Introduction
Gli animali usano chemosensation distinguere condizioni vantaggiose a parte condizioni svantaggiose. Questa percezione può essere fondamentale per cose come determinare la migliore fonte di cibo, evitando sostanze tossiche o determinare il miglior partner di accoppiamento 1. Chemosensation è spesso diviso in due componenti sensoriali: olfatto e sensi gustative. Una principale caratteristica distintiva di questi sensi è che l'olfatto (odore) è usato per campionare l'ambiente chimico gassoso circostante mentre gustation (gusto) richiede il contatto fisico con un substrato non volatile. Entrambe le modalità sensoriali stimolano risposte neurologiche che vengono elaborati e decodificati nel cervello per produrre l'attrattiva o repulsiva comportamento appropriato 2. Questi sensi sono quindi fondamentale per la sopravvivenza degli animali.
La mosca della frutta Drosophila melanogaster è un organismo modello che continua a crescere in popolarità per l'uso in capireing come gli insetti percepiscono odore e sapore. Frutta mosche offrono enormi vantaggi rispetto ad altri sistemi modello per la ricchezza di strumenti genetici disponibili per la dissezione di percorsi molecolari, cellulari e comportamentali. Il lavoro nel corso degli ultimi 15 anni è stato particolarmente determinante nel caratterizzare le identità cellulari specifici, recettori neuronali, e meccanismi coinvolti sia in odore e il sapore di segnalazione. Ora, il potere della genetica della Drosophila viene usata per chiarire ulteriormente come questi processi sono codificati al singolo neurone e il circuito unico livello 3-6. Pertanto, le analisi che forniscono facilmente lanciati letture di alterazioni percorsi sensoriali sono di vitale importanza per il continuo avanzamento di questi campi.
Mentre molto si sa su come i segnali olfattivi sono codificati ed elaborati nel cervello, e tanto meno è capito su meccanismi simili nel percorso gustativo. Descriviamo qui un protocollo che può essere utilizzato per verificare preferen gustoce in Drosophila. Drosophila, come i mammiferi, in genere preferiscono i composti di degustazione di dolci al contrario di composti sapore amaro. Qualsiasi combinazione di queste fonti di cibo può essere utilizzato in questo progetto sperimentale per determinare come note alterazioni genetiche influenzano la scelta gusto. Inoltre, le strategie di intervento farmacologico può analogamente essere valutati per i loro effetti sulla preferenza di gusto degli animali. La facilità e la flessibilità di questo test lo rende un paradigma utile per comprendere la natura della percezione gustativa in Drosophila.
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Protocol
1. fame
- Preparare volare fiale fame saturando un batuffolo di cotone con 18,2 MW acqua sul fondo di una fiala mosca standard. In alternativa, allo stesso modo di saturare una piccola striscia di carta da filtro con 18,2 MW acqua e posto in un angolo all'interno della fiala.
- Raccogliere vola in gruppi di circa 100 animali su un rilievo di CO 2 e quindi aggiungere le mosche per una fiala preparato.
Nota: i migliori risultati si ottengono con animali che sono meno di 5 giorni. Tuttavia, l'esatta età degli animali può essere controllata come variabile sperimentale per determinare le variazioni di preferenza di gusto nel tempo. - Utilizzare un batuffolo di cotone o schiuma tappo per fissare le fiale chiuse. Posizionare le fiale dalla loro parte in un incubatore ambiente controllato. Mantenere la temperatura a 25 ° C, e l'umidità superiore al 70%. Lascia fiale intatte per 24 ore.
2. Taste Preferenza Assay
- Preparare tutti tastants per il saggio lo stesso giorno uns test.
Nota: I tastants esatta da utilizzare varia a seconda domanda sperimentale viene chiesto. I seguenti sono esempi di tastants utilizzati in questo protocollo. Vedere la sezione 4 per ottimizzazioni.- Preparare il controllo tastant (1 mM saccarosio) mediante la combinazione di 10 ml di 100 mm soluzione di saccarosio, 13 ml di colorante alimentare rosso, e 977 ml di 18,2 MW acqua.
