इमेजिंग। अनुकूलन और modifइस प्रोटोकॉल के ications भी पता लगाया है। H2A.F / Z-EGFP का प्रयोग और mCherry-CAAX (लेबल कोशिका झिल्ली) mRNA इंजेक्शन भ्रूण, एबी जंगली प्रकार, auroraB hi1045, और esco2 hi2865 उत्परिवर्ती zebrafish कल्पना है में बँटवारा (क्रोमेटिन लेबल)। zebrafish में उच्च संकल्प रहते इमेजिंग एक कई mitoses निरीक्षण करने के लिए सांख्यिकीय mitotic दोषों और mitotic प्रगति के समय यों की अनुमति देता है। इसके अलावा, गुणात्मक पहलुओं है कि अनुचित mitotic प्रक्रियाओं (यानी, congression दोष, गुणसूत्रों की missegregation, आदि) और अनुचित गुणसूत्र परिणामों (यानी, aneuploidy, polyploidy, micronuclei, आदि) को परिभाषित का अवलोकन मनाया जाता है। इस परख ऊतक भेदभाव / विकास का अवलोकन करने के लिए लागू किया जा सकता और उत्परिवर्ती zebrafish और औषधीय एजेंटों के उपयोग के लिए उत्तरदायी है। कैसे बँटवारा में दोष कैंसर और विकासात्मक विकारों के लिए काफी होगा नेतृत्व के दृश्यरोग के रोगजनन की समझ बढ़ाने के लिए।

Introduction

सूत्रीविभाजन विकास, भेदभाव, और एक जीवित जीव में उत्थान के लिए एक महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रिया आवश्यक है। सटीक तैयारी और अंतरावस्था में डीएनए की प्रतिकृति पर, सेल विभाजित करने के लिए primed है। बँटवारा, prophase, के पहले चरण cyclin बी / Cdk1 की सक्रियता के द्वारा शुरू की है। Prophase गुणसूत्रों में क्रोमेटिन सामग्री का संक्षेपण की विशेषता है। परमाणु लिफाफा टूटने prophase और prometaphase के बीच संक्रमण पर होता है। prometaphase में, centrosomes, धुरी गठन के लिए nucleating केंद्र, जबकि kinetochore लगाव की तलाश में सूक्ष्मनलिकाएं का विस्तार विपरीत ध्रुवों की ओर पलायन करने के लिए शुरू। कुर्की पर, रूपांतरण के अंत पर microtubule लगाव और तनाव बलों गुणसूत्रों एक metaphase प्लेट 1 गठन उन्मुख। सभी गुणसूत्रों सही ढंग से जुड़े होते हैं, तो धुरी विधानसभा चौकी, संतुष्ट है बहन क्रोमेटिडों को एकजुट रखने cohesin छल्ले चिपके रहते हैं, और सूक्ष्मनलिकाएं बहन खींचने के लिए छोटाanaphase 2,3 दौरान विपरीत ध्रुवों को क्रोमेटिडों। अंतिम चरण में, टीलोफ़ेज़, सेल और दो नए परमाणु नाभिक के चारों ओर लिफाफा के सुधार के बढ़ाव शामिल है। Cytokinesis दो नए बेटी कोशिकाओं 4-6 की कोशिका द्रव्य को अलग करके विभाजन की प्रक्रिया पूरा करती है। कुंजी mitotic रास्ते (यानी, धुरी विधानसभा चौकी, केंद्रपिंड दोहराव, बहन chromatid सामंजस्य, आदि।) परिवर्तन metaphase गिरफ्तारी, गुणसूत्रों की missegregation, और जीनोमिक अस्थिरता 7-10 में परिणाम कर सकते हैं। अंत में, रास्ते को नियंत्रित करने बँटवारा में दोष विकासात्मक विकारों और कैंसर, बँटवारा की जरूरत महसूस दृश्य और एक जीवित, कशेरुकी, बहु-कोशिकीय जीव 10-16 में अपनी दोष उत्पन्न कर सकते हैं।

Zebrafish भ्रूण पारदर्शी ऊतक, microinjection में आसानी, और तेजी से विकास की वजह से रहते इमेजिंग के लिए एक महान मॉडल जीव के रूप में सेवा करते हैं। zebrafish का उपयोग करना, इस पांडुलिपि के समग्र लक्ष्य के लिए हैलाइव 5 डी (आयाम एक्स, वाई, जेड, समय, और तरंग दैर्ध्य) बँटवारा 17 (चित्रा 1 सी) के इमेजिंग के लिए एक विधि का वर्णन है। उत्परिवर्ती zebrafish अलग mitotic रास्ते में दोषपूर्ण का उपयोग इस तरह के दोष का परिणाम प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, अरोड़ा बी और Esco2 म्यूटेंट इन दोषों को वर्णन करने के लिए चुने गए हैं। अरोड़ा बी एक काइनेज कि गुणसूत्र यात्री जटिल (सीपीसी) धुरी के गठन और microtubule लगाव में शामिल का हिस्सा है। यह भी cytokinesis 18,19 में दरार कुंड गठन के लिए आवश्यक है। Zebrafish में, अरोड़ा बी की कमी कुंड प्रेरण, cytokinesis, और गुणसूत्र अलगाव 20 में दोष होता है। Esco2, दूसरे हाथ पर, एक acetyltransferase कि बहन chromatid सामंजस्य 21,22 के लिए आवश्यक है। यह अंगूठी इस प्रकार cohesin स्थिर metaphase-anaphase संक्रमण 23 पर उचित गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करने के SMC3 हिस्से पर cohesin acetylates। zebrafish में Esco2 की हानि चर्चा करने के लिए सुरागromosome missegregation, समय से पहले बहन chromatid जुदाई, जीनोमिक अस्थिरता, और p53 पर निर्भर है और स्वतंत्र apoptosis 24,25। उपलब्धता, auroraB hi1045, और esco2 hi2865 उत्परिवर्ती zebrafish के कारण इस तकनीक 25-27 वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (इसके बाद के रूप में aurB मी / मी और esco2 मी / मी, क्रमशः कहा गया है)।

