Abstract
A mitose é essencial para o crescimento do organismo e diferenciação. O processo é muito dinâmico e requer ordenou eventos para realizar a condensação adequada cromatina, o apego microtúbulos-kinetochore, segregação cromossômica, e citocinese em um pequeno período de tempo. Erros no delicado processo pode resultar em doenças humanas, incluindo defeitos de nascença e câncer. As abordagens tradicionais investigam estados de doença mitótico humanos muitas vezes dependem de sistemas de cultura celular, que não têm a fisiologia natural e contexto de desenvolvimento / específicas do tecido vantajoso quando estudar doenças humanas. Este protocolo supera muitos obstáculos, fornecendo uma forma de visualizar, com alta resolução, a dinâmica de cromossomos em um sistema de vertebrados, o peixe-zebra. Este protocolo irá detalhar uma abordagem que pode ser usada para obter imagens dinâmicas de células em divisão, que incluem: a transcrição in vitro, produção de peixe-zebra / registo, a incorporação de embrião e de imagem time-lapse. Otimização e modifications deste protocolo também são explorados. Usando H2A.F / Z-EGFP (etiquetas cromatina) e mCherry-CAAX (membrana celular etiquetas) embriões com injecção de mRNA, mitose em AB-tipo selvagem, auroraB hi1045 e hi2865 ESCO2 peixe-zebra mutante é visualizado. Alta resolução de imagem ao vivo no peixe-zebra permite observar várias mitoses quantificar estatisticamente defeitos mitóticas e tempo de progressão da mitose. Além disso, a observação de aspectos qualitativos que definem processos inadequados de mitose (ou seja, defeitos congression, segregação errada dos cromossomas, etc.) e os resultados cromossômicas imprópria (isto é, a aneuploidia, poliploidia, micronúcleos, etc.) são observados. Este ensaio pode ser aplicado para a observação de tecido diferenciação / desenvolvimento e é receptivo à utilização de peixe-zebra mutante e agentes farmacológicos. Visualização de como defeitos na mitose levar a distúrbios de câncer e de desenvolvimento será muitomelhorar o entendimento da patogênese da doença.
Introduction
A mitose é essencial um processo celular fundamental para o crescimento, a diferenciação e regeneração de um organismo vivo. Após a preparação exacta e a replicação de ADN na interfase, a célula é preparado para dividir. A primeira fase da mitose, profase, é iniciada por activação de ciclina B / Cdk1. Prophase é caracterizada por condensação de material cromatina em cromossomas. repartição envelope nuclear ocorre na zona de transição entre a profase e prometáfase. Em prometáfase, centrossomas, o centro de nucleação para a formação do fuso, começam a migrar para os pólos opostos enquanto estende microtúbulos em busca de apego kinetochore. Após a fixação, as conversões ao fim-on fixação dos microtúbulos e forças de tensão orientar os cromossomos que formam uma placa metafásica 1. Se todos os cromossomos estão ligados corretamente, o ponto de verificação de montagem do fuso é satisfeito, anéis coesina segurando as cromátides irmãs em conjunto são clivados, e microtúbulos encurtar a puxar irmãchromatids para pólos opostos durante anaphase 2,3. A fase final, telofase, envolve o alongamento da célula e reformação do envelope nuclear em torno dos dois novos núcleos. A citocinese completa o processo de divisão, separando o citoplasma das duas células filhas novas 4-6. Alteração das vias principais de mitose (ou seja, ponto de verificação de montagem do fuso, a duplicação centrossoma, irmã chromatid coesão, etc.) Pode resultar em prisão metaphase, segregação errada dos cromossomas e instabilidade genômica 7-10. Em última análise, os defeitos nas vias mitose controle pode causar distúrbios do desenvolvimento e câncer, necessitando de visualização de mitose e seus defeitos em um, animal vertebrado, organismo multicelular vivo 10-16.
embriões de peixe-zebra servir como um grande organismo modelo para imagens ao vivo devido ao tecido transparente, facilidade de microinjeção, e desenvolvimento rápido. Usando peixes-zebra, o objetivo geral deste artigo é o dedescrevem um método de 5D vivo (dimensões X, Y, Z, tempo, e comprimento de onda) imagiologia de mitose 17 (Figura 1C). O uso de peixe-zebra mutante defeituoso em diferentes vias mitóticas demonstram a consequência de tais defeitos. Para este protocolo, Aurora B e ESCO2 mutantes foram escolhidos para ilustrar esses defeitos. Aurora B é uma cinase que é parte do complexo do cromossoma de passageiros (CPC) envolvida na formação do fuso e do acessório de microtúbulos. Ele também é necessário para a formação de clivagem sulco na citocinese 18,19. Em peixe-zebra, a deficiência de Aurora B leva a defeitos de indução sulco, citocinese, e segregação cromossomo 20. ESCO2, por outro lado, é uma acetiltransferase que é essencial para a irmã cromatídeos coesão 21,22. Ele acetila cohesin na parte SMC3 do anel estabilizando assim cohesin para garantir a segregação cromossômica adequada na transição metaphase-anaphase 23. Perda de ESCO2 no peixe-zebra leva ao chsegregação errada romosome, irmã separação prematura chromatid, instabilidade genômica e dependente de p53 e apoptose independente 24,25. Devido à disponibilidade, auroraB hi1045 e hi2865 ESCO2 peixe-zebra mutante (doravante referida como aurB m / m e ESCO2 m / m, respectivamente) será usada para ilustrar esta técnica 25-27.
