Abstract
Mitose er kritisk for organismal vækst og differentiering. Processen er meget dynamisk og kræver beordret begivenheder til at udføre korrekt kromatin kondensering, mikrotubuli-kinetochore vedhæftet fil, kromosom adskillelse, og cytokinese i en lille tidsramme. Fejl i vanskelige proces kan resultere i human sygdom, herunder fosterskader og kræft. Traditionelle tilgange undersøger menneskelige mitotisk sygdomstilstande ofte afhængige cellekultursystemer, som mangler den naturlige fysiologi og udviklingsmæssige / væv-specifikke kontekst fordelagtig, når studerer human sygdom. Denne protokol overvinder mange forhindringer ved at give en måde at visualisere, med høj opløsning, kromosom dynamik i et hvirveldyr system, zebrafisk. Denne protokol vil detalje en tilgang, der kan bruges til at opnå dynamiske billeder af delende celler, som omfatter: in vitro-transskription, zebrafisk avl / indsamling, embryo indlejring og time-lapse billeddannelse. Optimering og modifaf tekniske data i denne protokol er også undersøgt. Brug af H2A.F / Z-EGFP (etiketter chromatin) og mCherry-CAAX (etiketter cellemembran) mRNA-injicerede embryoner, mitose i AB vildtype, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant zebrafisk visualiseres. Høj opløsning levende billedbehandling i zebrafisk tillader en at observere flere mitose til statistisk kvantificere mitotiske fejl og timingen af mitotisk progression. Desuden er observation af kvalitative aspekter, der definerer upassende mitoseprocesser (dvs. kongression defekter, missegregation af kromosomer, etc.) og forkert kromosomale udfald (dvs. aneuploidi, polyploidi, mikrokerner, etc.) overholdes. Dette assay kan anvendes til observation af vævsdifferentiering / udvikling og kan underkastes anvendelsen af mutant zebrafisk og farmakologiske midler. Visualisering af, hvordan fejl i mitose føre til kræft og udviklingsmæssige forstyrrelser vil i høj gradøge forståelsen af patogenesen af sygdommen.
Introduction
Mitose er en kritisk cellulær proces essentielle for vækst, differentiering og regenerering i en levende organisme. Efter nøjagtig tilberedning og replikation af DNA i interfasen, er cellen klargøres til at dele sig. Den første fase af mitose, profase, initieres ved aktivering af cyklin B / Cdk1. Profase er kendetegnet ved kondensation af kromatin materiale i kromosomer. opdeling nuklear kappe forekommer ved overgangen mellem profase og prometafasen. I prometafasen, centrosomer, den kimdannende center for spindel dannelse, begynder at migrere til modsatte poler samtidig udvide mikrotubuli i jagten på kinetochore vedhæftet fil. Ved fastgørelse, til konverteringer end-på mikrotubuli udlæg og trækkræfter orientere kromosomerne danner en metafaseplade 1. Hvis alle kromosomer er tilsluttet korrekt, er spindlen samling checkpoint tilfredse, cohesin ringe holder søster kromatider sammen spaltes, og mikrotubuli forkorte at trække søsterkromatider til modsatte poler under anafase 2,3. Den sidste fase, telofase, involverer forlængelse af cellen og gendannelse af nuklear kappe omkring de to nye kerner. Cytokinese fuldender division processen ved at adskille cytoplasmaet af de to nye datterceller 4-6. Ændring af centrale mitotiske veje (dvs. spindel samling checkpoint, centrosom dobbeltarbejde, søsterkromatid samhørighed, osv.) Kan resultere i metafase anholdelse, missegregation af kromosomer, og genomisk instabilitet 7-10. I sidste ende kan defekter i veje kontrollerende mitose forårsage udviklingsforstyrrelser og kræft, hvilket nødvendiggør visualisering af mitose og dets defekter i en levende, hvirveldyr, multi-cellulære organisme 10-16.
Zebrafisk embryoner tjene som en stor model organisme for levende billeddannelse på grund af den gennemsigtige væv, nem mikroinjektion og hurtig udvikling. Brug zebrafisk, det overordnede mål med dette manuskript er atbeskriver en fremgangsmåde til levende 5D (dimensioner X, Y, Z, tid og bølgelængde) afbildning af mitose 17 (figur 1C). Brugen af mutant zebrafisk defekt i forskellige mitotiske veje demonstrerer følge af sådanne defekter. Til denne protokol blev Aurora B og Esco2 mutanter valgt at illustrere disse defekter. Aurora B er en kinase, der er en del af kromosomet passager kompleks (CPC) involveret i spindeldannelse og mikrotubulus vedhæftet fil. Det er også nødvendigt for spaltning fure dannelse i cytokinese 18,19. I zebrafisk, Aurora B-mangel fører til fejl i fure induktion, cytokinese, og kromosom segregation 20. Esco2, på den anden side, er en acetyltransferase som er essentielt for søsterkromatid samhørighed 21,22. Det acetylerer cohesin på SMC3 del af ringen dermed stabiliserer cohesin at sikre korrekt kromosom adskillelse ved metafase-anafase overgangen 23. Tab af Esco2 i zebrafisk fører til chromosome missegregation, for tidlig søsterkromatid separation, genomisk ustabilitet, og p53-afhængig og uafhængig apoptose 24,25. På grund af tilgængeligheden, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant zebrafisk (i det følgende benævnt Aurb m / m og esco2 m / m, henholdsvis), vil blive brugt til at illustrere denne teknik 25-27.