फ्लोरोसेंट टैग सेल मशीनरी के साथ युग्मन confocal माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं सक्षम है बँटवारा 25,28,29 दौरान क्रोमेटिन और कोशिका झिल्ली गतिशीलता कल्पना करने के लिए। फ्लोरोसेंट टैग histones ऐतिहासिक क्रोमेटिन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। Histones परमाणु चार अलग अलग जोड़े (H2A, H2B, H3, और एच 4) कि nucleosome संरचना है कि क्रोमोसोम 30 composes के लिए जिम्मेदार हैं से बना प्रोटीन होते हैं। H2B यकीनन में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया हिस्टोन है जबकिमाउस और सेल संस्कृति, हिस्टोन 2A का उपयोग करते हैं, परिवार जेड (H2A.F / जेड) zebrafish 31,32 में उपयोग के लिए अच्छी तरह से साबित कर दिया है। Concanavalin ए और कैसिइन काइनेज 1-गामा उदाहरण के लिए, कोशिका झिल्ली को स्थानीय बनाना और पहले समुद्र urchins और ड्रोसोफिला 33,34 में कोशिका झिल्ली visualizing में प्रभावी दिखाया गया है। अन्य अध्ययनों से पता चला है कि CAAX फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन कोशिका झिल्ली लेबल और zebrafish 31 में सफल रहा था है। CAAX एक आकृति है कि इस तरह farnesyltransferases और geranylgeranyltransferases के रूप में बाद translational संशोधित एंजाइमों द्वारा मान्यता प्राप्त है। इन एंजाइमों द्वारा संशोधनों प्रोटीन झिल्ली जुड़े बनने के लिए, इस प्रकार कोशिका झिल्ली 35 लेबलिंग के कारण।

zebrafish में पूर्व उपयोग के कारण, इस प्रोटोकॉल H2A.F / जेड और CAAX का उपयोग करने के क्रोमेटिन और कोशिका झिल्ली लेबल करने के लिए चुना है। इस विधि के आवेदन व्यक्तिगत गुणसूत्र निरीक्षण करने के शोधकर्ता व्यक्ति कोशिका के स्तर पर नजर रखने के बँटवारा करने की अनुमति देगागतिशीलता, साथ ही साथ कई कोशिका विभाजन है कि ऊतक भेदभाव और विकास को प्रभावित कर सकता निगरानी। यह लेख अलग-अलग सेल स्तर पर बँटवारा दौरान गुणसूत्र अलगाव की गतिशीलता इमेजिंग पर ध्यान दिया जाएगा। इस पांडुलिपि के भीतर, कई mitotic डिवीजनों का निरीक्षण विभाजन के समय की गणना, और mitotic phenotypes समझने की क्षमता के सचित्र और चर्चा की जाएगी। इन मापदंडों का उपयोग करके, physiologically प्रासंगिक डेटा एकत्र की है और mitotic दोष से प्रभावित कई रोग राज्यों के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. इन विट्रो प्रतिलेखन

  1. PCS2-H2A.F / Z-EGFP और / या pCS2-mCherry-CAAX वैक्टर Linearize चना प्रतिबंध से एंजाइम को पचाने 31। इन विट्रो प्रतिलेखन किट में एक शाही सेना का उपयोग करना, प्रत्येक टेम्पलेट से 5 'छाया हुआ mRNA उत्पादों उत्पन्न, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार।
  2. एक शुद्धि किट का उपयोग छाया हुआ mRNA शुद्ध। निर्माता के निर्देशों का पालन करें। RNase मुक्त एच 2 ओ के साथ Elute
  3. 260 एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग एनएम पर absorbance द्वारा शाही सेना की एकाग्रता का निर्धारण। (आयुध डिपो 260 x कमजोर पड़ने x 40 माइक्रोग्राम / एमएल)।
  4. 100 एनजी शाही सेना पतला / प्रत्येक H2A.F / Z-EGFP और साथ mCherry-CAAX RNase मुक्त एच 2 ओ के लिए μl आरएनए एकाग्रता बहुत कम है, तो प्रतिदीप्ति या कम हो जाएगा अनुपस्थित। उज्जवल नमूने phototoxicity और photobleaching को लेकर चिंता कम होगा। दूसरी ओर, बहुत ज्यादा आरएनए विषाक्त हो सकता है और / या लक्ष्य प्रभाव से दूर हो सकता है।
    नोट: शेष स्टोर-80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में शुद्ध mRNA।

2. Zebrafish ब्रीडिंग, भ्रूण संग्रह, और mRNA इंजेक्शन 36-38

  1. एक बाधा के साथ प्रजनन टैंक इकट्ठा दोनों क्षेत्रों में टैंक अलग और zebrafish सुविधा में प्रयुक्त जल कृषि प्रणाली पानी के साथ प्रत्येक प्रजनन टैंक को भरने के लिए।
  2. आदेश के प्रजनन से पहले, असामयिक प्रजनन को रोकने रात दूसरे पक्ष पर बाधा के एक तरफ और दो मादा मछली पर दो पुरुष मछली जगह के लिए।
  3. अगले दिन, बर्फ पर पहले से तैयार mRNA मिश्रण पिघलना। ताजा जल कृषि प्रणाली पानी के साथ प्रजनन टैंक में पानी की जगह और बाधाओं को दूर। इसके तत्काल बाद बाधाओं को खींच रहे हैं, 28.5 डिग्री सेल्सियस के लिए एक इंजेक्शन ढालना गर्म और microinjection के लिए उपकरणों की स्थापना की।
    नोट: इंजेक्शन नए नए साँचे के बारे में जानकारी के लिए, कृपया Gerlach 36 को देखें।
  4. अंडे ले लीजिए हर 10 - एक चाय का झरनी का उपयोग कर 15 मिनट और ई के साथ एक साफ 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में अंडे कुल्ला3 ब्लू (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी MgSO 4, 10 -5% Methylene नीले)। E3 ब्लू कवक विकास को रोकने और लार्वा मछली के समुचित विकास सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। संभोग और भ्रूण संग्रह के बारे में अधिक जानकारी के लिए, Gerlach 36 और 37 Porazinkski को देखें।
  5. ट्वीट एक सेल एक गरम इंजेक्शन मोल्ड में भ्रूण का मंचन किया और जर्दी में शाही सेना इंजेक्षन भ्रूण (चित्रा 1 ए) के वांछित राशि में। प्राकृतिक भ्रूण मौत और 15% अधिक भ्रूण प्रयोग के लिए आवश्यक तुलना पर भ्रूण इंजेक्शन के प्रदर्शन से unfertilized भ्रूण के लिए खाते। Zebrafish भ्रूण के microinjection पर अतिरिक्त जानकारी के लिए, Gerlach 36 और 37 Porazinkski को देखें।
    नोट: mRNA की पहली बार के उपयोग के लिए, प्रतिदीप्ति और व्यवहार्यता 5 डी इमेजिंग प्रदर्शन करने से पहले (5 DPF करने के लिए कोई सकल विकास दोष के रूप में परिभाषित) के लिए इष्टतम खुराक निर्धारित करने के लिए एक खुराक-वक्र विश्लेषण करते हैं। के लिए 150 - 200 एनजी / μlभ्रूण में इंजेक्ट अक्सर इष्टतम एकाग्रता, इसलिए यह अंतिम एकाग्रता के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है।
  6. सावधानी मोल्ड एक संशोधित 9 "कांच पाश्चर विंदुक का उपयोग करने से इंजेक्शन भ्रूण निकाल सकते हैं। पिपेट संशोधित करने के लिए अंत में एक लेम्प बर्नर का उपयोग कर जब तक यह एक गेंद रूपों पिघला।
  7. एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में E3 नीले रंग में एक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश और घर में इंजेक्शन भ्रूण रखें।
  8. छह घंटे बाद इंजेक्शन, प्लेटों से किसी भी मृत या unfertilized भ्रूण को हटाने और साफ E3 ब्लू जोड़ें। हाउस 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण।