Acoplamento microscopia confocal com maquinaria da célula fluorescente marcado com permitiu visualizar os investigadores a cromatina e a dinâmica da membrana celular durante a mitose 25,28,29. histonas fluorescentes etiquetadas têm sido historicamente usado para visualizar cromatina. As histonas são proteínas nucleares compostas por quatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, e H4), que são responsáveis pela estrutura do nucleossoma que compõe 30 cromossomas. Enquanto H2B é indiscutivelmente a histona mais utilizado para proteínas fluorescentes emrato e a cultura de células, a utilização de Histona 2A, Z Família (H2A.F / Z) revelou-se bem para o uso em peixes-zebra 31,32. Concanavalina A e de caseína-quinase 1-gama por exemplo, localizar na membrana celular e que tenham sido previamente mostrado eficaz em visualizar a membrana celular em Drosophila e ouriços-do-mar 33,34. Outros estudos têm mostrado que a proteína fluorescente marcado com CAAX rotula a membrana celular e foi bem sucedido em peixes-zebra 31. CAAX é um motivo que é reconhecida por enzimas modificadoras de pós-traducionais tais como farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modificações por estas enzimas proteínas causar a tornar-se associada a membrana, rotulagem, assim, a membrana da célula 35.
Devido ao uso prévio no peixe-zebra, este protocolo escolheu usar H2A.F / Z e CAAX para rotular cromatina e da membrana celular. A aplicação do presente método permitirá que o investigador para monitorar a mitose ao nível da célula individual ao observar cromossomadinâmica, como monitorar bem como, simultaneamente múltiplas divisões celulares que podem afetar a diferenciação e desenvolvimento do tecido. Este artigo irá se concentrar em imagiologia a dinâmica da segregação dos cromossomos durante a mitose no nível da célula individual. Dentro deste manuscrito, a capacidade de observar várias divisões mitóticas, calcular o tempo de divisão, e decifrar os fenótipos mitóticas serão ilustradas e discutidas. Ao usar estes parâmetros, fisiologicamente relevantes de dados pode ser recolhido e aplicado a vários estados de doenças afectadas por defeitos mitóticas.
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Protocol
1. transcrição in vitro
- Linearizar pCS2-H2A.F / Z-EGFP e / ou vetores pCS2-mCherry-CAAX por restrição NotI enzima digerir 31. Utilizando um kit de ARN in vitro a transcrição, gerar produtos 5 'de ARNm tapados de cada molde, de acordo com o protocolo do fabricante.
- Purifica-se o ARNm utilizando um kit tapados purificação. Siga as instruções do fabricante. Eluir com livre de RNase H 2 O.
- Determinar a concentração de ARN por absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. (OD 260 x diluição x 40 ug / ml).
- Diluir o RNA a 100 ng / mL para cada H H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX com RNase 2 O. Se a concentração de ARN é muito baixa, a fluorescência será diminuído ou ausente. amostras brilhantes vai diminuir as preocupações sobre a fototoxicidade e fotodegradação. Por outro lado, o excesso de ARN podem ser tóxicos e / ou causar efeitos fora do alvo.
Nota: guarde o restantemRNA purificado de -80 ° C congelador.
2. Criação de peixe-zebra, colheita de embriões, e mRNA Injection 36-38
- Montar tanques de criação com uma barreira para separar o tanque em duas regiões e encher cada tanque de criação com água sistema de aquicultura utilizados na instalação de peixe-zebra.
- A fim de evitar a reprodução prematura, coloque dois peixes machos em um lado da barreira e dois peixes feminina do outro lado da noite antes de produzir.
- No dia seguinte, descongelar a mistura previamente preparada de ARNm em gelo. Substitua a água em tanques de criação com água sistema de aquicultura frescos e remover as barreiras. Imediatamente após as barreiras são puxados, aquecer um molde de injecção de 28,5 ° C e configurar o equipamento para microinjecção.
