Introduction
Los animales usan para distinguir chemosensation condiciones ventajosas, aparte de las condiciones desventajosas. Esta percepción puede ser crítico para cosas tales como la determinación de la mejor fuente de alimento, evitar sustancias tóxicas o determinar el mejor socio de acoplamiento 1. Chemosensation a menudo se divide en dos componentes sensoriales: sentidos olfativos y gustativos sentidos. Un principal característica distintiva de estos sentidos es que el olfato (olor) se utiliza para muestrear el ambiente químico gaseoso circundante mientras gustation (sabor) requiere contacto físico con un sustrato no volátil. Ambas modalidades sensoriales estimulan respuestas neurológicas que son tratados y decodificados en el cerebro para producir el comportamiento de atracción o repulsión adecuada 2. Estos sentidos son de importancia crítica para la supervivencia del animal.
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un organismo modelo que sigue creciendo en popularidad para su uso en entendering cómo los insectos perciben olor y sabor. moscas de la fruta ofrecen enormes ventajas sobre otros sistemas modelo debido a la gran cantidad de herramientas genéticas disponibles para la disección de las vías moleculares, celulares y de comportamiento. Trabajo en los últimos 15 años ha sido especialmente importante en la caracterización de las identidades celulares específicos, receptores neuronales, y los mecanismos que intervienen en tanto olor y el sabor de señalización. Ahora, el poder de la genética de Drosophila se utiliza para aclarar aún más cómo estos procesos se codifican en el nivel sola neurona y simple circuito 3-6. Por lo tanto, los ensayos que proporcionan anotó fácilmente lecturas de las alteraciones en las vías sensoriales son vitales para el avance continuado de esos campos.
Mientras que una gran cantidad se sabe acerca de cómo las señales olfativas son codificados y procesados en el cerebro, y mucho menos se sabe acerca de los mecanismos similares en la vía gustativa. Se describe aquí un protocolo que se puede utilizar para determinar preferen gustativasce en Drosophila. Drosophila, como los mamíferos, por lo general prefieren compuestos de sabor dulce en lugar de compuestos de sabor amargo. Cualquier combinación de estas fuentes de alimentos se puede utilizar en este diseño experimental para determinar cómo las alteraciones genéticas conocidas afectan a la elección gusto. Además, las estrategias de intervención farmacológica de manera similar se pueden evaluar por sus efectos sobre la preferencia del gusto de los animales. La facilidad y flexibilidad de este ensayo hace que sea un paradigma útil para comprender la naturaleza de la percepción gustativa en Drosophila.
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Protocol
1. El hambre
- Preparar volar viales de hambre por saturación de una bola de algodón con el 18,2 mO agua en el fondo de un vial mosca estándar. Por otra parte, de manera similar saturar una pequeña tira de papel de filtro con 18,2 mO agua y el lugar en un ángulo dentro del vial.
- Recoger las moscas en conjuntos de ~ 100 animales en una almohadilla de CO 2 y luego agregar las moscas a un vial preparado.
Nota: Los mejores resultados se obtienen con los animales que están a menos de 5 días de edad. Sin embargo, la edad exacta de los animales puede ser controlado como una variable experimental para determinar los cambios en la preferencia de sabor con el tiempo. - Utilice un tapón de algodón o espuma para asegurar los viales cerrados. Colocar los viales en su lado en una incubadora con ambiente controlado. Mantener la temperatura a 25 ° C, y la humedad por encima de 70%. Deja viales sin tocar durante 24 horas.
Ensayo Preferencia 2. Sabor
- Preparar todos los estimulantes del gusto para el ensayo en el mismo día unas prueba.
Nota: Los estimulantes del gusto exacta a usar variará dependiendo de la pregunta experimental que se les pide. Los siguientes son ejemplos de estimulantes del gusto utilizados en este protocolo. Ver la sección 4 para optimizaciones.- Preparar el control saborizante (sacarosa 1 mM) mediante la combinación de 10 l de solución de sacarosa 100 mM, 13 l de colorante rojo, y 977 l de agua 18.2 mO.