3. तैयारी और इमेजिंग के लिए लाइव zebrafish भ्रूण की एम्बेडिंग (चित्रा 1 बी)

  1. इमेजिंग से पहले दो घंटा, एक फ्लोरोसेंट विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग GFP के लिए इंजेक्शन भ्रूण स्क्रीन। E3 ब्लू के साथ एक नया 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में चमकीले हरे GFP व्यक्त भ्रूण रखें।
  2. agarose E3 ब्लू की 100 मिलीलीटर कम से पिघल के 1 ग्राम जोड़कर 1% कम पिघल agarose के एक शेयर समाधान उबाल लें। agarose उपयोग करने के बाद, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कुप्पी को कवर किया। शेयर समाधान एक महीने तक के लिए उपयोगी रहता है।
  3. विभाज्य एक 17 x 100 मिमी संस्कृति ट्यूब में पिघल अगर की 3 मिलीलीटर। उपयोग के लिए तैयार है जब तक एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में संस्कृति ट्यूब रखकर agarose गर्म रखें। Zebrafish भ्रूण 36 anesthetize करने के लिए विआयनीकृत पानी में एक 15 मिमी Tricaine समाधान तैयार है।
    नोट: पहले समय बिंदुओं पर इमेजिंग वांछित है, अगर की एकाग्रता 0.3% 39 के रूप में कम से कम किया जा सकता है।
  4. 15 मिमी Tricaine, जांच भ्रूण, कम पिघल agarose, E3 ब्लू, और एक विच्छेदन प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए एक 35 मिमी गिलास coverslip नीचे संस्कृति पकवान ले आओ। ध्यान से # 5 चिमटी के साथ भ्रूण के जरायु हटा दें। तीन भ्रूण के लिए यह करो।
  5. जगह एक अलग कंटेनर में dechorionated भ्रूण anesthetized किया जाना है। coverslip नीचे डिश के ढक्कन अक्सर इस उद्देश्य के लिए प्रयोग किया जाता है। एक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग, तीन बूँदें जोड़ने (लगभग 150 μl)15 मिमी Tricaine 5 मिलीलीटर E3 नीले रंग के पकवान (यदि coverslip नीचे डिश के ढक्कन का उपयोग) भ्रूण या जब तक पर्याप्त anesthetized गई है। 1% agarose पिघल ट्यूब के लिए 15 मिमी Tricaine समाधान की - (200 μl लगभग 150) इसके अलावा, 3-4 बूँदें जोड़ें।
  6. विंदुक टिप काट के 1 सेमी के साथ एक P200 पिपेट का उपयोग करना; coverslip तली डिश के लिए anesthetized भ्रूण हस्तांतरण। Tricaine समाधान: किसी भी अतिरिक्त E3 ब्लू निकालें।
  7. भ्रूण के ऊपर Tricaine समाधान एक बूंद सुनिश्चित करने के लिए भ्रूण गलती से एक दूसरे के करीब बहाव नहीं अलग रखते हुए: कम पिघल agarose के 10 μl - धीरे 5 जोड़ें।
    चेतावनी: agarose भी गर्म है, यह भ्रूण को नुकसान होगा। एक अच्छा तापमान बनाए रखने के लिए अगर 42 डिग्री सेल्सियस है।
  8. एक 21 जी 1 आधा सुई का प्रयोग, धीरे इच्छित स्थान पर agarose में भ्रूण उन्मुख। समय चूक इमेजिंग के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, ब्याज (आरओआई) के रूप में possib के रूप में coverslip के करीब के क्षेत्र उन्मुखle।
    नोट: सामान्य प्रयोजनों के लिए, पूंछ क्षेत्र अपेक्षाकृत पतली ऊतक (चित्रा 1 ए) के कारण अभिविन्यास और स्पष्टता की आसानी प्रदान करता है। इस तरह की जर्दी और फिन परतों आसपास के उपकला परत के रूप में अन्य ऊतकों, 28,29 इस्तेमाल किया जा सकता है। इन ऊतकों बड़ी स्पष्टता की पेशकश करते हैं, लेकिन इन क्षेत्रों के केवल कुछ ही सेल परतों मोटी हैं। इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए, यह पूंछ के रूप में संभव के रूप में कई कोशिका विभाजन के अधिग्रहण के लिए क्षेत्र की छवि के लिए फायदेमंद है।
  9. अगर की आंशिक solidification के लिए कुछ मिनट की अनुमति है। इसकी दृढ़ीभवन परीक्षण करने के लिए अगर एक छोटा सा टुकड़ा अलग तोड़ने के लिए सुई का प्रयोग करें। जब अग्रवाल का एक टुकड़ा ड्रॉप से ​​दूर खींच लिया जा सकता है, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  10. कम पिघल अगर एम्बेडेड भ्रूण के ऊपर एक गुंबद के गठन के साथ पूरे coverslip को कवर किया। अगर confocal इमेजिंग (चित्रा 1 ए) के लिए पकवान जाने से पहले जमना करने की अनुमति दें।
  11. के दौरान अगर solidification प्रक्रिया (लगभग 10 मिनट लगते हैं), तैयार 3 मिलीग्राम ओ(लगभग 250 μl) 15 मिमी Tricaine के पांच बूंदों के साथ एफ E3 ब्लू समाधान इमेजिंग के दौरान एम्बेडेड भ्रूण पर रखा जा सकता है।

4. 5 डी Confocal लाइव Zebrafish भ्रूण 40,41 की इमेजिंग

नोट: कैसे 5 डी इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए अन्य confocal सिस्टम का उपयोग करने पर जानकारी के लिए Ariga 40 और ओ ब्रायन 41 देखें। जेड अंतराल, जेड ढेर, जेड गहराई से, समय अंतराल, और 5 डी परिभाषाएँ लिए चित्रा 1C देखें।