Nota: Para obter informações sobre moldes de injeção, consulte Gerlach 36. - Recolher os ovos a cada 10 - 15 minutos utilizando um coador de chá e lavar os ovos em um 100 x 15 mm de prato limpo Petri com E3 Azul (5 mM de NaCl, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33, MgSO4 0,33 mM, 10 -5% azul de metileno). E3 azul é utilizado para evitar o crescimento de fungos e garantir o correcto desenvolvimento de larvas de peixes. Para mais informações sobre o acasalamento e de colheita de embriões, consulte Gerlach 36 e Porazinkski 37.
- Incorporar uma célula-encenado embriões num molde de injecção aquecido e injectar o ARN na gema no valor desejado de embriões (Figura 1A). Conta de morte embrionária natural e embriões não fertilizados por realizar injeções embrionárias em 15% mais embriões do que o necessário para o experimento. Para detalhes adicionais sobre a microinjeção de embriões de peixe-zebra, consulte Gerlach 36 e Porazinkski 37.
NOTA: Para uso pela primeira vez de mRNA, realizar uma análise de dose-curva para determinar a dose ideal para a fluorescência e viabilidade (definida como ausência de defeitos de desenvolvimento brutas até 5 dpf) antes da realização de imagiologia 5D. 150-200 ng / ulinjectado em embriões é muitas vezes a concentração óptima, portanto, é um bom ponto de partida para a concentração final. - Cuidadosamente extrair os embriões injectados desde o molde usando uma versão modificada 9 "pipeta de Pasteur de vidro. Para modificar a pipeta, derreter a fim usando um bico de Bunsen até formar uma bola.
- Coloque embriões injetados em um prato de 100 x 15 mm Petri na E3 azul e casa em um C incubadora de 28,5 °.
- Seis horas após a injecção, retire todos os embriões mortos ou não fertilizados das placas e adicionar E3 azul limpo. Casa dos embriões em 28,5 ° C.
3. Preparação e incorporação da Vivo embriões Zebrafish for Imaging (Figura 1B)
- Duas horas antes de imagem, a tela de embriões injectados para GFP, utilizando um microscópio de dissecação fluorescente. Coloque embriões verdes brilhantes que expressam GFP em uma nova placa de 100 mm x 15 Petri com E3 Azul.
- Levar à ebulição uma solução de stock de 1% de agarose de baixa de fusão através da adição de 1 g de agarose a baixo ponto de fusão a 100 ml de E3 azul. Depois de usar a agarose, cobrir o balão com folha de alumínio. A solução permanece útil para até um mês.
- Aliquota de 3 ml de agar derretido em um tubo de cultura de 17 x 100 mm. Manter a quente de agarose, colocando o tubo de cultura em um banho de água a 42 ° C até que esteja pronto para uso. Preparar uma solução de 15 tricaina mM em água deionizada para anestesiar os embriões de peixe-zebra 36.
NOTA: Se imagiologia em pontos de tempo anteriores é desejada, a concentração de ágar pode ser diminuída tão baixo quanto 0,3% 39. - Trazer o mM tricaina 15, embriões selecionados, baixo agarose fundido, E3 Azul, e uma 35 milímetros lamela de vidro cultura fundo prato para um microscópio de luz dissecção. Remova cuidadosamente córion do embrião com # 5 pinças. Faça isso por três embriões.
- Colocar os embriões dechorionated num recipiente separado a ser anestesiado. A tampa da placa de fundo lamela é frequentemente utilizado para este fim. Usando uma pipeta de transferência, adicione três gotas (cerca de 150 mL)tricaina de 15 mM para o prato de 5 ml E3 azul (se utilizar a tampa da lamela prato inferior) ou até os embriões foram suficientemente anestesiados. Além disso, adicionar 3-4 gotas (cerca de 150-200 ul) de 15 mM de solução tricaina ao tubo de agarose fundida a 1%.
- Usando uma pipeta de p200 com 1 cm da ponta da pipeta cortada; transferir os embriões anestesiados para o prato de fundo lamela. Remova qualquer E3 Azul excesso: solução tricaina.
- Lentamente, adicionar 5 - 10 jul de agarose de baixo ponto de fusão: solução tricaina ao longo dos embriões, mantendo cada gota separada para assegurar que os embriões não acidentalmente deriva perto um do outro.
Aviso: Se a agarose é muito quente, ele irá danificar o embrião. Uma boa temperatura para manter o agar é a 42 ° C. - Usando uma agulha de 21 G 1 ½, gentilmente orientar o embrião no agarose para a posição desejada. Ao usar um microscópio invertido para geração de imagens de lapso de tempo, oriente a região de interesse (ROI) tão perto da lamela como possible.