- Preparare tastant sperimentale (5 mm saccarosio) mediante la combinazione di 50 ml di 100 mm soluzione di saccarosio, 10 ml di colorante alimentare blu, e 940 ml di 18,2 MW acqua.
- Rendere camere dosaggio usando da 100 mm x 15 mm piatto di plastica standard di petri preparato nel seguente modo:
- Mettere tre gocce 10 microlitri di controllo tastant più vicino al bordo del piatto a ore 12 e un altro 3 gocce a ore 6. Assicurarsi che la distanza tra gocce è simile.
- Inserire tre gocce 10 microlitri di tastant sperimentale vicina al bordo della piastra a ore 3 e unaltri 3 gocce alle ore 9. Assicurarsi che la distanza tra gocce è simile.
- Ripetere i punti 2.2.1 e 2.2.2 per il numero di repliche, se lo desideri.
- Vuoto 1 fiala di ~ 100 mosche di fame su un tappetino di CO 2 giusto il tempo per anestetizzare gli animali (circa 10 sec). Spennellate gli animali in mezzo a una camera di test preparata e coprire con il coperchio piatto.
Nota: più lunghi periodi di esposizione CO 2 dovrebbe essere evitato per migliorare i tempi di recupero e l'interferenza con il limite di comportamento alimentare. L'esposizione al ghiaccio (~ 5 min) può essere utilizzato per anestetizzare per evitare di CO 2 effetti comportamentali che possono derivare da un'esposizione limitata. - Posizionare la camera di test in una scatola di cartone opaco. Assicurarsi di etichettare l'esterno della scatola con la condizione e il genotipo in fase di test.
- Posizionare l'intera impostazione (camera di analisi contenuta in scatola di cartone a partire dal punto 2.4) in un incubatore a 25 ° con almeno il 70% di umidità per 2 ore. Ripetere i passaggi 2.3 tramite 2.5 per tutte le repliche.
- Dopo 2 ore, posizionare le camere di test, ancora contenuti in scatole di cartone, direttamente in un congelatore a -20 ° C fino al momento per la quantificazione.
3. Gusto Preferenza Assay Quantificazione
- Lasciare una sola camera di test per riscaldare a temperatura ambiente (circa 5 min).
- Sotto un microscopio dissezione, utilizzando un pennello o un paio di pinze, animali di gruppo in base al colore della loro addome: rosso, blu, viola o trasparente (Figura 1).
- Registrare il numero di animali in ciascun gruppo. Considerare gli animali chiare per non hanno partecipato al test e quindi non includerli in tutti i calcoli.
- Calcolare l'indice preferenza, secondo una delle seguenti formule:
- Se il tastant sperimentale di interesse viene aggiunto il colorante rosso, quindi utilizzare (N + rosso 0,5N viola) / (N + N rosso N purpl blue +e).
- Se il tastant sperimentale viene aggiunto il colorante blu, quindi regolare l'equazione (N blu + 0,5 N viola) / (N + N blu rosso + N viola).
- Ripetere i calcoli per tutte le condizioni sperimentali e replicati.
4. Ottimizzazione del Gusto Preferenza Assay
- Empiricamente determinare la concentrazione di indicatori colorante alimentare per essere utilizzato in modo colorante alimentare non influenza l'esito del test gusto, come segue:
- Preparare 4 tastants utilizzando la stessa mescola di base (ad esempio, 5 mM saccarosio), come indicato al punto 2.1, ma omettere il colorante alimentare.
- Aggiungere 1,3% colorante alimentare rosso per una delle sostanze sapide. Effettuare le restanti 3 tastants con prodotti alimentari blu coloranti di concentrazioni variabili in ogni tubo (ad esempio 0,6%, 1% e 1,3%).
- protocollo completo passi 2.2 attraverso 3.4 per ogni coppia tastant: 1,3% vs. 0,6% rosso blu; 1,3% rispetto al rosso 1% e il blu1,3% contro 1,3% rosso blu.