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और 60X 1.4 एनए उद्देश्य लेंस के लिए माइक्रोस्कोप की स्थापना की। उद्देश्य लेंस को विसर्जन के तेल लागू करें और खुर्दबीन मंच पर स्लाइड धारक में संस्कृति पकवान जगह है। अक्ष नियंत्रक का उपयोग करना, उद्देश्य लेंस के ऊपर ब्याज की भ्रूण केंद्र और उद्देश्य लेंस ऊपर की ओर लाने संस्कृति पकवान मिलते हैं।
  2. आंख टुकड़ा आइकन पर क्लिक करें और माइक्रोस्कोप पर GFP फिल्टर करने के लिए स्विच। रॉय पर ध्यान दें। ओ coverslip के सबसे करीब के ऊतकों पर ध्यान केंद्रित करेंगेसबसे अच्छा इमेजिंग परिणाम ffer।
  3. गूंथ निकालें। (सॉफ्टवेयर में पूर्व निर्धारित तरंग दैर्ध्य) GFP और mCherry चैनलों का चयन करें और लाइन सामान्य करने के लिए विकल्प के औसत निर्धारित किया है।
  4. का प्रयोग करें "देखें / अधिग्रहण नियंत्रण / A1 स्कैन क्षेत्र" A1 स्कैन क्षेत्र उपकरण खोलने के लिए आदेश।
  5. स्कैनिंग शुरू करते हैं। इतना है कि स्कैन क्षेत्र के रूप में संभव zebrafish के रूप में ज्यादा से भर जाता है धुरी नियंत्रक का उपयोग करना, भ्रूण की स्थिति। लेजर शक्ति इस बिंदु पर इष्टतम होने की जरूरत नहीं है। लेजर शक्ति कम अनावश्यक photobleaching से बचने के लिए।
  6. एनडी अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष खोलने के लिए "देखें / अधिग्रहण नियंत्रण / एनडी अधिग्रहण" कमांड का प्रयोग करें।
  7. स्कैनिंग शुरू Z ढेर मानकों को स्थापित करने के लिए। जहां कोशिकाओं नहीं रह दिखाई दे रहे हैं करने के लिए जहां कोशिकाओं को ध्यान में नहीं कर रहे हैं Z ढेर ऊपरी सीमा और निचली सीमा निर्धारित करें। विकास और कोशिका आंदोलन के लिए नमूना ऊपर एक 3 माइक्रोन जगह है, जो इमेजिंग क्षेत्र में विस्तार कर सकते हैं के लिए अनुमति दें। इस समर्थक में दिखाया आंकड़े के लिए Z ढेरtocol भ्रूण पूंछ में 40 माइक्रोन की एक जेड गहराई से कवर किया।
  8. 2 माइक्रोन के लिए जेड अंतराल कदम आकार सेट करें। औसत पर, एक सेल व्यास में 10 माइक्रोन है; इसलिए 2 माइक्रोन का उत्पादन होगा इमेजिंग डेटा के पांच अंतराल प्रत्येक कक्ष के लिए विश्लेषण किया जा सके।
    नोट: छवि है कि प्राप्त किया जा सकता की गहराई Z अंतराल पर निर्भर करता है। जेड संकल्प संभव (बड़े Z गहराई) के रूप में बँटवारा के दौर से गुजर कई कोशिकाओं के रूप में छवि के क्रम में Z आयाम में समग्र गहराई हासिल करने के लिए बलिदान किया है। उलटा सच है, कि में, कदम आकार को कम करके, जेड संकल्प प्राप्त की है, जबकि जेड गहराई बलिदान है (छोटे जेड गहराई)।
  9. छवि की लेजर शक्ति, एचवी समायोजित करें, और ऑफसेट स्तरों। प्रयोगों इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन के लिए, निम्न लेजर शक्ति, एचवी उपयोग करते हैं, और ऑफसेट इसी स्तर पर क्रमश: सेट, GFP चैनल के लिए स्तर; 2 - 5, 120 - 140, और -11 को -9। mCherry चैनल के लिए, निम्न लेजर शक्ति, एचवी उपयोग करते हैं, और ऑफसेट का स्तर क्रमश:; 3 - 6, 120 - 140, और -3 के लिए-8। एक बार मानकों को स्थापित कर रहे हैं, अनावश्यक लेजर जोखिम है कि phototoxicity और नमूना की photobleaching कारण हो सकता है को रोकने के लिए स्कैन बंद।
  10. 2x लाइन औसतन आइकन का चयन करें। "नहीं औसतन" जबकि "4x लाइन औसतन" काफी समय स्कैन बढ़ जाती है एक दानेदार छवि पैदा करता है। 2x लाइन औसतन का उपयोग सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता और तेजी से स्कैन समय प्रदान करता है।
  11. उचित समय अंतराल और समय की अवधि के प्रयोग के लिए आवश्यक का चयन करें। जंगली प्रकार डिवीजनों के लिए, 2 घंटे के लिए दो मिनट का समय अंतराल mitotic अवधि (आंकड़े 1, 2, 3 ए, और 3 बी में प्रयुक्त) निर्धारित करने के लिए सबसे अच्छा है। डिवीजनों कि अब से 30 मिनट के लिए धुरी विधानसभा चौकी सक्रिय आदेश के रूप में चित्रा -3 सी में प्रदर्शन प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने में चार घंटे के लिए पांच मिनट के अंतराल के लिए अधिक उपयुक्त हैं।
  12. "फाइल करने के लिए बचाने के लिए" बॉक्स को चेक करें और के रूप में यह अधिग्रहण किया जा रहा है स्वचालित रूप से फ़ाइल को बचाने के लिए फ़ाइल नाम। दोहरी जांच सब देहातrameters सही ढंग से स्थापित और "रन शुरू" हिट रहे हैं।
  13. अधिग्रहण पूरा होने के बाद एक तीन आयामी प्रारूप में फाइल देखने के लिए, मात्रा सीमा आइकन पर क्लिक करें।

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Representative Results

चित्रा 2 एक अटल बिहारी जंगली प्रकार zebrafish पूंछ का एक व्यापक क्षेत्र दृश्य का उपयोग कर कई कोशिका विभाजन का निरीक्षण करने की क्षमता को दर्शाता है। सात ओवर mitotic कोशिकाओं को एक 14 मिनट की समय सीमा (1 मूवी) में imaged हैं। दो घंटा समय-पाठ्यक्रम के भीतर, 40 से अधिक mitotic घटनाओं पर कब्जा कर लिया गया था। औसत पर, 50 कोशिकाओं को विभाजित एबी में Aur बी एम / एम भ्रूण (चित्रा 2 बी) में 30 कोशिकाओं को विभाजित मनाया गया और। Imaged कोशिकाओं की संख्या, imaged गणना की गई (चित्रा -2) कोशिकाओं की संख्या के mitotic कोशिकाओं के अनुपात के लिए खाते में करने के लिए। यह आंकड़े बताते हैं वहाँ Aur बी एम / एम भ्रूण (चित्रा 2 बी), लेकिन कोशिकाओं के कम संख्या में बँटवारा के माध्यम से जा कोशिकाओं के एक कम संख्या imaged नहीं किया जा रहा है। इस तरह के रूप में की घटनाओं की एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नंबर हासिल करने की क्षमता सांख्यिकीय शक्ति में सहायता करेगा।