Kobling konfokal mikroskopi med fluorescerende-mærket celle maskiner har gjort det muligt for forskerne at visualisere kromatin og cellemembran dynamik under mitose 25,28,29. Fluorescerende-mærkede histoner historisk har været anvendt til at visualisere kromatin. Histoner er nukleare proteiner er sammensat af fire forskellige par (H2A, H2B, H3 og H4), der er ansvarlige for nukleosom struktur, der komponerer kromosomer 30. Mens H2B er nok den mest brugte histon for fluorescerende proteiner imus og cellekultur, brug af histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) har vist sig godt til brug i zebrafisk 31,32. Concanavalin A og casein-kinase 1-gamma f.eks lokalisere til cellemembranen og har tidligere vist sig effektiv til at visualisere cellemembranen i søpindsvin og drosophila 33,34. Andre undersøgelser har vist, at CAAX fluorescerende-mærket protein etiketter cellemembranen og havde succes med zebrafisk 31. CAAX er et motiv, der er anerkendt af posttranslationelle modificerende enzymer såsom farnesyltransferases og geranylgeranyltransferases. Modifikationer af disse enzymer forårsager proteiner til at blive membranassocieret, således mærkning cellemembranen 35.
På grund af den tidligere brug i zebrafisk, denne protokol valgte at bruge H2A.F / Z og CAAX at mærke kromatin og cellemembranen. Anvendelse af denne metode vil gøre det muligt for forskeren at overvåge mitose på det individuelle celleniveau at observere individuelle kromosomdynamik, såvel som samtidig overvåge flere celledelinger, der kan påvirke vævsdifferentiering og udvikling. Denne artikel vil fokusere på billeddannelse dynamikken i kromosom adskillelse under mitose på den enkelte celle niveau. Inden dette manuskript, vil evnen til at observere flere mitotiske divisioner, beregne division tid, og dechifrere de mitotiske fænotyper illustreres og diskuteres. Ved at bruge disse parametre, fysiologisk relevante data kan indsamles og anvendes på flere sygdomstilstande ramt af mitotiske defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro transskription
- Linearisere pCS2-H2A.F / Z-EGFP og / eller pCS2-mCherry-CAAX vektorer ved Notl restriktionsenzymspaltning 31. Anvendelse af en RNA in vitro transcription kit, generere 5 'capped mRNA produkter fra hver skabelon, ifølge producentens protokol.
- Oprens til udjævningen mRNA under anvendelse af en oprensningskit. Følg producentens anvisninger. Eluer med RNase-fri H 2 O.
- Bestemme koncentrationen af RNA ved absorbans ved 260 nm ved anvendelse af et spektrofotometer. (OD 260 x fortynding x 40 ug / ml).
- Fortynd RNA til 100 ng / pl for hver H2A.F / Z-EGFP og mCherry-CAAX med RNase-fri H 2 O. Hvis RNA-koncentrationen er for lav, vil fluorescensen blive formindsket eller fraværende. Lysere prøver vil mindske bekymringer over fototoksicitet og fotoblegning. På den anden side kan for meget RNA være giftige og / eller forårsage off target effekter.
Bemærk: Opbevar de resterendeoprensede mRNA i -80 ° C fryser.
2. zebrafisk Breeding, embryonindsamlingsteam, og mRNA Injection 36-38
- Saml avl tanke med en barriere for at adskille tanken i to regioner og fylde hver avl tank med akvakultur-system vand, der anvendes i zebrafisk facilitet.
- For at undgå utidig avl, placere to mandlige fisk på den ene side af barrieren og to hunfisk på den anden side natten før avl.
- Den næste dag, optø den tidligere fremstillede mRNA blanding på is. Udskift vandet i avl tanke med frisk akvakultur-system vand og fjern barriererne. Umiddelbart efter barriererne er trukket, varme en indsprøjtning skimmel til 28,5 ° C, og opsætte udstyr til mikroinjektion.