Nota: Para fins gerais, a região da cauda oferece facilidade de orientação e clareza devido ao tecido relativamente fino (Figura 1A). Outros tecidos, tais como a camada epitelial em torno das pregas de gema e de aleta, pode ser utilizada 28,29. Estes tecidos oferecem grande clareza, no entanto estas regiões são apenas algumas camadas de células de espessura. Para o propósito deste protocolo, é benéfico para a imagem região da cauda para adquirir como muitas divisões celulares quanto possível. - Permitir que um min poucos para a solidificação parcial do ágar. Usar a agulha para separar um pequeno pedaço de ágar para testar a sua solidificação. Quando um pedaço de agar pode ser puxado para fora da gota, prossiga para a próxima etapa.
- Cobrir toda a lamela com baixa agar fundido formando uma cúpula sobre os embriões embutidos. Permitir que o agar solidificar antes de mover o prato para imagiologia confocal (Figura 1A).
- Durante o processo de solidificação de agar (demora cerca de 10 min), 3 ml de o prepararf E3 solução azul com cinco gotas de (aproximadamente 250 ul) tricaina 15 mM a ser colocada sobre os embriões incorporados durante o exame.
4. 5D Imagem Confocal de US Jogos de embriões Zebrafish 40,41
NOTA: Ver Ariga 40 e O'Brien 41 para detalhes sobre como realizar imagem 5D usando outros sistemas confocal. Para Z-intervalo, Z-pilha, profundidade Z, intervalo de tempo, e definições 5D ver Figura 1C.
- Abra o software de imagem e definir o microscópio para 60X NA 1.4 lente objetiva. Aplicar óleo de imersão para a lente objetiva e coloque o prato de cultura no compartimento de slides no palco microscópio. Usando o controlador de eixo, o centro do embrião de interesse acima da lente objectiva e trazer a lente objectiva para cima ao encontro do prato de cultura.
- Clique no ícone da parte do olho e mudar para o filtro GFP no microscópio. Concentre-se no ROI. Centrando-se no tecido mais próximo da lamela será offer os melhores resultados de imagem.
- Remova o encravamento. Selecionar os canais de GFP e mCherry (comprimentos de onda pré-estabelecidos em software) e definir a linha de opção ao normal média.
- Use "Controles de Ver / Aquisição / A1 Área de Digitalização" comando para abrir a ferramenta A1 Área de Digitalização.
- Iniciar a digitalização. Usando o eixo-controlador, posicionar o embrião de modo que a área de leitura é preenchido com tanto do peixe-zebra quanto possível. A potência do laser não precisa de ser óptima a este ponto. Diminuir a potência do laser para evitar a fotodegradação desnecessário.
- Use os "Controles de Ver / Aquisição / aquisição ND" comando para abrir o painel de controle de aquisição da ND.
- Iniciar a digitalização para definir os parâmetros Z-stack. Defina o limite superior Z-stack para onde as células não estão em foco e limite inferior para onde as células não são mais visíveis. Permitir um espaço de 3 micrómetros acima da amostra para o crescimento e o movimento celular, o que pode expandir-se para o campo de imagem. O Z-stack para as figuras mostradas neste proprotocolo cobriu uma Z-profundidade de 40 mm na cauda do embrião.
- Defina o tamanho do Z-interval passo para 2 mm. Em média, uma célula é de 10 um de diâmetro; portanto, 2 m vai produzir cinco intervalos de dados de imagem a ser analisada para cada célula.
NOTA: A profundidade da imagem que pode ser adquirida depende do intervalo Z. resolução Z é sacrificado para ganhar profundidade total na dimensão Z, a fim de imagem como muitas células que sofrem mitose possível (grande profundidade Z). O inverso é verdadeiro, na medida em que, ao diminuir o tamanho do passo, a resolução Z é adquirida, enquanto Z profundidade é sacrificado (pequena profundidade Z). - Ajustar a potência do laser de imagem, HV, e compensar os níveis. Para os experimentos demonstraram neste protocolo, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar níveis fixados nos níveis correspondentes, respectivamente, para o canal de GFP; 2-5, 120-140, e -9 a -11. Para o canal mCherry, use a seguinte potência do laser, HV, e compensar os níveis, respectivamente; 3-6, 120-140, e -3 para-8. Uma vez que os parâmetros são definidos, desligue a varredura para evitar a exposição a laser desnecessário que pode causar fototoxicidade e fotodegradação da amostra.
- Selecione o ícone de média linha de 2x. "Não média" produz uma imagem granulada enquanto "linha 4x média" aumenta drasticamente o tempo de verificação. Uso de linha 2x média proporciona a melhor qualidade de imagem e tempo mais rápido de digitalização.
- Seleccione a duração do intervalo de tempo e tempo adequados necessários para o experimento. Para divisões de tipo selvagem, os intervalos de tempo de dois minutos durante 2 horas é o melhor para determinar a duração mitótico (utilizados nas Figuras 1, 2, 3A e 3B). Divisões que activam o ponto de verificação para a montagem do eixo mais longo do que 30 minutos são mais adequados para intervalos de cinco minutos, durante quatro horas, a fim de preservar a fluorescência como demonstrado na Figura 3C.