चित्रा 3 इस तकनीक पर फैलता है mitotic अवधि बढ़ाता शामिल करने के लिए। एक बार एक समय चूक सत्र अधिग्रहण कर लिया है, एक व्यक्ति के सेल ज़ूम उपकरण (चित्रा 3 ए, बी) का उपयोग करके पर्याप्त संकल्प के साथ बँटवारा में बिताए समय के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। Mitotic अवधि गिनती कितने समय अंतराल से एक कोशिका विभाजन को ले करके स्वयं भी गणना की जाती है। समय अंतराल की संख्या तो प्रत्येक Z ढेर के बीच समय के अंतराल से गुणा किया जाता है। उदाहरण के लिए, चित्रा -3 सी में, विभाजन के लिए 12 समय के अंतराल में ले लिया और प्रत्येक Z ढेर के बीच समय के अंतराल 2 मिनट था। इसलिए, इस सेल के लिए विभाजन के समय 24 मिनट था। औसत एबी जंगली प्रकार के विभाजन के समय 25 मिनट और aurB मी / मी के लिए 58 मिनट (चित्रा 3 बी) एक लंबे समय तक विभाजन के समय aurB मीटर के रूप में देखा। है / मी पता चलता है कि धुरी विधानसभा चौकी गलत गायो के कारण संतुष्ट नहीं किया गया हैtochore संलग्नक 1,2। जंगली प्रकार भ्रूण में तेजी से बढ़ी है पर एक करीब देखो ले रहा है, प्रत्येक mitotic चरण प्रतिष्ठित किया जा सकता है (चित्रा -3 सी, मूवी 2)। इसके अलावा, mitotic दोष aurB एम / एम भ्रूण जो mitotic गिरफ्तारी में शामिल हैं और एक binucleated सेल और एक micronucleus (चित्रा 3 डी, मूवी 3) के बाद के गठन में जिसके परिणामस्वरूप cytokinesis विफल रहा है में मनाया जा सकता है। इस mitotic दोष दिखा विश्लेषण में तेजी से बढ़ी वृद्धि हुई विभाजन के समय चित्रा 3 बी में अधिग्रहण का समर्थन करता है।