Bemærk: Oplysninger om sprøjtestøbeforme henvises til Gerlach 36. - Saml æg hver 10 - 15 minutter ved hjælp af en te si og skyl æggene i en ren 100 x 15 mm petriskål med E3 Blue (5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, 10 -5% methylenblå). E3 Blå bruges til at forhindre svampevækst og sikre en korrekt udvikling af fiskelarver. For mere information om parring og embryonindsamlingsteam, henvises til Gerlach 36 og Porazinkski 37.
- Embed én-celle iscenesat embryoner i et opvarmet sprøjtestøbeform og sprøjt RNA i blommen i den ønskede mængde af embryoner (figur 1A). Konto for naturlig embryonale død og ubefrugtede embryoner ved at udføre embryonale injektioner på 15% flere embryoner, end der er nødvendige for eksperimentet. For yderligere detaljer om mikroinjektion af zebrafisk embryoner henvises til Gerlach 36 og Porazinkski 37.
BEMÆRK: første gang brug af mRNA, udføre en dosis-kurve analyse for at bestemme den optimale dosis for fluorescens og levedygtighed (defineret som ingen grove udviklingsmæssige defekter op til 5 dpf) før udførelse 5D billeddannelse. 150 - 200 ng / plinjiceret i embryoer er ofte den optimale koncentration, og det er derfor et godt udgangspunkt for den endelige koncentration. - Omhyggeligt udtrække de injicerede embryoner fra formen under anvendelse af en modificeret 9 "glas Pasteur-pipette. For at ændre pipetten, smelte enden ved anvendelse af en bunsenbrænder indtil den danner en kugle.
- Placer injicerede embryoner i en 100 x 15 mm petriskål i E3 Blå og hus i en 28,5 ° C inkubator.
- Seks timer efter injektion, fjerne eventuelle døde eller ubefrugtede embryoner fra pladerne og tilføje ren E3 Blå. House embryoner ved 28,5 ° C.
3. Forberedelse og Embedding Live zebrafisk embryoner for Imaging (figur 1B)
- To timer før billeddannelse, screene de injicerede embryoner til GFP under anvendelse af en fluorescerende dissektionsmikroskop. Placer lysegrønne GFP-udtrykkende embryoner i en ny 100 x 15 mm petriskål med E3 Blå.
- Kog en stamopløsning af 1% lavtsmeltende agarose ved tilsætning af 1 g af lavtsmeltende agarose til 100 ml E3 Blå. Efter brug af agarose, dække kolben med aluminiumsfolie. Stamopløsningen er nyttig i op til en måned.
- Alikvot 3 ml af den smeltede agar i en 17 x 100 mm dyrkningsrør. Hold agarose varme ved at placere kulturen rør i et 42 ° C vandbad, indtil klar til brug. Forbered en 15 mM tricaine løsning i deioniseret vand for at bedøve de zebrafisk embryoner 36.
BEMÆRK: Hvis der ønskes billeddannelse på tidligere tidspunkter, kan koncentrationen af agar reduceres så lavt som 0,3% 39. - Bring 15 mM tricaine, screenet embryoner, lavt smeltepunkt agarose, E3 blå, og en 35 mm dækglas bund kultur parabol til en dissektion lysmikroskop. Fjern forsigtigt fosterets chorion med # 5 pincet. Gør dette i tre embryoer.
- Placer dechorionated embryoner i en separat beholder, der skal bedøves. Låget dækglasset bund skålen anvendes ofte til dette formål. Ved hjælp af en overførsel pipette tilsættes tre dråber (ca. 150 pi)af 15 mM tricaine til fadet af 5 ml E3 blå (hvis bruger låget af dækglasset bund parabol) eller indtil embryoner er blevet tilstrækkeligt bedøvet. Desuden tilsættes 3-4 dråber (ca. 150 - 200 pi) på 15 mM tricaine løsning på 1% smeltede agarose rør.
- Ved hjælp af en p200 pipette med 1 cm pipettespidsen afbrød; overføre bedøvede embryoner til dækglasset-bund skål. Fjern overskydende E3 Blå: tricaine løsning.
- Langsomt tilsættes 5 - 10 pi lavtsmeltende agarose: tricaine opløsning over embryonet, holder hver dråbe separat for at sikre at embryonerne ikke ved et uheld glider tæt på hinanden.
Advarsel: Hvis agarose er for varmt, vil det skade fosteret. En god temperatur for at opretholde agar ved er 42 ° C. - Ved hjælp af en 21 G 1½ nål, forsigtigt orientere embryoet i agarosen til den ønskede position. Ved brug af et inverteret mikroskop for time-lapse billeddannelse, orientere regionen af interesse (ROI) så tæt på dækglasset som possible.