- Ripetere il passaggio 4.1.1-4.1.3 con diverse percentuali di colorante alimentare blu fino alle medie indice preferenza un valore pari a 0 (Figura 2).
Nota: Come punto di partenza, 1,3% colorante alimentare rosso accoppiato con 1% colorante alimentare blu produce in genere buoni risultati. Se nessuna concentrazione soddisfacente di colorante alimentare blu può essere abbinato al 1,3% di colorante, poi passo 4.1.1 tramite 4.1.3 può essere ripetuta con concentrazioni variabili di colorazione rossa e una costante concentrazione di colorante alimentare blu. - Analizzare tutte le condizioni per essere testati con le stesse concentrazioni di colorante alimentare ottimizzati.
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Representative Results
Alcuni risultati tipici da saggi di preferenza di gusto sono riportati di seguito. Nella maggior parte degli esperimenti qualche variazione di intensità di colorazione addominale sarà visto (Figura 1). Qualsiasi colorazione nell'addome se intensa o debole è considerato un ingestione positivo. E 'quindi consigliabile per i ricercatori a segnare animali, mentre ciechi alla condizione sperimentale in modo da limitare i potenziali errori.
E 'anche importante scegliere concentrazioni di coloranti alimentari non influenzano il risultato del test preferenza. Un esempio delle conseguenze dell'utilizzo di varie concentrazioni di colorante alimentare è mostrato in Figura 2 In questo esempio, la quantità di colorante rosso cibo era mantenuta a 1,3%, mentre la quantità di colorante alimentare blu era vario:. 0,6%, 1%, e 1,3 %. Ogni colorante inserito in 5 mM di saccarosio per garantire un'alta percentuale dei partecipanti al test. Il prefere gustodosaggio SNO stata quindi eseguita su 3 replicati di ciascuna condizione e l'indice di preferenza calcolato secondo l'equazione 3.4.1. Uno cento colorante blu accoppiato con colorante rosso 1,3% è risultato essere ottimale per questi esperimenti come dimostrato dal fallimento di animali scegliere presenti saccarosio in un colore sull'altro (valore di indice preferenza vicino a 0,5). Quando colorante blu solo lo 0,6% è stato accoppiato con colorante rosso 1,3%, animale chiaramente scelto il (valore di indice preferenza vicino a 1) campioni saccarosio colorante rosso, anche se la concentrazione di saccarosio era identica per entrambi i colori. Utilizzando la stessa quantità di colorante alimentare ha provocato un leggero, ma statisticamente significativo, la preferenza per i campioni di saccarosio contenente colorante blu (valore dell'indice preferenza <0,5). I valori ottimali individuati qui sono stati trovati a dare risultati coerenti oltre un raggio di 10 volte delle concentrazioni di saccarosio che vanno da 1 mm a 10 mm. Tuttavia, le quantità individuate qui devono essere considerati valori di partenza e Concentrati attualions dovrebbe essere calcolato empiricamente per tutte le condizioni per essere testati prima di eseguire campioni sperimentali.
La scelta di quale equazione da utilizzare per il calcolo dell'indice di preferenza si basa sulla configurazione dell'esperimento e l'attrazione contro obiettivi avversione dell'esperimento. Come mostrato nell'esempio in figura 3, linea dimostrato una preferenza per alte concentrazioni di saccarosio rispetto concentrazioni inferiori e tale preferenza può essere invertito con l'aggiunta di acido. L'equazione (N blu + 0,5 N viola) / (N + N blu rosso + N viola) da 3.4.2 è stato utilizzato per calcolare l'indice di preferenza per 3 repliche di ogni condizione sperimentale in quanto il composto di interesse è stato posto nel colorante blu . Un indice di preferenza vicino a 1 indica che quando le viene offerta la scelta tra 1 mM saccarosio (in rosso) e 5 mm di saccarosio (in blu), le mosche quasi sempre scelto il più alto Conc zione. Al contrario, un secondo gruppo di mosche è stato dato le stesse opzioni tranne che l'acido acetico al 10% è stato combinato con l'mm Opzione di saccarosio 5 (in blu). Mosche quasi completamente evitato questa situazione come visto con l'indice preferenza near 0, coerente con risposte noti ad elevate concentrazioni di acido 7.