- Marque a caixa "salvar em arquivo" e nome do arquivo para salvar automaticamente o arquivo tal como ele está sendo adquirido. verifique todos os patros estão definidos corretamente e clique em "começar a correr".
- Após a aquisição for concluída, para exibir o arquivo em um formato tridimensional, clique no ícone do limiar de volume.
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Representative Results
A Figura 2 demonstra a capacidade de observar muitas divisões celulares utilizando uma ampla visão de campo de um tipo selvagem de cauda de peixe-zebra AB. Mais de sete células mitóticas são gravadas em um prazo de 14 min (Filme 1). Dentro de duas horas tempo de curso, mais de 40 eventos de mitose foram capturados. Em média, 50 células em divisão foram observados no AB e 30 células que se dividem em AUR B M / m embriões (Figura 2B). Para ter em conta o número de células trabalhada, a proporção de células mitóticas com o número de células fotografadas foi calculado (Figura 2C). Estes dados sugerem que não há um menor número de células que atravessam a mitose nas aur B M / m embriões (Figura 2B), mas um menor número de células a ser trabalhada. A capacidade de adquirir um número estatisticamente significativo de eventos, como isso vai ajudar no poder estatístico.
A Figura 3 expande-se sobre esta técnica para incluir quantificar duração mitótico. Depois de uma sessão de lapso de tempo é adquirido, uma célula individual pode ser analisado pelo tempo gasto na mitose com a resolução adequada, utilizando a ferramenta de zoom (Figura 3A, B). duração mitótico é calculado manualmente, contando quantos intervalos de tempo levar até uma divisão celular. O número de intervalos de tempo é então multiplicado pelo intervalo de tempo entre cada Z-pilha. Por exemplo, na Figura 3C, a divisão levou-se 12 intervalos de tempo e o intervalo de tempo entre cada Z-pilha foi de 2 min. Portanto, o tempo de divisão para esta célula foi de 24 min. O tempo médio de divisão de tipo selvagem AB é de 25 min e 58 min para aurB m / m (Figura 3B). Uma divisão de tempo prolongado, como visto na aurB m / m sugere que o posto de montagem do fuso não foi satisfeita devido a vacas erradaanexos tochore 1,2. Dando uma olhada mais de perto no zoom em embriões de tipo selvagem, cada fase mitótico pode ser distinguido (Figura 3C, Movie 2). Além disso, os defeitos de mitose pode ser observado na aurB m / m embrião que incluem a paragem da mitose e a citocinese não resultando em uma célula binucleadas e subsequente formação de um micronúcleo (Figura 3D, filme 3). Este ampliada análise mostrando defeitos mitóticas apoia a divisão de tempo aumentou adquirida na Figura 3B.
Vários outros defeitos diversificada de mitose e destinos celulares que podem ser encontrados são exploradas na Figura 4; demonstrada na ESCO2 + / M e ESCO2 m / m embriões. Numa ESCO2 + / embrião m, movimentos cromossómicas erradas são capturados e pode ser definido como defeito congressions. defeitos Congression ocorrer quando anexos microtúbulos impróprias são feitas. Estes defeitos causará falha dos cromossomos para migrar em direção à placa metafásica. cromátides irmãs emparelhados, particularmente identificáveis min 20 e 46, que não tenham congressed em direção à placa metafásica pode ser observada pela primeira vez em min 14. Anaphase início separa as cromátides irmãs alinhados na placa metafásica, bem como as cromátides irmãs emparelhados para a direita, observados no minuto 50. Além disso, é possível a formação de micronúcleos é observado como estes cromátides irmãs separadas permanecem isoladas fora do núcleo (T = 50, Figura 4A, filme 4). Na Figura 4B, uma divisão multipolar está visualizado (Filme 5). Divisões multi-polares ocorrem frequentemente devido à amplificação do centrossoma, mas pode ocorrer através de outros meios 42. Na Figura 4C, um m / m celular ESCO2 demonstra inicialmente irmã prematura chromatid separation eo eixo de rotação 9,43,44. Outro destino celular demonstrado neste painel é uma ponte anaphase em que anexos merotelic não estão resolvidas 45,46. A ponte anaphase pode ser visto pela primeira vez no minuto 62. A cromatina parece prematuramente decondense enquanto a célula está passando por citocinese. Medida que ocorre a citocinese, o sulco de clivagem colide com os cromossomas descondensada e, como ocorre abscisão, puxa o material de cromatina para formar uma ponte de anafase (Figura 4C, Filme 6). Embora não seja mostrado aqui, a fim de quantificar os destinos celulares, gravar todas as divisões mitóticas em cada quadro e do tipo de célula destino eles exibem. Dividir o número de células em cada destino ao número total de divisões gravadas e multiplicar por 100 para calcular a percentagem de destino celular.