Bemærk: Til generelle formål, haleregionen tilbyder nem orientering og klarhed på grund af det relativt tynde væv (figur 1A). Andre væv, såsom epithellaget omgiver æggeblomme og fin folder, kan anvendes 28,29. Disse væv tilbyder stor klarhed, men disse områder er kun et par cellelag tykke. Med henblik på denne protokol, er det en fordel at billedet halen regionen til at erhverve så mange celledelinger som muligt. - Tillad et par min til delvis størkning af agaren. Brug nålen til at knække hinanden et lille stykke agar for at teste dens størkning. Når et stykke agar kan trækkes væk fra drop, gå videre til næste trin.
- Dæk hele dækglasset med lavtsmeltende agar danner en kuppel over de indlejrede embryoner. Lad agar at størkne, før du flytter parabol til konfokal imaging (figur 1A).
- Under agar størkningsprocessen (tager ca. 10 min), forberede 3 ml of E3 blå opløsning med fem dråber (ca. 250 pi) 15 mM tricaine der skal placeres over de indlejrede embryoner under billedbehandling.
4. 5D Konfokal Imaging Live zebrafisk embryoner 40,41
BEMÆRK: Se Ariga 40 og O'Brien 41 for detaljer om, hvordan du udfører 5D billeddannelse ved hjælp af andre konfokale systemer. For Z-interval, Z-stack, Z-dybde, tidsinterval, og 5D definitioner se figur 1C.
- Åbn imaging software og indstille mikroskopet til 60X NA 1.4 objektiv. Påfør fordybelse olie til objektivlinsen og placere kulturen fadet i diasholderen på mikroskopet scenen. Brug af aksen controller, centrere embryo af interesse over objektivlinsen og bringe objektivlinsen opad for at opfylde dyrkningsskålen.
- Klik på ikonet øjet brik og skifte til GFP-filter på mikroskopet. Fokus på ROI. Fokus på vævet nærmest dækglasset vil offer de bedste imaging resultater.
- Fjern interlock. Vælg de GFP og mCherry kanaler (forudindstillede bølgelængder i software) og indstil den linje gennemsnit option til normal.
- Brug "Se / Acquisition Controls / A1 Scan Area" kommando til at åbne A1 Scan Area værktøj.
- Begynd scanning. Brug af aksen-controller, positionere embryoet så scanningsområdet er fyldt med så meget af zebrafisk som muligt. Lasereffekten behøver ikke at være optimal ved dette punkt. Sænk laser magt at undgå unødig fotoblegning.
- Brug "Se / Acquisition Controls ND erhvervelse /" kommando til at åbne ND erhvervelse kontrolpanel.
- Begynd scanning for at indstille Z-stakken parametre. Indstil Z-stakken øvre grænse for, hvor cellerne er ikke i fokus og nedre grænse for, hvor cellerne er ikke længere synlig. Tillad for en 3 um rum over prøven for vækst og celle bevægelse, som kan udvide til billedbehandling feltet. Z-stack for tallene i denne proprotokol dækkede en Z-dybde på 40 um i embryo halen.
- Indstil Z-interval trinstørrelse til 2 um. I gennemsnit en celle er 10 um i diameter; derfor 2 um vil producere fem intervaller på billeddata, der skal analyseres for hver celle.
BEMÆRK: Dybden af billedet, der kan erhverves, afhænger af Z-interval. Z opløsning ofres for at opnå total i Z dimension for at billedet så mange celler, der undergår mitose som muligt (stor Z-dybde). Den omvendte er sandt, ved, at ved at nedsætte trinstørrelsen er Z opløsning opnået, medens Z dybde ofres (lille Z-dybde). - Justere billedet lasereffekt, HV, og offset niveauer. For forsøgene påvist i denne protokol, skal du bruge følgende laser magt, HV, og offset niveauer, på de tilsvarende niveauer, henholdsvis for GFP-kanal; 2 - 5,, 120 - 140 og -9 til -11. For mCherry kanal, skal du bruge følgende laser magt, HV, og offset niveauer henholdsvis; 3. - 6., 120 - 140 og -3 til-8. Når parametrene er indstillet, skal du slukke for scanning for at forhindre unødvendige laser eksponering, der kan forårsage fototoksicitet og fotoblegning af prøven.
- Vælg gennemsnitsberegning ikonet 2x linje. "Ingen gennemsnit" producerer et kornet billede, mens "4x line gennemsnit" drastisk øger scanningen tid. Anvendelse af 2x line gennemsnit giver den bedste billedkvalitet og hurtigste scanningstid.
- Vælg den relevante tidsinterval og varigheden er nødvendig for eksperimentet. For vildtype divisioner, intervaller to-minutters gang til 2 timer er bedst til at bestemme mitotisk varighed (anvendt i figur 1, 2, 3A og 3B). Divisioner, der aktiverer spindelkonstruktion checkpoint i mere end 30 min er mere velegnede til fem minutters intervaller i fire timer for at bevare fluorescens som vist i figur 3C.