- Preparar saborizante experimental (sacarosa al 5 mM) mediante la combinación de 50 l de solución de sacarosa 100 mM, 10 l de colorante azul, y 940 l de agua 18.2 mO.
- Hacer cámaras de ensayo usando una 100 mm x 15 mm placa de petri de plástico estándar preparado de la siguiente manera:
- Coloque tres gotas 10 l de saborizante de control más cercano al borde de la placa a las 12 horas y las otras 3 gotas a las 6 h. Asegúrese de que la separación entre gotas es similar.
- Coloque tres gotas 10 l de saborizante experimental más cercana al borde de la placa a las 3 en punto y unaotras 3 gotas a las 9 en punto. Asegúrese de que la separación entre gotas es similar.
- Repita los pasos 2.2.1 y 2.2.2 para tantas repeticiones como se desee.
- 1 frasco de vacío ~ 100 moscas hambrientas en una almohadilla de CO 2 sólo el tiempo suficiente para anestesiar a todos los animales (aproximadamente 10 segundos). Cepillo de los animales en el medio de una cámara de ensayo preparado y cubrir con la tapa de la placa.
Nota: El aumento de los periodos de exposición al CO 2 se debe evitar para mejorar el tiempo de recuperación y limitar la interferencia con el comportamiento alimentario. La exposición a hielo (~ 5 min) puede ser utilizado para anestesiar para evitar CO 2 efectos de comportamiento que pueden surgir de incluso una exposición limitada. - Coloque la cámara de ensayo en una caja de cartón opaco. Asegúrese de marcar la parte exterior de la caja con la condición y el genotipo siendo probados.
- Coloque la configuración completa (cámara de ensayo contenida dentro de la caja de cartón desde el paso 2.4) en un 25 ° C incubadora con al menos un 70% de humedad durante 2 horas. Repita los pasos 2.3 a través 2.5 para todas las repeticiones.
- Después de 2 horas, colocar las cámaras de ensayo, todavía contenidas dentro de cajas de cartón, directamente en un congelador a -20ºC hasta que esté listo para la cuantificación.
3. Ensayo de Sabor Preferencia Cuantificación
- Permitir que una sola cámara de ensayo se caliente a la temperatura ambiente (aproximadamente 5 minutos).
- Bajo un microscopio de disección, usando un cepillo o un par de pinzas, los animales del grupo basado en el color de su abdomen: rojo, azul, púrpura o clara (Figura 1).
- Registre el número de animales en cada grupo. Considere animales claras para no hayan participado en el ensayo y por lo tanto no los incluyen en los cálculos.
- Calcular el índice de preferencia de acuerdo con una de las siguientes ecuaciones:
- Si se añade el saborizante experimental de interés para el tinte rojo, a continuación, utilizar (N + rojo púrpura 0,5 N) / (N + N rojo azul + N purple).
- Si se añade el saborizante experimental para el colorante azul, y luego ajustar la ecuación de (N + azul púrpura 0,5 N) / (N + N azul rojo púrpura + N).
- Repetir los cálculos para todas las condiciones experimentales y repeticiones.
4. Optimización de Ensayo de preferencia de sabor
- Empíricamente determinar la concentración de los indicadores de colorante de alimentos para ser usado de modo colorante de alimentos no afecta el resultado del ensayo de sabor, como sigue:
- Preparar 4 estimulantes del gusto usando el mismo compuesto de base (por ejemplo, sacarosa al 5 mM) como se indica en el paso 2.1, pero omitir el colorante de alimentos.
- Añadir 1,3% de colorante rojo a uno de los estimulantes del gusto. Hacer los 3 restantes con estimulantes del gusto azul colorante de alimentos de las concentraciones que varían en cada tubo (por ejemplo, 0,6%, 1% y 1,3%).
- protocolo completo los pasos 2.2 a 3.4 para cada par saborizante: 1,3% frente a 0,6% de azul rojo; 1,3% frente a 1% de color rojo y azul1,3% frente a 1,3% de azul rojo.