Figura 1: Protocolo de desenhos de contorno. (UMA) (B) Desenho esquemático do processo de embrião incorporação. Os embriões injectados deve ser dechorionated e anestesiados. Os embriões são então transferidos para o prato lamela de fundo e o excesso de azul de E3 é removido. agar baixo ponto de fusão é usado para criar cúpulas separadas relativas a cada embrião. Orientar os embriões de modo que o caudal é o mais próximo de lamela. Aguarde dois minutos antes da adição de agar cobrindo toda a lamela. Aguarde até que o ágar é solidificada antes de se mudar para a imagem. (C) Desenho esquemático para definir os termos Z-intervalo, Z-stack, profundidade Z, intervalo de tempo, tempo de duração e 5D que são usados no protocolo e discussão. Z-intervalo é definido como a distância entre cada imagem como o microscópio move-se mais profundamente na amostra para criar um Z-pilha. Z-stack é todas as imagens tomadas através de umamostra no Z-intervalo definido. A distância percorrida em um Z-stack define o Z-depth. intervalo de tempo é a quantidade de tempo entre um Z-stack e no próximo Z-stack para criar uma imagem time-lapse. tempo de duração é a quantidade total de tempo utilizado para a imagem. 5D é definida como as dimensões X, Y, Z, tempo e emissão fluorescente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Time-Lapse de imagem Captura Múltiplos Eventos mitóticas em um embrião de peixe-zebra ao vivo. (A) alambiques de lapso de tempo de uma experiência ampliada para fora em um tipo selvagem AB, 24 peixes-zebra hpf mostrando vários eventos de mitose. Os asteriscos apontam para sete células em mitose. T = tempo decorrido em minutos. Barra de escala = 5 m. (B) O número de ce mitóticolls observados em AB e aurB m / m caudas de peixe-zebra a 24 HPF. A média ± st. dev., n = 3 embriões / genótipo. (C) A proporção de células mitóticas por número total de células em AB e aurB M / M caudas de peixe-zebra a 24 HPF. A média ± st. dev., n = 3 embriões / genótipo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. célula individual Análise Capturas cada fase de mitose e mitótico Duração. (A), numa célula seleccionada entre o grande campo de visão AB de tipo selvagem, 24 HPF embrião do peixe-zebra mostrado na Figura 2A. (B) Tempo Divisão é observado para AB e aurB m / m células e calculada a partir inferir bre envelope nuclearakdown (NEB) na primeira observação de cromatina condensada numa célula para formação de duas novas células filhas. n = 3 embriões / genótipo, n = 66 divisões para AB, n = 29 divisões para aurB m / m, *** p <0,001. células do tipo selvagem (C) AB é cortada para visualizar a progressão fase por meio de mitose . t = min. Barra de escala = 5 uM. (D) aurB m / m célula é cortada para visualizar a progressão mitótico através de mitose que inclui paragem da mitose resultando em falha citocinese e formação de micronúcleos. As setas apontam para a micronúcleos. T = tempo decorrido em minutos. Scale bar = 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4.Single Cell imagens ao vivo Captura múltiplos defeitos mitóticos Associados com Chromosome Segregação e Divisão em mitótico Mutant Peixe-zebra. (A) imagem de uma célula sofrer defeitos congression em um ESCO2 + / m embrião Um cortada. A seta fina monitora o cromossomo esquerda que é puxado de volta para a placa metafásica. A seta grossa monitora o cromossomo direito que não é puxado de volta para a placa metafásica e inferido para formar um micronúcleos. A seta dupla mostra a separação do cromossomo direito que não o Congresso no início anaphase. Inserções mostram ampliada vistas dos cromossomos que falharam ao Congresso. Inserções foram cortadas e melhor luminosidade para melhor visualização. CAAX fluorescência foi removido para visualizar os cromossomas mais facilmente. Barra de escala = 5 uM. (B) Uma imagem de uma célula cortada passando por paragem da mitose que resulta em uma divisão multipolar num ESCO2 + / M embrião. Barra de escala = 5 m. (C) Uma imagem recortada de uma célula sofrer fadiga coesão resultando em anaphase formação de ponte visto pelo thread-como puxar entre os dois núcleos apontadas pelos suportes. Barra de escala = 5 uM. t = tempo decorrido em minutos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. divisões celulares múltiplos podem ser visualizados em uma visão ampla de um embrião de peixe-zebra com injecção de tipo selvagem (clique direito para fazer o download).
Filme 2. Fases da mitose pode ser facilmente visualizado em um embrião de peixe-zebra de tipo selvagem (r ight clique para baixar). Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo e prossegue em direção congression das cromátides irmãs para formar uma placa metafásica . segregação precisa ocorre e produz duas novas células filhas.