- Markér feltet "gem til fil" og navngive filen til automatisk at gemme filen som den bliver overtaget. Dobbelttjek alle pametre er indstillet korrekt og ramte "start run".
- Efter overtagelsen er færdig, for at se filen i et tredimensionalt format, skal du klikke på ikonet tærsklen volumen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser evnen til at observere mange celledelinger bruger bredt felt billede af en AB vildtype zebrafisk hale. Over syv mitotiske celler afbildet i en 14 min tidsramme (Movie 1). Inden de to timers tid-kursus, blev over 40 mitotiske begivenheder fanget. I gennemsnit blev 50 delende celler observeret i AB og 30 delende celler i aur B m / m embryoner (figur 2B). At tage højde for antallet af celler afbildet, er forholdet af mitotiske celler til antallet af celler afbildet blev beregnet (figur 2C). Disse data tyder på, at der ikke er et lavere antal celler gennemgår mitose i AUR B m / m embryoner (figur 2B), men færre antal af celler, der afbildes. Evnen til at erhverve en statistisk signifikant antal arrangementer som dette vil støtte i statistisk styrke.
Figur 3 udvider denne teknik til at omfatte kvantificering mitotisk varighed. Når en tidsforskudt session er erhvervet, kan en individuel celle analyseres for tid i mitose med tilstrækkelig opløsning ved at bruge zoom-værktøjet (figur 3A, B). Mitotisk varighed beregnes manuelt ved at tælle, hvor mange tidsintervaller tage op en celledeling. Antallet af tidsintervaller multipliceres derefter med tidsintervallet mellem hvert Z-stak. For eksempel i figur 3C, divisionen tog 12 tidsintervaller og tidsinterval mellem hver Z-stack var 2 min. Derfor divisionen tid for denne celle var 24 min. Den gennemsnitlige AB vildtype division tid er 25 minutter og 58 minutter for Aurb m / m (Figur 3B). En forlænget division tid som set i Aurb m / m antyder, at spindelkonstruktion checkpoint ikke er opfyldt på grund af fejlagtig Køertochore vedhæftede 1,2. Tage et nærmere kig på den zoomet i vildtype-fostre, kan hver mitotiske fase skelnes (figur 3C, Movie 2). Desuden kan mitotiske defekter ses i Aurb m / m embryo som omfatter mitosestandsning og mislykkedes cytokinese resulterer i en binucleated celle og efterfølgende dannelse af en mikronucleus (figur 3D, Movie 3). Denne zoomet i analyse, der viser mitotiske defekter understøtter den øgede division tid erhvervet i figur 3B.
Forskellige andre forskelligartede mitotiske fejl og celle skæbner, der kan opstå er udforsket i figur 4; demonstreret i esco2 + / m og esco2 m / m embryoer. I en esco2 + / m embryo, er fejlagtige kromosom bevægelser opfanges og kan defineres som kongression defekts. Kongression fejl opstår, når forkert vedhæftede mikrotubuli er lavet. Disse fejl vil forårsage svigt af kromosomerne til at migrere mod metafaseplade. Forbundne søster kromatider, især identificerbare ved min 20 og 46, som ikke har congressed mod metafaseplade kan først observeret ved min 14. Anaphase debut adskiller søsterchromatider rettet ind i den metafaseplade samt de parrede søsterchromatider til højre, observeret ved minut 50. Yderligere er mulig mikronucleusdannelse observeret som disse adskilte søsterchromatider forbliver isoleret uden for kernen (T = 50, figur 4A, Movie 4). I figur 4B er en multipolær division visualiseres (Film 5). Multi-polære divisioner ofte opstår på grund af centrosom forstærkning, men kan forekomme på andre måder 42. I figur 4C, en esco2 m / m celle oprindeligt demonstrerer for tidlig søsterkromatid separatelyion og spindel 9,43,44. En anden celle skæbne demonstreret i dette panel er en anafase bro, hvor merotelic vedhæftede filer er uløste 45,46. Den anafase Broen kan først ses på minuttet 62. kromatin tilsyneladende tidligt decondense mens cellen undergår cytokinese. Som det sker cytokinese, spaltningen fure indvirker på de dekondenseret kromosomer og, som abscission sker, trækker kromatin materiale til dannelse af en anafase bro (figur 4C, Movie 6). Selv om det ikke er vist her, med henblik på at kvantificere de cellulære skæbner, registrere alle de mitotiske divisioner i hver ramme og den type celle skæbne de udviser. Opdele antallet af celler i hver skæbne med det samlede antal divisioner optaget og gange med 100 for at beregne den celleskæbne procent.