Figura 1: Gusto di preferenza i risultati del test. sono mostrati alcuni esempi nella variazione della colorazione addominale. Rosso scuro ingerito (A). Rosso chiaro ingerito (B). Blu scuro ingerito (C). Azzurro ingerito (D). Addomi viola sono considerati quando appare tutta la colorazione viola (E), o quando distinte regioni del ventre mostrano porzioni di rosso (punta di freccia) e porzioni separate di blu (freccia) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Controllo per gli effetti di cibo colorazione. L'aggiunta di colorante alimentare per i tastants non dovrebbe avere alcun effetto sulla preferenza di gusto degli animali. Variando la concentrazione di colorante blu pur mantenendo una costante concentrazione di colorante rosso rivelato una combinazione ottimale di 1,3% rosso al 1,0% blu. Questo è indicato da un valore di indice preferenza vicino 0,5. I valori sono la media ± la deviazione standard. * p <0.05, *** p <test t 0.001 da due lati. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Il saggio gusto preferenza utilizzato per attrazione e avversione Drosophila sono naturalmente attratti ad alte concentrazioni di saccarosio come si è visto da un valore di indice di preferenza vicino a 1 quando data la possibilità di scegliere tra 5 mM di saccarosio (in blu) e 1 mm di saccarosio (in rosso) . Aggiunta di un composto aversive come acido all'opzione saccarosio 5 mM inverte questa scelta per alta saccarosio come l'indice preferenza scende al vicino 0. I valori sono la media ± la deviazione standard. *** p <0,0001 dal test t a due facciate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo descritto un protocollo semplice ma efficace per determinare preferenza di gusto in Drosophila. Le versioni di questo test sono abitualmente utilizzati in esperimenti per determinare i contributi di recettori gustativi (GRS) a percepire le diverse qualità (amaro, dolce, acido, salato e umami) di composti di gusto. Il genoma di Drosophila contiene circa 60 geni che codificano 68 individuati recettori gustativi da splicing alternativo 8,9. Tuttavia, altre proteine come recettori del glutammato ionotropi e canali TRP sono stati anche dimostrato di giocare un ruolo nel gusto 10-13. Pertanto, non vi è ampia diversità nel potere discriminatorio del gusto negli insetti. Inoltre, a differenza di recettori per l'olfatto, recettori del gusto sono espressi nelle cellule situate in tutto il volo. Sensilla contenente combinazioni di neuroni che esprimono diversi recettori del gusto sono disponibili sul labello, gambe, ali e ovipositer 14. Come tale,Drosophila si basano sulla discriminazione gusto per una serie di comportamenti al di là dell'acquisizione nutrizione tra cui il corteggiamento e la deposizione delle uova.
Questa tecnica di analisi gusto può essere applicata per risolvere molte questioni sperimentali differenti. Ad esempio, dal gusto, corteggiamento, delle uova e comportamenti di posa sono considerazioni importanti per molti animali, questo protocollo può essere scalabile per altri insetti importanti come le zecche e zanzare. Tale avanzamento potrebbe rivelarsi utile per la gestione dei vettori di malattie e lo sviluppo di pesticidi. Inoltre, questo test potrebbe essere scalato per l'uso in schermi genetiche in avanti che hanno fatto Drosophila un potente strumento così indagine per decenni. La comprensione molecolare completa delle vie del gusto non è noto. Identificare le interruzioni in nuovi geni che mediano preferenze di gusto in questo saggio potrebbe contribuire a riempire importanti lacune nella conoscenza del circuito gusto. Inoltre, l'importanza di modelli preclinici di malattia continua ad aumentare, schermi farmacologici che influenzano i meccanismi di segnalazione gustative possono essere facilmente eseguite con l'aggiunta di composti terapeutici per le tastants in questo protocollo. Pertanto, il saggio robusto qui descritto è uno strumento potenzialmente utile per molte linee differenti di ricerca.