- Repita el paso 4.1.1-4.1.3 con diferentes porcentajes de colorante azul hasta los promedios del índice de preferencia un valor de 0 (Figura 2).
Nota: Como punto de partida, un 1,3% de colorante rojo junto con 1% de colorante azul normalmente da buenos resultados. Si hay concentración satisfactoria de colorante azul se puede adaptar al 1,3% de colorante, a continuación, paso 4.1.1 a través de 4.1.3 se puede repetir con diferentes concentraciones de colorante rojo y una concentración constante de colorante azul. - Analizar todas las condiciones de la prueba con las mismas concentraciones de colorantes de alimentos optimizados.
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Representative Results
Algunos resultados típicos de los ensayos de preferencias gustativas se muestran a continuación. En la mayoría de los experimentos alguna variación en la intensidad de la coloración abdominal se verá (Figura 1). Cualquier coloración en el abdomen ya sea intensa o débil se considera una ingesta positivo. Por tanto, es aconsejable que los investigadores para anotar animales mientras ciegos a la condición experimental de modo que se limiten los posibles sesgos.
También es importante elegir las concentraciones de los colorantes de alimentos que no afectan el resultado del ensayo de preferencia. Un ejemplo de las consecuencias de usar varias concentraciones para colorear alimentos se muestra en la Figura 2 En este ejemplo, la cantidad de colorante rojo para alimentos se mantuvo a 1,3%, mientras que la cantidad de colorante de alimentos azul se varió:. 0,6%, 1% y 1,3 %. Cada tinte se añadió a la sacarosa 5 mM para asegurar un alto porcentaje de los participantes en el ensayo. El sabor prefereentonces ensayo NCE se realizó en 3 réplicas de cada condición y el índice de preferencia calculado según la ecuación en 3.4.1. El uno por ciento de tinte azul junto con un tinte rojo 1,3% se encontró que era óptima para estos experimentos como lo demuestra el hecho de que los animales para elegir sacarosa presente en un color sobre el otro (valor de preferencia índice de cerca de 0,5). Cuando el colorante azul sólo el 0,6% fue emparejado con colorante rojo 1,3%, animales eligieron claramente el (valor de índice de preferencia cerca de 1) muestras de sacarosa de colorante rojo, a pesar de que la concentración de sacarosa fue idéntica para ambos colores. El uso de cantidades iguales de colorantes en los alimentos como consecuencia una ligera, aunque estadísticamente significativa, la preferencia por las muestras de sacarosa que contienen colorante azul (valor de índice de preferencia <0,5). Se encontró que los valores óptimos identificados aquí para dar resultados consistentes en un intervalo de 10 veces de las concentraciones de sacarosa que van desde 1 mM a 10 mM. No obstante, las cantidades identificadas aquí se deben considerar los valores y concentrati reales a partirons debe calcularse empíricamente para todas las condiciones para ser probados antes de ejecutar muestras experimentales.
La elección de la ecuación de utilizar para el cálculo del índice de preferencia se basa en la configuración del experimento y la atracción frente a objetivos de aversión del experimento. Como se muestra en el ejemplo de la Figura 3, las moscas demostraron una preferencia por las altas concentraciones de sacarosa frente a concentraciones más bajas y esta preferencia se pueden invertir con la adición de ácido. La ecuación (N azul + 0,5 N púrpura) / (azul + N + N rojo púrpura N) a partir de 3.4.2 se utilizó para calcular el índice de preferencia por 3 repeticiones de cada condición experimental ya que el compuesto de interés se colocó en el colorante azul . Un índice de preferencia cerca de 1 indica que cuando se les ofrece la posibilidad de elegir entre 1 mM de sacarosa (en rojo) y sacarosa al 5 mM (en azul), las moscas casi siempre eligió la más alta concentr ación. Por el contrario, una segunda agrupación de las moscas se le dio las mismas opciones, excepto que el ácido acético al 10% se combinó con la opción de sacarosa 5 mM (en azul). Las moscas casi completamente evitado esta situación como se ha visto con el índice de preferencia cerca de 0, consistente con las respuestas conocidos a altas concentraciones de ácido 7.