Filme 3. Imagens ao vivo da aurB m / m embrião revela cromossomo faltaegregation, falhou citocinese, e formação de micronúcleos (clique direito para fazer o download). desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo, cromossomos espalhar para pólos opostos incapazes de formar uma placa metafásica adequada, e prossiga para girar sobre o eixo estendendo-se a divisão tempo da célula. A citocinese não ocorre, resultando numa célula 4N e múltiplos micronúcleos.
Filme 4. defeitos Congression são observados em um ESCO2 + / m embrião (clique direito para fazer o download). Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo. Depois de a placa de metafase é formado, alguns INDIcromossomos indivi- espalhar para os lados. Um cromossoma para a esquerda, eventualmente, é puxado de volta para a placa metafásica enquanto o cromossomo para a direita permanece fora da placa metafásica e pode ser visto separando cromatídeos irmãos no início da anáfase. A célula exibe uma divisão de tempo prolongado, mas divide finais com potencial formação de micronúcleos.
Filme 5. divisão multi-polar é observado em um ESCO2 + m embrião / (clique direito para fazer o download). Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo e, em seguida, os cromossomos se fundem para formar um indicativ em forma de Ye de pólos 3-fuso. A célula exibe uma divisão de tempo prolongado, mas, em última análise se divide em 3 células filhas.
Filme 6. irmã prematura separação chromatid e formação de ponte anaphase são observados em um ESCO2 m / m embrião (clique direito para fazer o download). Desagregação envelope nuclear é inferida pela aparência irregular do núcleo e, em seguida, os cromossomos se espalham por toda a célula incapaz de formar um placa metafásica adequada. A cromatina decondenses antes da citocinese e como a célula se divide, cria uma ponte anafase entre as duas células.
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Discussion
A utilização deste método permite inferir colapso nuclear de envelope, a formação de uma placa de metafase por anexos microtubule-cinetocoro, e a segregação de cromatídeos irmãos para formar duas novas células in vivo e de um modo dependente do tempo. A capacidade de observar a mitose no peixe-zebra é vantajosa em relação a amostras fixadas e sistemas de cultura de células porque as células estão a ser trabalhada na fisiologia natural, o tecido é transparente, o que permite que as proteínas fluorescentes a serem utilizados, eles desenvolvem relativamente rápido, e imagiologia em tempo desfasado podem ser adquiridos. Uso de peixe-zebra adulto para este protocolo é restrito devido ao Z-profundidade limitada que pode ser adquirido devido ao tecido mais grosso que não é a pele ou olhos. Enquanto os animais transgénicos que expressam H2A.F / Z-EGFP e mCherry-CAAX poderia ser utilizado para o mesmo fim, a versatilidade e a facilidade de as injecções de ARNm em diferentes peixe-zebra mutante é vantajoso sobre cruzamentos genéticos. Em situações em que a análise é mitóticorequerido em três dias após a fertilização (DPF) ou embriões mais tarde, os animais transgénicos seria necessário, devido à meia-vida de ARN neste organismo em rápido desenvolvimento.
Outras proteínas fluorescentes para visualizar a mitose são passíveis de este protocolo. Por exemplo, H2B-GFP ARNm é uma alternativa ao H2A.F / Z-EGFP para a cromatina, e fornece rotulagem semelhante. Outras proteínas fluorescentes etiquetadas que podem ser utilizados nesta técnica incluem POM121, Centrin, EB1, Hec1 e EMTB que permitiria imagens ao vivo em embrião dos microtúbulos envelope nuclear, Centríolos, além de ponta, kinetochore, e microtúbulos, respectivamente 32,47-51.
Este protocolo tem várias etapas-chave de imagem que devem ser executadas para alcançar resultados de qualidade: 1) Certifique-se de otimizar a qualidade mRNA e concentração para produzir a fluorescência brilhante e nenhuma toxicidade possível. Quanto mais fluorescência levará a uma menor exposição à radiação laser e, portanto, menos photobleaching e fototoxicidade. 2) O embrião deve ser completamente anestesiados e seguro no agar. movimentos menores irá alterar os resultados e poderia arruinar a experiência. 3) A concentração de ágar deve ser apropriado para o estágio de embrião desejado a ser trabalhada. Aos 24 HPF e ainda, 1% de agarose de baixo ponto de fusão é adequado. Se de imagens em 12 hpf ou mais cedo, uma solução de agarose a 0,3% deve ser utilizado 39. 4) O ROI no embrião deve ser tão próxima quanto possível da lamela. Esta etapa não se limitar um a imagem da cauda. Os olhos, pele, região dorsal, gema, e dobre fin são exemplos de outras áreas que podem utilizar este protocolo.