विभिन्न अन्य विविध mitotic दोषों और सेल भाग्य है कि चित्रा 4 में तलाश रहे हैं सामना हो सकता है; esco2 + / मी और esco2 एम / एम भ्रूण में प्रदर्शन किया। एक esco2 + / M भ्रूण में, गलत गुणसूत्र आंदोलनों कब्जा कर रहे हैं और congression दोष के रूप में परिभाषित किया जा सकताएस। Congression दोष होते हैं जब अनुचित microtubule संलग्नक बना रहे हैं। इन दोषों गुणसूत्रों की विफलता metaphase प्लेट की ओर पलायन करने के लिए प्रेरित करेगा। बनती बहन क्रोमेटिडों, न्यूनतम 20 और 46 में विशेष रूप से पहचाने जाने योग्य, कि metaphase प्लेट की ओर congressed नहीं किया है पहले, पर मिनट 14. एनाफ़ेज़ शुरुआत metaphase थाली के रूप में अच्छी तरह से सही करने के लिए बनती बहन क्रोमेटिडों पर गठबंधन बहन क्रोमेटिडों को अलग देखा जा सकता है मिनट 50. इसके अतिरिक्त में मनाया, संभव micronucleus गठन के रूप में इन अलग बहन क्रोमेटिडों नाभिक (टी = 50, चित्रा -4 ए, मूवी 4) के बाहर अलग-थलग रह मनाया जाता है। चित्रा 4 बी में, एक बहु-ध्रुवीय प्रभाग (मूवी 5) कल्पना की है। बहु-ध्रुवीय डिवीजनों अक्सर केंद्रपिंड प्रवर्धन के कारण होते हैं, लेकिन के माध्यम से अन्य 42 का मतलब हो सकता है। चित्रा 4C में, एक esco2 एम / एम सेल शुरू में समय से पहले बहन chromatid separat दर्शाता हैआयन और धुरी रोटेशन 9,43,44। एक और सेल भाग्य इस पैनल में प्रदर्शन एक anaphase पुल जिसमें merotelic संलग्नक अनसुलझे 45,46 हो रहा है। anaphase पुल पहले मिनट 62. पर देखा जा सकता है समय से पहले ही क्रोमेटिन decondense सेल cytokinesis के दौर से गुजर रहा है, जबकि करने के लिए प्रकट होता है। Cytokinesis रूप में होता है, दरार कुंड decondensed गुणसूत्रों पर impinges और अलगाव के रूप में होता है, एक anaphase पुल (चित्रा 4C, मूवी 6) के रूप में खींचतान क्रोमेटिन सामग्री। हालांकि आदेश सेलुलर भाग्य यों करने के लिए यहाँ नहीं दिखाया गया है, प्रत्येक फ्रेम में सभी mitotic डिवीजनों और सेल भाग्य के प्रकार वे दिखा रहे हैं रिकॉर्ड है। दर्ज की गई डिवीजनों की कुल संख्या से प्रत्येक के भाग्य में कोशिकाओं की संख्या फूट डालो और सेल भाग्य प्रतिशत की गणना करने के लिए 100 से गुणा करें।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल चित्र रेखांकित करें। (ए) (बी) के भ्रूण embedding प्रक्रिया के योजनाबद्ध ड्राइंग। इंजेक्शन भ्रूण dechorionated और anesthetized किया जाना चाहिए। भ्रूण तो coverslip नीचे डिश के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और अतिरिक्त E3 ब्लू निकाल दिया जाता है। कम पिघल अगर अलग प्रत्येक भ्रूण को कवर गुंबद बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है। भ्रूण ओरिएंट इसलिए पूंछ coverslip के सबसे करीब है। पूरे coverslip को कवर अगर जोड़ने से पहले दो मिनट रुको। जब तक अगर छवि के लिए जाने से पहले जम जाता है रुको। (सी) योजनाबद्ध ड्राइंग शर्तों जेड अंतराल, जेड ढेर, जेड गहराई से, समय अंतराल, समय की अवधि और 5 डी है कि प्रोटोकॉल और चर्चा में उपयोग किया जाता है परिभाषित करने के लिए। जेड अंतराल प्रत्येक छवि माइक्रोस्कोप नमूना में गहरी चाल के रूप में एक जेड ढेर बनाने के लिए बीच की दूरी के रूप में परिभाषित किया गया है। जेड ढेर एक के माध्यम से लिया छवियों के सभी हैपरिभाषित जेड अंतराल पर नमूना। दूरी एक जेड ढेर में कूच Z गहराई से परिभाषित करता है। समय अंतराल एक Z ढेर और अगले Z ढेर एक समय चूक छवि बनाने के लिए बीच के समय की राशि है। समय अवधि छवि के लिए इस्तेमाल समय की कुल राशि है। 5 डी आयाम के रूप में परिभाषित किया गया है एक्स, वाई, जेड, समय, और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. समय चूक इमेजिंग एक लाइव zebrafish भ्रूण में एकाधिक mitotic घटनाओं कब्जा। (ए) एक अटल बिहारी प्रकार के जंगली में बाहर तेजी से बढ़ी प्रयोग से समय व्यतीत हो जाने के पोस्टरों, 24 HPF कई mitotic घटनाओं दिखा zebrafish। तारों के बँटवारा में सात कोशिकाओं की ओर इशारा करते हैं। टी मिनट में गुजरे समय =। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (बी) mitotic सीई की संख्या24 HPF पर अटल बिहारी और aurB एम / एम zebrafish पूंछ में मनाया lls। ± सेंट मतलब है। देव।, एन = 3 भ्रूण / जीनोटाइप। (सी) अटल बिहारी और aurB एम / में कोशिकाओं की कुल संख्या प्रति mitotic कोशिकाओं का अनुपात 24 HPF पर zebrafish पूंछ हूँ। ± सेंट मतलब है। देव।, एन = 3 भ्रूण / जीनोटाइप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. व्यक्तिगत सेल विश्लेषण कब्जा प्रत्येक mitotic चरण और mitotic अवधि। (ए) अटल बिहारी जंगली प्रकार के व्यापक क्षेत्र दृश्य से चयनित एक सेल, 24 HPF zebrafish भ्रूण चित्रा 2A में दिखाया गया है। (बी) डिवीजन समय अटल बिहारी के लिए मनाया जाता है और aurB मी / मी कोशिकाओं और गणना की परमाणु लिफाफा BRE inferring सेakdown (चंचु) पहली दो नए बेटी कोशिकाओं के गठन के लिए एक सेल में संघनित क्रोमेटिन के अवलोकन पर। एन = 3 भ्रूण / जीनोटाइप, एन = एबी के लिए 66 डिवीजनों, एन = aurB मी / मी के लिए 29 डिवीजनों, *** पी मूल्य <0.001। (सी) अटल बिहारी जंगली प्रकार के सेल के माध्यम से बँटवारा चरण प्रगति कल्पना करने के लिए फसली है । टी = मिनट। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (डी) aurB मी / मी सेल बँटवारा जो mitotic cytokinesis विफलता और micronuclei गठन में जिसके परिणामस्वरूप गिरफ्तारी के माध्यम से शामिल mitotic प्रगति कल्पना करने के लिए फसली है। तीर micronuclei की ओर इशारा करते हैं। टी मिनट में गुजरे समय =। स्केल बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4।सिंगल सेल इमेजिंग लाइव एकाधिक mitotic क्रोमोजोम पृथक्करण और डिवीजन mitotic उत्परिवर्ती में साथ जुड़े दोषों कब्जा Zebrafish। (ए) एक एक सेल एक esco2 + / M भ्रूण में congression दोषों के दौर से गुजर की छवि फसली। पतली तीर छोड़ दिया गुणसूत्र कि metaphase थाली में वापस खींच लिया है पर नज़र रखता है। मोटी तीर सही गुणसूत्र है कि metaphase थाली में वापस खींच लिया और एक micronucleus के लिए फार्म का पता नहीं लगाया नजर रखता है। डबल तीर सही गुणसूत्र कि anaphase शुरुआत में कांग्रेस नहीं था की जुदाई से पता चलता है। Insets गुणसूत्रों कि कांग्रेस करने में विफल के विचारों में तेजी से बढ़ी दिखा। Insets फसली थे और चमक बेहतर दृश्य के लिए बढ़ाया। CAAX प्रतिदीप्ति और अधिक आसानी से गुणसूत्रों कल्पना करने के लिए हटा दिया गया था। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (बी) के एक mitotic गिरफ्तारी है कि एक esco2 में एक बहु-ध्रुवीय संभाग में परिणाम के दौर से गुजर एक सेल की छवि फसली + / मी भ्रूण। स्केल बार = 5 माइक्रोन। (सी) एक एक सेल के दौर से गुजर सामंजस्य थकान anaphase पुल गठन के धागे की तरह कोष्ठक द्वारा नोट दो नाभिक के बीच खींच कर देखा, जिसके परिणामस्वरूप के फसली छवि। स्केल बार = 5 माइक्रोन। टी = समय मिनट में गुजरे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्म 1
मूवी 1. एकाधिक कोशिका विभाजन एक इंजेक्शन जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण की एक विस्तृत दृश्य में देखे जा सकते हैं (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)।

फिल्म 2 मूवी 2. बँटवारा के चरण आसानी से एक जंगली प्रकार zebrafish भ्रूण में देखे जा सकते हैं (आर ight डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। परमाणु लिफाफा टूटने नाभिक और बहन क्रोमेटिडों की congression की ओर आय का अनियमित उपस्थिति से अनुमान लगाया जाता है एक metaphase प्लेट फार्म के लिए । सटीक अलगाव होता है और दो नए बेटी कोशिकाओं पैदावार।

मूवी 3
मूवी 3. का लाइव इमेजिंग aurB एम / एम भ्रूण का पता चलता है गुणसूत्र मिसegregation, cytokinesis विफल रहा है, और micronuclei गठन (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। परमाणु लिफाफा टूटने नाभिक की अनियमित उपस्थिति से अनुमान लगाया जाता है, गुणसूत्रों एक उचित metaphase प्लेट फार्म, और आगे बढ़ने के लिए विभाजन का विस्तार अक्ष पर बारी बारी से करने में असमर्थ विपरीत ध्रुवों को तितर बितर सेल का समय है। Cytokinesis एक 4N सेल और कई micronuclei में जिसके परिणामस्वरूप उत्पन्न नहीं होती है।

मूवी 4
मूवी 4. Congression दोष एक में मनाया जाता है esco2 + / M भ्रूण (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। परमाणु लिफाफा टूटने नाभिक की अनियमित उपस्थिति से अनुमान लगाया जाता है। बाद metaphase प्लेट का गठन किया है, कुछ भारतीयोंvidual गुणसूत्रों दोनों ओर से तितर बितर। बाईं ओर से एक व्यक्ति गुणसूत्र के अंत में, जबकि सही करने के लिए गुणसूत्र metaphase थाली के बाहर रहता है और anaphase की शुरुआत में बहन क्रोमेटिडों को अलग देखा जा सकता है metaphase थाली में वापस खींच लिया है। सेल एक लंबे समय तक विभाजन के समय, लेकिन संभावित micronucleus गठन के साथ परम विभाजित दर्शाती है।