Figura 1: preferencia del gusto resultados del ensayo. Se muestran algunos ejemplos en la variación de la coloración abdominal. Ingerido rojo oscuro (A). Ingerido luz roja (B). Azul oscuro ingerido (C). Azul claro ingerido (D). Abdómenes púrpura se consideran cuando toda la coloración púrpura aparece (E), o cuando distintas regiones de las porciones abdomen demostración de rojo (punta de flecha) y porciones separadas de azul (flecha) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El control de los efectos de coloración de alimentos. La adición de colorante de alimentos para los estimulantes del gusto no debe tener ningún efecto sobre la preferencia del gusto de los animales. La variación de la concentración de colorante azul mientras se mantiene una concentración constante de colorante rojo reveló una combinación óptima de 1,3% de rojo a 1,0% de azul. Esto se indica por un valor de índice de preferencia cerca de 0.5. Los valores son la media ± desviación estándar. * p <0,05, *** p <t de Student 0,001 a partir de dos caras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. El ensayo de preferencia de sabor utilizado para la atracción y la aversión Drosophila son naturalmente atraídos por las altas concentraciones de sacarosa como se ve por un valor de índice de preferencia cerca de 1 cuando se les da la posibilidad de elegir entre sacarosa al 5 mM (en azul) y sacarosa 1 mM (en rojo) . La adición de un compuesto de aversión tales como el ácido a la opción de sacarosa 5 mM invierte esta opción para alta sacarosa como el índice de preferencia cae a cerca de 0. Los valores son la media ± la desviación estándar. *** p <0,0001 de la prueba t de Student bilateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito un protocolo simple pero eficaz para determinar preferencia de sabor en Drosophila. Las versiones de este ensayo se utilizan habitualmente en experimentos para determinar las contribuciones de los receptores gustativos (gr) para percibir las diferentes calidades (amargo, dulce, agrio, salado y umami) de los compuestos del sabor. El genoma de Drosophila contiene aproximadamente 60 genes que codifican los receptores gustativos 68 identificados por splicing alternativo 8,9. Sin embargo, otras proteínas tales como los receptores de glutamato ionotrópicos y los canales TRP también se han demostrado desempeñar un papel en el sabor 10-13. Por lo tanto, existe una gran diversidad en el poder discriminatorio del gusto en los insectos. Además, a diferencia de los receptores de olor, los receptores del gusto se expresan en células ubicadas en todo el vuelo. Sensilla que contienen combinaciones de neuronas que expresan diferentes receptores del gusto se puede encontrar en las labellum, piernas, alas y ovipositor 14. Como tal,Drosophila se basan en la discriminación gusto por una serie de comportamientos más allá de la adquisición de la nutrición incluyendo el cortejo y la puesta de huevos.
Esta técnica de análisis de sabor se puede aplicar para tratar muchos diferentes preguntas experimentales. Por ejemplo, ya que los comportamientos que ponen sabor, cortejo, y huevo son consideraciones importantes para muchos animales, este protocolo puede ser escalable a otros insectos importantes, tales como las garrapatas y los mosquitos. Para esta promoción podría ser útil para la gestión de los vectores de enfermedades y el desarrollo de pesticidas. Además, este ensayo puede ser ampliado para su uso en pantallas adelante genéticos que han hecho de Drosophila una poderosa herramienta de investigación durante décadas. La comprensión molecular completa de las vías de sabor no se conoce. La identificación de alteraciones en genes nuevos que median en las preferencias de sabor en este ensayo podría ayudar a rellenar importantes lagunas en el conocimiento de circuito gusto. Además, como la importancia de los modelos preclínicos de la enfermedad concontinúa aumentando, pantallas farmacológicos que afectan a los mecanismos de señalización gustativas se pueden realizar fácilmente mediante la adición de compuestos terapéuticos a los estimulantes del gusto en este protocolo. Por lo tanto, el sólido ensayo descrito aquí es una herramienta potencialmente valiosa para muchas líneas diferentes de investigación.