Figur 1: Protokol Tegninger Outline. (EN) (B) Skematisk tegning af embryo indlejring processen. De injicerede embryoner skal dechorionated og bedøvet. Embryoner overføres derefter til dækglasset-bund skålen og overskydende E3 Blå fjernes. Lav smelte agar bruges til at oprette separate kupler dækker hver foster. Orientere embryoner så halen er tættest på dækglasset. Vent to minutter, før du tilføjer agar dækker hele dækglas. Vent, indtil agaren er størknet før du flytter til billedet. (C) Skematisk tegning til at definere begreberne Z-interval, Z-stack, Z-dybde, tidsinterval tid varighed og 5D, der anvendes i protokollen og diskussion. Z-interval er defineret som afstanden mellem hvert billede som mikroskopet bevæger dybere ind i prøven for at skabe en Z-stak. Z-stakken er alle billeder taget gennem etprøve med den definerede Z-interval. Den strækning i en Z-stack definerer Z-dybde. Tidsinterval er den mængde tid mellem en Z-stakken og den næste Z-stakken for at skabe en tidsforskudt billede. Time varighed er den totale mængde tid brugt til billede. 5D er defineret som dimensionerne X, Y, Z, tid, og fluorescerende emission. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Time-Lapse Imaging Optager Flere Mitotiske begivenheder i en Live zebrafisk embryo. (A) Time-lapse stills fra en zoomet eksperiment i en AB vildtype, 24 HPF zebrafisk viser flere mitotiske begivenheder. Stjernerne peger i retning af syv celler i mitose. t = tiden gået i min. Scale bar = 5 um. (B) Antallet af mitotiske ceLLS observeret i AB og Aurb m / m zebrafisk haler ved 24 HPF. Mean ± st. dev., n = 3 embryoner / genotype. (C) Forholdet af mitotiske celler pr totale antal celler i AB og Aurb m / m zebrafisk haler ved 24 HPF. Mean ± st. dev., n = 3 embryoner / genotype. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Individuel Cell Analysis Optager Hver Mitotisk Fase og Mitotisk Varighed. (A) En celle valgt fra bredt felt visning af AB vildtype, 24 HPF zebrafisk embryo vist i figur 2A. Observeres (B) Division tid til AB og Aurb m / m celler og beregnet ud fra udlede kuvert bre nukleareakdown (NEB) ved den første observation af kondenseret kromatin i en celle til dannelse af to nye datterceller. n = 3 embryoner / genotype, n = 66 divisioner for AB, n = 29 divisioner for Aurb m / m, *** p-værdi <0,001. (C) AB vildtype celle er beskåret at visualisere fase progression gennem mitose . t = min. Scale bar = 5 um. (D) Aurb m / m celle beskåret at visualisere mitotisk progression gennem mitose som omfatter mitosestandsning resulterer i cytokinese fiasko og mikronuclei formation. Pile peger mod mikrokerner. t = tiden gået i min. Scale bar = 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.Single Cell Levende Imaging Optager Flere Mitotiske Mangler associeret med kromosom Segregation og Division i Mitotisk Mutant Zebrafisk. (A) et beskåret billede af en celle undergår kongression defekter i en esco2 + / m embryo. Den tynde pil overvåger venstre kromosom, der er trukket tilbage i metafaseplade. Den tykke pil overvåger den rigtige kromosom, der ikke trækkes tilbage ind i metafaseplade og udledes til dannelse af en mikronukleustest. Dobbeltpilen viser adskillelsen af retten kromosom, der ikke gjorde kongres på anafase indtræden. Mellemværker viser zoomet udsigten over de kromosomer, som undlod at kongressen. Mellemværker blev beskåret og lysstyrke forbedret til bedre visualisering. CAAX fluorescens blev fjernet for at visualisere kromosomerne lettere. Scale bar = 5 um. (B) A beskåret billede af en celle undergår mitosestandsning der resulterer i en multipolær division i en esco2 + / M embryo. Scale bar = 5 um. (C) et beskåret billede af en celle undergår samhørighed træthed resulterer i anafase brodannelse set af det trådlignende trække mellem de to kerner konstateret af konsollerne. Scale bar = 5 um. t = forløbet tid i min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Flere celledelinger kan visualiseres i en vid udsigt over en injiceret vildtype zebrafisk embryo (højreklik for at downloade).
Movie 2. Faser af mitose kan nemt visualiseres i en vildtype zebrafisk embryo (r ight klik for at downloade). Opdeling Nuclear kuvert er udledt af den uregelmæssige udseende kernen og provenuet mod kongression af søsterchromatider at danne en metafaseplade . Nøjagtig adskillelse forekommer, og giver to nye datterceller.