मूवी 5
मूवी 5. बहु-ध्रुवीय डिवीजन एक esco2 + / M भ्रूण में मनाया जाता है (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। परमाणु लिफाफा टूटने नाभिक की अनियमित उपस्थिति से अनुमान लगाया जाता है और फिर गुणसूत्रों एक वाई-आकार indicativ फार्म का विलय3-धुरी डंडे के ई। सेल एक लंबे समय तक विभाजन के समय को दर्शाती है, लेकिन अंतत: 3 बेटी कोशिकाओं में बिताते हैं।

मूवी 6
मूवी 6. समय से पहले बहन chromatid जुदाई और anaphase पुल गठन एक esco2 एम / एम भ्रूण में मनाया जाता है (सही डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। परमाणु लिफाफा टूटने नाभिक की अनियमित उपस्थिति से अनुमान लगाया जाता है और फिर गुणसूत्रों सेल एक फार्म करने में असमर्थ भर में तितर बितर उचित metaphase थाली। क्रोमेटिन cytokinesis करने से पहले और सेल विभाजन के रूप में decondenses, दो कोशिकाओं के बीच एक पुल anaphase बनाता है।

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Discussion

इस विधि के प्रयोग से एक परमाणु लिफाफा टूटने, microtubule-kinetochore संलग्नक द्वारा एक मेटाफ़ेज़ प्लेट के गठन, और बहन क्रोमेटिडों के अलगाव अनुमान करने के लिए विवो में और एक समय पर निर्भर तरीके से दो नई कोशिकाओं के रूप में करने की अनुमति देता है। zebrafish में बँटवारा पालन करने की क्षमता तय नमूने और सेल संस्कृति प्रणालियों पर फायदेमंद है क्योंकि कोशिकाओं प्राकृतिक शरीर क्रिया विज्ञान में imaged किया जा रहा है, ऊतक पारदर्शी जो की अनुमति देता है के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का इस्तेमाल किया जा सकता है, वे अपेक्षाकृत तेजी से विकसित करने, और समय चूक इमेजिंग हासिल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए वयस्क zebrafish का उपयोग सीमित Z गहराई से मोटा ऊतक है कि त्वचा या आंखों नहीं है की वजह से हासिल किया जा सकता है की वजह से प्रतिबंधित है। ट्रांसजेनिक H2A.F / Z-EGFP और mCherry-CAAX व्यक्त जानवरों को एक ही उद्देश्य है, बहुमुखी प्रतिभा और आसानी mRNA इंजेक्शन के विभिन्न उत्परिवर्ती zebrafish में लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि आनुवंशिक पार से ज्यादा फायदेमंद है। स्थितियों में जहां mitotic विश्लेषण हैतीन दिनों के बाद निषेचन (DPF) या बाद भ्रूण में आवश्यक है, ट्रांसजेनिक जानवरों के इस तेजी से विकसित जीव में शाही सेना के आधा जीवन के कारण आवश्यक होगा।

बँटवारा visualizing के लिए अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन इस प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी हैं। उदाहरण के लिए, H2B-GFP mRNA क्रोमेटिन के लिए H2A.F करने के लिए / Z-EGFP एक विकल्प है, और इसी तरह की लेबलिंग प्रदान करता है। अन्य फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन है कि इस तकनीक में इस्तेमाल किया जा सकता POM121, centrin, Eb1, Hec1, और EMTB जो क्रमशः परमाणु लिफाफा, centrioles, प्लस अंत सूक्ष्मनलिकाएं, kinetochore, और सूक्ष्मनलिकाएं का जीना में भ्रूण इमेजिंग के लिए अनुमति होगी, शामिल 32,47-51।

इस प्रोटोकॉल कई महत्वपूर्ण इमेजिंग कदम है कि गुणवत्ता के परिणाम प्राप्त करने के लिए निष्पादित किया जाना चाहिए है: 1) प्रतिभाशाली प्रतिदीप्ति और संभव के रूप में कोई विषाक्तता उपज के लिए mRNA गुणवत्ता और एकाग्रता का अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करें। अधिक प्रतिदीप्ति कम लेजर जोखिम और इसलिए, कम photoblea को बढ़ावा मिलेगाचिंग और phototoxicity। 2) भ्रूण पूरी तरह से anesthetized और अगर में सुरक्षित किया जाना चाहिए। माइनर आंदोलनों परिणाम बदल जाएगा और प्रयोग बर्बाद कर सकता है। 3) अगर एकाग्रता के लिए भ्रूण के मंच imaged किया जा करने के लिए वांछित उपयुक्त होना चाहिए। 24 HPF पर और आगे, 1% कम पिघल agarose उपयुक्त है। 12 HPF पर इमेजिंग या इससे पहले, एक 0.3% agarose समाधान 39 प्रयोग किया जाना चाहिए। 4) भ्रूण में रॉय संभव के रूप में coverslip करने के लिए करीब के रूप में होना चाहिए। यह कदम एक सीमा नहीं है पूंछ इमेजिंग के लिए। आंखों, त्वचा, पृष्ठीय क्षेत्र, जर्दी, और फिन गुना अन्य क्षेत्रों है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं के उदाहरण हैं।

समय को परिभाषित करने और पहलू है कि इमेजिंग तय भ्रूण या ऊतकों से इस प्रोटोकॉल से अलग करती है। जब जेड ढेर, जेड अंतराल, समय चूक अंतराल, और समय चूक अवधि की स्थापना, यह ध्यान में प्रयोग (चित्रा 1 सी) के संदर्भ में रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक जंगली प्रकार कोशिका विभाजन आमतौर पर 24 HPF पर लगभग 25 मिनट तक रहता है। वें मेंउदाहरण है, एक 2 माइक्रोन जेड अंतराल में दो घंटे के लिए एक दो मिनट का समय अंतराल के साथ एक जेड ढेर में ऊतक के 40 माइक्रोन, कवर प्रभावी साबित कर दी है। इसके अलावा, दोषपूर्ण बँटवारा के साथ भ्रूण में, एक mitotic गिरफ्तारी में कोशिकाओं को सबसे अधिक संभावना मौजूद है, हो सकता है काफी कोशिका विभाजन के समय बढ़ रही है। कई पूर्ण डिवीजनों प्राप्त करने के लिए, समय की अवधि 4 घंटा की वृद्धि हुई किया जाना चाहिए, यानी, 2 घंटा से। एक लंबे समय तक अधिग्रहण के समय अधिक लेजर शक्ति के लिए नमूना बेनकाब और photobleaching और phototoxicity का खतरा बढ़ जाएगा। इस मामले में, प्रत्येक Z ढेर के बीच समय अंतराल वृद्धि की जानी चाहिए। गतिशील गुणसूत्र आंदोलनों जेड के ढेर के बीच समय अंतराल में वृद्धि से बलिदान कर दिया जाएगा, लेकिन समय की अवधि का फायदा हुआ है। कोशिका विभाजन है कि दो से अधिक मानव संसाधन पिछले कर सकते हैं जब इमेजिंग यह आवश्यक है।