Ci sono molti vantaggi di utilizzare questo protocollo per l'analisi di preferenza di gusto. Le prime versioni di questo paradigma alimentazione utilizzato solo un colore unico per il rilevamento di tastants ingeriti e le applicazioni attuali popolari fanno uso di piastre da microtitolazione per la consegna tastant 15-18. La camera di test piastra di Petri utilizzato in questo protocollo è un prodotto un po 'comune che si trova nei laboratori non sono attualmente preparati per eseguire test del gusto. La probabilità di avere una camera di test già a portata di mano, quindi, aiuta a facilitare la sperimentazione di nuove ipotesi, senza tempo o denaro investimenti in nuove attrezzature. Inoltre, la combinazione di utilizzare coloranti blu e rosso è utile per garantire che tuttigli animali contati nell'esperimento in realtà hanno partecipato all'esperimento. Anche dopo 24 ore di fame, alcuni animali sani con addome chiare successivi al periodo di alimentazione possono essere visti. Eliminando questi animali dal calcolo dell'indice preferenza è necessario garantire una misurazione accurata della popolazione. Inoltre, dopo la fame alcuni animali invariabilmente muoiono prima che siano in grado di partecipare al test. Mentre alcuni animali morti possono essiccare e può essere facilmente rimossa prima di conteggio, altri animali morti possono essere più difficili da identificare. L'inclusione di colorante in entrambe scelte alimentari conseguenza, assicura che solo animali sani che consumano una fonte di cibo sono considerati per l'esperimento. Questo riduce notevolmente la variabilità dei risultati che si possono vedere nelle versioni singolo colore di questo test. Inoltre, l'uso di due colori permette anche animali che si nutrono di entrambi i substrati siano identificati mediante colorazione viola misto in loro addomi. Questi animali are importante perché dimostrano che alcuni individui possono avere preferenze più deboli rispetto a tutto il gruppo. Va notato che abbiamo avuto anche successo con blu e giallo coloranti alimentari per questo dosaggio gusto per adulti in cui gli animali si nutrono di entrambi i substrati mostrano addome verdi. In questo contesto, abbiamo trovato che gli addomi gialli sono un po 'meno ovvio per segnare di addomi rosse, ma comunque alcuni ricercatori potrebbero preferire questa opzione. Come con i colori utilizzati in questo protocollo, un giusto equilibrio di coloranti alimentari deve essere empiricamente determinato a garantire i coloranti non hanno un effetto sulla preferenza animali.
Anche se questo test gusto preferenza è bravo a determinare come una popolazione di mosche risponde a diverse tastants, non fornisce alcuna informazione sulle risposte di animali singoli o l'assunzione di cibo vero e proprio. Altri test che vengono comunemente utilizzati per lo studio gusto nei sistemi di Drosophila offrono una migliore risoluzione di questi parametri 19 </ Sup>. In particolare, il saggio estensione proboscide è molto utile per monitorare la risposta comportamentale effettivo di singoli mosche di gocce di liquido alimentare. Allo stesso modo un paradigma di alimentazione capillare (CAFE) offre un mezzo robusto di valutare la quantità di composti ingerito in singoli mosche, con il vantaggio che il saggio è in grado di essere facilmente monitorati per lunghi periodi di tempo. Un altro limite del saggio gusto basato sulla popolazione ha qui risiede nella natura in qualche modo personale di punteggio. Come illustrato in figura 1 vi è sempre un certo grado di variazione nella quantità di cibo consumato e / o per escrezione da ciascun animale. Pertanto l'intensità del colore varia addominale. E 'buona pratica per i ricercatori a segnare gli animali mentre ciechi alle condizioni della piastra. Per realizzare ciò, si raccomanda di evitare di scrivere identità tastant sulle piastre ma etichettare le scatole le piastre sono disposte in modo che le piastre possono essere contati come imparziale un manner possibile. E 'anche prudente per confermare i risultati ruotando il tastant di interesse per i colori alternati in esperimenti separati. Questa ulteriore analisi dovrebbe garantire robusta precisione dei risultati.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
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