Movie 3. Levende billeddannelse af Aurb m / m embryo afslører kromosom missegregation, mislykkedes cytokinese, og mikronuclei dannelse (højreklik for at downloade). opdeling Nuclear kuvert er udledt af den uregelmæssige udseende kernen, kromosomer scatter til modsatte poler ikke er i stand til at danne en ordentlig metafaseplade, og fortsæt til at rotere om aksen udvide division tid af cellen. Cytokinese forekommer ikke resulterer i en 4N celle og flere mikrokerner.
Movie 4. kongression fejl er observeret i en esco2 + / m embryo (højreklik for at downloade). Opdeling Nuclear kuvert er udledt af den uregelmæssige udseende kernen. Efter metafaseplade er dannet, et par indienkelte kromosomer scatter til hver side. En individuel kromosom ud til venstre til sidst trukket tilbage ind i metafaseplade mens kromosomet til højre forbliver uden for metafaseplade og kan ses adskille søsterchromatider ved starten af anafase. Cellen udviser en forlænget division tid, men ultimative skel med potentiel mikronucleusdannelse.
Movie 5. Multi-polær division er observeret i en esco2 + / m embryo (højreklik for at downloade). Opdeling Nuclear kuvert er udledt af den uregelmæssige udseende kernen og derefter kromosomer fusionere til at danne en Y-form indicative af 3-spindel poler. Cellen udviser en forlænget division tid, men i sidste ende deler sig i 3 datterceller.
Movie 6. Præmatur søsterchromatidadskillelse og dannelse anafase bro observeres i en esco2 m / m embryo (højreklik for at downloade). Opdeling Nuclear kuvert er udledt af den uregelmæssige udseende kernen og derefter kromosomer scatter hele cellen i stand til at danne en ordentlig metafaseplade. Den kromatin decondenses før cytokinese og som celle deler, skaber en anafase bro mellem de to celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelse af denne fremgangsmåde tillader en at udlede fordelingen nuklear kappe, dannelse af en metafaseplade af mikrotubulus-kinetochore vedhæftninger, og adskillelse af søsterchromatider at danne to nye celler in vivo og in en tidsafhængig måde. Evnen til at iagttage mitose i zebrafisk er fordelagtig i forhold faste prøver og cellekultursystemer fordi cellerne, der afbildes i uforarbejdet fysiologi, vævet er transparent, som giver mulighed for fluorescerende proteiner, der skal anvendes, de udvikler relativt hurtigt, og time-lapse billeddannelse kan erhverves. Anvendelse af voksne zebrafisk for denne protokol er begrænset på grund af den begrænsede Z-dybde, der kan erhverves på grund af den tykkere væv, der ikke er den hud eller øjne. Mens transgene dyr, der udtrykker H2A.F / Z-EGFP og mCherry-CAAX kunne anvendes til samme formål, alsidighed og lethed af mRNA injektioner i forskellige mutant zebrafisk er fordelagtig i forhold genetiske krydsninger. I situationer, hvor mitotiske analyse erkræves på tre dage efter befrugtning (dpf) eller senere embryoner, ville transgene dyr være nødvendigt på grund af halveringstiden af RNA i denne hastig udvikling organisme.
Andre fluorescerende proteiner til at visualisere mitose er modtagelige for denne protokol. For eksempel H2B-GFP-mRNA er et alternativ til H2A.F / Z-EGFP for chromatin og tilvejebringer tilsvarende mærkning. Andre fluorescerende-mærkede proteiner, der kan anvendes i denne teknik omfatter POM121, centrin, EB1, Hec1, og EMTB som giver mulighed for levende i-embryo billeddannelse af de nukleare kuvert, centrioler, plus-end-mikrotubuli kinetochore og mikrotubuli, henholdsvis 32,47-51.
Denne protokol har flere vigtige imaging skridt, der skal udføres for at opnå kvalitet resultater: 1) Sørg for at optimere mRNA kvalitet og koncentration til at give de klogeste fluorescens og ingen toksicitet som muligt. Jo mere fluorescens vil føre til mindre laser eksponering og derfor mindre photobleaChing og fototoksicitet. 2) embryo skal være fuldt bedøvet, og sikker i agaren. Mindre bevægelser vil ændre resultaterne, kan ødelægge eksperimentet. 3) agarkoncentration skal være egnet til den fase af embryo ønskes afbildet. Ved 24 HPF og længere, 1% lavtsmeltende agarose er egnet. Hvis billeddannelse ved 12 HPF eller tidligere, skal en 0,3% agarose opløsningen anvendes 39. 4) ROI i embryoet bør være så tæt på dækglasset som muligt. Dette trin begrænser ikke en til billeddannelse af halen. Øjne, hud, dorsale region, æggeblomme, og fin fold er eksempler på andre områder, der kan bruge denne protokol.