O tempo é o fator determinante que separa este protocolo a partir de embriões ou tecidos de imagem fixa. Ao configurar o Z-stack, Z-intervalo, o intervalo de lapso de tempo, e duração de lapso de tempo, é importante ter em mente o contexto do experimento (Figura 1C). A divisão celular do tipo selvagem normalmente dura cerca de 25 min a 24 hpf. em thé exemplo, a 2 mm Z-interval cobrindo 40 mm de tecido em um Z-stack, com um intervalo de tempo dois minutos para duas horas provou ser eficaz. Além disso, em embriões com a mitose defeituoso, as células em uma paragem da mitose provavelmente irá estar presente, drasticamente aumentando os tempos de divisão celular. Para adquirir várias divisões completas, o tempo de duração deve ser aumentada, ou seja, a partir de 2 h a 4 h. Um tempo de aquisição mais longo vai expor a amostra a mais potência do laser e aumentar o risco de fotobranqueamento e fototoxicidade. Neste caso, o intervalo de tempo entre cada Z-pilha deve ser aumentada. movimentos de cromossomos dinâmicas serão sacrificados, aumentando o intervalo de tempo entre Z-stacks, mas tempo de duração é adquirida. Isto é necessário quando imagiologia de divisões celulares, que pode durar mais de duas horas.
Embora não tenha sido discutido directamente, este protocolo pode ser optimizado para obter uma imagem de maior resolução, no plano z para visualizar com maior precisão MO cromossomavements. Por exemplo, na Figura 4A dois cromossomas missegregated são observados. O cromossomo para a direita (observado pela seta grossa) é inicialmente brilhante e em foco, mas escurece nos últimos quadros. Com um Z-2 um intervalo, o cromossoma uncongressed cai entre o Z-intervalo. Capturando os movimentos hora e eventos cromossómicas singulares pode ser conseguido através do aumento da resolução no plano z. Para fazer isso, aumentar o zoom em uma célula individual usando a ferramenta A1 Área de Digitalização. Ao configurar os parâmetros empilhar-Z, use uma distância menor Z-intervalo. A faixa recomendada é 0,5-1 m. Além disso, diminuindo o intervalo de tempo entre cada pilha Z vai criar transições suaves entre cada intervalo de tempo, ou seja, a partir de dois minutos e 30 segundos - 1 min. Uma ressalva a este tipo de imagem é o Z-profundidade limitada que pode ser alcançado. Devido ao intervalo de Z-intervalo e tempo menores, mais o tecido vai ser exposto aos lasers em um intervalo de tempo menor. Para superar isto, SMAller tempo de duração pode ser utilizada; no entanto, este também é dependente de quanto tempo o pesquisador gostaria de capturar divisões.
Uma analogia que pode ajudar com essas modificações é pensar de um Z-stack como um acordeão. A distância entre cada dobra do fole é a Z-intervalo e a profundidade Z é representado pelo comprimento do acordeão. Em um caso em que não se poderia pretender incorrer em qualquer exposição mais de laser para a amostra, como os trechos de acordeão (aumenta a profundidade Z), a distância entre as pregas do fole (Z-intervalo) deve aumentar também. O inverso é verdadeiro no que à medida que os contratos de acordeão, a profundidade Z diminui. As pregas do fole contrato, bem como, correspondendo a um decréscimo em z-intervalo. Esta analogia pode ser aplicado a amostras fixadas e vivas. A complexidade é aumentada neste protocolo, quando o tempo é adicionado à equação. Há uma quantidade finita de tempo que o sanfoneiro pode estender ou contrair o acordeão. este represents o intervalo de tempo. A fim de cobrir uma distância (profundidade Z) o intervalo de tempo deve aumentar. Como assim, a fim de ouvir mais música, deve-se ouvir por um longo período de tempo (tempo de duração) Em termos deste protocolo, a fim de testemunhar mais divisões celulares, o tempo de duração deve aumentar. Um fator de composição para manter em mente é que, quanto mais a música que é tocada, o mais cansado do acordeonista. Isto é análogo à dimensão final, a fluorescência. A exposição mais de laser da amostra é dado, mais fotodegradação e fototoxicidade (cansaço) torna-se um problema.
Em resumo, este protocolo detalha um método para visualizar a mitose em um embrião do peixe-zebra vivo aplicável a diferentes análises; 1) número de divisão 2) por divisão de tempo 3) o destino divisão e 4) a dinâmica da cromatina de alta resolução. Múltiplas possibilidades de visualização de componentes mitóticas que vão desde acessórios de microtúbulos-kinetochore para centríolo dinâmica pode ser aplicada. Combinando a capacidade demitose imagem in vivo com os recentes avanços na edição genoma no peixe-zebra irá tornar mais fácil para gerar mutantes em vários aspectos da mitose para modelar doenças humanas em um organismo vertebrado 25,26,52-56.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
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