Hay varias ventajas de utilizar este protocolo para el análisis de la preferencia de sabor. Las primeras versiones de este paradigma de alimentación utilizado un solo color para la detección de estimulantes del gusto ingeridas y las aplicaciones actuales populares hacen uso de placas de microtitulación para la entrega saborizante 15-18. La cámara de ensayo de placa de Petri utilizada en este protocolo es un producto algo común que se encuentra en los laboratorios no preparados actualmente para realizar ensayos de sabor. La probabilidad de tener una cámara de ensayo ya en la mano, por lo tanto, ayuda a facilitar la comprobación de nuevas hipótesis sin tiempo ni dinero inversión en nuevos equipos. Además, la combinación del uso de colorantes azul y rojo es valioso para garantizar que todoslos animales censados en el experimento realmente participaron en el experimento. Incluso después de 24 horas de hambre, algunos animales sanos con abdómenes claras siguientes del período de alimentación pueden ser vistos. La eliminación de estos animales desde el cálculo del índice de preferencia es necesario para asegurar una medición precisa de la población. Además, después de la hambruna algunos animales invariablemente mueren antes de que puedan participar en el ensayo. Mientras que algunos animales muertos pueden desecar y pueden ser fácilmente eliminado antes del recuento, otros animales muertos pueden ser más difíciles de identificar. La inclusión de tinte en ambas opciones de alimentos, por lo tanto, asegura que los animales sanos que consumían una fuente de alimento se consideran para el experimento. Esto reduce en gran medida la variabilidad de los resultados que se pueden ver en las versiones de un solo color de este ensayo. Además, el uso de dos colores también permite a los animales que se alimentan de ambos sustratos a ser identificados por la coloración púrpura mixto en sus abdómenes. Estos animales unare importantes porque demuestran que algunos individuos pueden tener preferencias más débiles que todo el grupo. Cabe señalar que también hemos tenido éxito usando azul y amarillo, los colorantes de alimentos para este ensayo sabor de adultos donde los animales se alimentan de ambos sustratos exhiben abdómenes verdes. En este contexto, se ha encontrado que los abdómenes amarillos son algo menos obvio para anotar que el abdomen color rojo, pero sin embargo algunos investigadores preferir esta opción. Al igual que con los colores utilizados en este protocolo, un equilibrio adecuado de los colorantes de alimentos tiene que ser determinada empíricamente para garantizar los tintes no tienen un efecto sobre la preferencia de los animales.
Mientras que este ensayo sabor preferencia es bueno en la determinación de cómo una población de moscas responde a diferentes estimulantes del gusto, que no proporciona ninguna información sobre respuestas de los animales individuales o la ingesta de alimentos real. Otros ensayos que se utilizan comúnmente para el estudio de sabor en los sistemas de Drosophila ofrecen una mejor resolución de estos parámetros 19 </ Sup>. Específicamente, el ensayo de extensión proboscis es muy útil para el seguimiento de la respuesta de comportamiento real de moscas individuales para gotas de alimentos líquidos. Del mismo modo un paradigma de alimentación capilar (CAFE) ofrece un medio sólido permiten evaluar la cantidad de compuestos ingeridos en las moscas individuales, con la ventaja añadida de que el ensayo es capaz de monitorizar fácilmente durante largos períodos de tiempo. Otra limitación del ensayo de sabor basado en la población que aquí no se encuentran en la naturaleza algo subjetiva de la puntuación. Como se ilustra en la figura 1 siempre hay algún grado de variación en la cantidad de comida consumida y / o excretado por cada animal. Por lo tanto la intensidad del color abdominal varía. Es una buena práctica para los investigadores para anotar los animales mientras ciegos a las condiciones de la placa. Para lograr esto, se recomienda evitar la escritura de identidades saborizante en las placas pero en lugar etiquetar las cajas se colocan las placas en forma que las placas pueden ser contadas en un ma como imparcialnner como sea posible. También es prudente para confirmar los resultados mediante la rotación del saborizante de interés para colores alternos en experimentos separados. Este análisis adicional debería asegurar la precisión robusta de los resultados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
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