हालांकि यह सीधे चर्चा नहीं हुई, इस प्रोटोकॉल Z विमान में एक उच्च संकल्प छवि प्राप्त करने के लिए और अधिक सही व्यक्ति गुणसूत्र मो कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकताvements। उदाहरण के लिए, चित्रा -4 ए में दो missegregated गुणसूत्रों मनाया जाता है। सही (मोटी तीर द्वारा नोट) के लिए गुणसूत्र शुरू में उज्ज्वल है और ध्यान में है लेकिन पिछले कुछ फ्रेम में dims। एक 2 माइक्रोन जेड अंतराल के साथ, uncongressed गुणसूत्र जेड अंतराल के बीच में पड़ता है। कैप्चरिंग मिनट आंदोलनों और विलक्षण गुणसूत्र घटनाओं Z विमान में संकल्प में वृद्धि से पूरा किया जा सकता है। ऐसा करने के लिए, एक व्यक्ति के सेल A1 स्कैन क्षेत्र उपकरण का उपयोग करने पर ज़ूम। जब Z ढेर मानकों को स्थापित करने, एक छोटे जेड अंतराल दूरी का उपयोग करें। 1 माइक्रोन - एक सिफारिश की सीमा 0.5 है। इसके अलावा, प्रत्येक जेड ढेर के बीच समय अंतराल को कम दो मिनट से 30 सेकंड के लिए प्रत्येक समय सीमा के बीच सहज संक्रमण पैदा करेगा, यानी, - 1 मिनट। इमेजिंग के इस प्रकार के एक चेतावनी सीमित जेड गहराई है कि प्राप्त किया जा सकता है। छोटे जेड अंतराल और समय अंतराल के कारण, अधिक ऊतक एक छोटे समय सीमा में पराबैंगनीकिरण से अवगत कराया जाएगा। इस, एसएम काबू पाने के लिएAller समय की अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि यह भी है कि लंबे समय तक शोधकर्ता डिवीजनों पर कब्जा करना चाहते हैं पर निर्भर है।

एक सादृश्य है कि इन संशोधनों के साथ मदद मिल सकती है एक accordion के रूप में एक जेड ढेर के बारे में सोचना है। धौंकनी की प्रत्येक pleat के बीच की दूरी जेड अंतराल है और जेड गहराई accordion की लंबाई का प्रतिनिधित्व करती है। एक उदाहरण है जहाँ एक (बढ़ जाती है जेड गहराई) नमूना करने के लिए किसी भी अधिक लेजर जोखिम अर्जित करने के लिए, accordion हिस्सों के रूप में नहीं चाहेगा में, धौंकनी (जेड-अंतराल) की pleats के बीच की दूरी के रूप में अच्छी तरह से वृद्धि होगी। उलटा कि accordion अनुबंध के रूप में सच है, जेड गहराई कम हो जाती है। धौंकनी अनुबंध की pleats के रूप में अच्छी तरह से, जेड अंतराल में कमी करने के लिए इसी। इस सादृश्य तय की और लाइव नमूने के लिए लागू किया जा सकता है। जटिलता इस प्रोटोकॉल में बढ़ जाती है जब समय समीकरण को जोड़ा जाता है। वहाँ समय है कि accordionist बढ़ाने या accordion अनुबंध कर सकते हैं की एक निश्चित राशि है। इस प्रतिनिधिसमय अंतराल TS। आदेश कवर करने के लिए और अधिक दूरी (जेड गहराई) समय अंतराल में वृद्धि होगी। साथ ही, आदेश में और अधिक संगीत सुनने के लिए, एक समय (समय अवधि) की एक लंबी राशि इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में, सुनना चाहिए और अधिक कोशिका विभाजन के गवाह करने के क्रम में, समय की अवधि में वृद्धि होगी। एक समझौता पहलू को ध्यान में रखना है कि खेला जाता है कि अधिक संगीत, अधिक थक accordionist। यह अंतिम आयाम, प्रतिदीप्ति के अनुरूप है। अधिक लेजर जोखिम नमूना दिया जाता है, और अधिक photobleaching और phototoxicity (थकान) एक मुद्दा बन जाता है।

सारांश में, इस प्रोटोकॉल एक लाइव zebrafish भ्रूण अलग विश्लेषण के लिए लागू में सूत्रीविभाजन कल्पना करने के लिए एक विधि ब्यौरा क्या है; 1) डिवीजन नंबर 2) विभाजन के समय 3) विभाजन भाग्य और 4) उच्च संकल्प क्रोमेटिन गतिशीलता। गतिशीलता तारककेंद्रक को microtubule-kinetochore संलग्नक से लेकर mitotic घटकों visualizing के लिए कई संभावनाओं के लिए लागू किया जा सकता है। की क्षमता का मेलzebrafish में जीनोम संपादन में हाल के अग्रिमों के साथ vivo में इमेजिंग बँटवारा यह आसान बँटवारा के विभिन्न पहलुओं में म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए एक कशेरुकी जीव 25,26,52-56 में मानव रोग मॉडल के लिए कर देगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
pCS2 vectors Gift from K. Kwan For plasmid of interest
NotI-HF restriction enzyme New England BioLabs R3189S For restriction digest of plasmid
mMessage SP6 kit Life Technologies AM1340 For in vitro transcription
RNeasy Mini kit Qiagen 74104 For purifying mRNA
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 For housing embryos
microinjection mold homemade For holding embryos during microinjection
Agarose II Amresco 0815-25G For embedding embryos
Tricaine Sigma-Aldrich E10521-10G For anesthetizing embryos
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S9888 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich C8106 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Magnesium Sulfate Fisher Scientific M7506 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
Methylene Blue Hydrate Sigma-Aldrich MB1 For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O
100 mm culture tube Fisher Scientific 50-819-812 For melted agar
35 mm glass coverslip bottom culture dish  MatTek Corp P35G-0-20-C  No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos
#5 tweezers Dumont 72701-D For dechorionating embryos
21 G 1 1/2 gauge needle Becton Dickinson 305167 For positioning embryos in agar
Dissecting microscope Nikon AZ100 For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do
Confocal microscope Nikon A1+ For time-lapse imaging
Confocal software NIS Elements AR 4.13.00 For image acquisition and processing

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References

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एक लाइव zebrafish भ्रूण में mitotic डिवीजन और गतिशीलता अवलोकन
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Percival, S. M., Parant, J. M.… More

Percival, S. M., Parant, J. M. Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (113), e54218, doi:10.3791/54218 (2016).

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