Tiden er den afgørende faktor, der adskiller denne protokol fra imaging faste embryoner eller væv. Ved opsætning af Z-stack, Z-interval, time-lapse interval, og time-lapse varighed, er det vigtigt at huske på som led i forsøget (figur 1C). En vildtype celledeling varer som regel ca. 25 minutter ved 24 HPF. I ther eksempel har en 2 um Z-interval på 40 um af væv i en Z-stak, med en to minutters tidsinterval for to timer vist sig effektiv. Endvidere er der i fostre med defekte mitose, celler i en mitosestandsning vil højst sandsynligt være til stede, drastisk stigende celledeling gange. At erhverve flere fulde afdelinger, bør varigheden forøges, dvs. fra 2 timer til 4 timer. En længere erhvervelse tid vil udsætte prøven til mere lasereffekt og øge risikoen for fotoblegning og fototoksicitet. I dette tilfælde bør tidsintervallet mellem hvert Z-stack øges. Dynamiske kromosom bevægelser vil blive ofret ved at øge tidsintervallet mellem Z-stakke, men varigheden er opnået. Dette er nødvendigt, når imaging celledelinger, der kan vare over to timer.
Selvom det ikke var direkte diskuteret, kan denne protokol optimeres for at opnå en højere opløsning billede i Z-planet til mere præcist visualisere enkelte kromosom movements. For eksempel i figur 4A observeres to missegregated kromosomer. Kromosomet til højre (bemærket af den tykke pil) indledningsvis er lyse og i fokus, men dæmpes i de sidste par frames. Med en 2 um Z-interval, den uncongressed kromosom falder ind mellem Z-interval. Indfangning øjebliks bevægelser og singulære kromosomhændelser kan opnås ved at forøge opløsningen i Z-planet. For at gøre dette, zoome ind på en individuel celle ved hjælp af A1 Scan Area værktøj. Ved opsætning af Z-stak parametre, bruge en mindre Z-interval distance. En anbefalede interval er 0,5-1 um. Desuden vil mindske tidsintervallet mellem hvert Z stak skabe jævnere overgange mellem hver tidsramme, dvs. fra to minutter til 30 sek - 1 min. En advarsel til denne type billeddannelse er den begrænsede Z-dybde, der kan opnås. På grund af den mindre Z-interval og tidsinterval, vil mere væv udsættes for laserne i en mindre tidsramme. For at overvinde dette, smaller tid varighed kan bruges; men dette er også afhængig af, hvor længe forskeren ønsker at indfange divisioner.
En analogi, der kan hjælpe med disse ændringer er at tænke på en Z-stak som en harmonika. Afstanden mellem hver fold af bælgen er Z-interval og Z-dybde er repræsenteret ved længden af harmonika. I et tilfælde, hvor man ikke ønsker at opspare mere laser eksponering for prøven, som harmonika strækninger (øger Z-dybde), skal afstanden mellem læg i bælg (Z-interval) stige så godt. Den omvendte er sandt, at der som harmonika kontrakter, formindsker Z-dybde. Folderne af bælgen kontrakt samt, svarende til et fald i Z-interval. Denne analogi kan anvendes på faste og levende prøver. Kompleksiteten øges i denne protokol, når der tilsættes tid til ligningen. Der er en begrænset mængde tid, at harmonikaspiller kan udvide eller kontrakt harmonika. Denne repræsents tidsintervallet. For at dække mere afstand (Z-dybde) skal tidsintervallet øges. Samt, for at høre mere musik, skal man lytte efter en længere tid (tid varighed) Med hensyn til denne protokol, for at være vidne til flere celledelinger, skal varigheden stige. En blanding faktor at huske på er, at jo mere musik, der bliver spillet, jo mere træt harmonikaspiller. Dette er analogt til den endelige dimension, fluorescens. Jo mere laser eksponering prøven er givet, jo mere fotoblegning og fototoksicitet (træthed) bliver et problem.
Sammenfattende detaljer denne protokol en metode til at visualisere mitose i en live zebrafisk embryo, der gælder for forskellige analyser; 1) division nummer to) division tid 3) division skæbne og 4) høj opløsning kromatin dynamik. Flere muligheder for at visualisere mitotiske komponenter lige fra mikrotubuli-kinetochore vedhæftede filer til centriole dynamik kan anvendes. Kombinere evnen tilimaging mitose in vivo med de seneste fremskridt inden genom redigering i zebrafisk vil gøre det nemt at generere mutanter i forskellige aspekter af mitose at modellere sygdom hos mennesker i et hvirveldyr organisme 25,26,52-56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21 G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N.
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A.
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O'Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J.
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd,, J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O'Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
