Introduction
Животные используют chemosensation отличить выгодные условия помимо невыгодных условий. Такое восприятие может иметь решающее значение для таких вещей , как определение наилучшего источника пищи, избегая токсичных веществ или определения наилучшего брачного партнера 1. Chemosensation часто делится на две сенсорные компоненты: обоняния и вкусовых ощущений. Главной отличительной особенностью этих чувств является то, что обоняние (запах) используется для образца окружающей газовой среды, в то время как химическая проба на вкус (вкус) требует физического контакта с нелетучим субстратом. Обе сенсорные модальности стимулируют неврологические реакции , которые обрабатываются и декодируются в мозге , чтобы произвести соответствующий притягательные или отталкивающие поведение 2. Эти чувства имеют решающее значение для выживания животных.
Плодовой мушки дрозофилы представляет собой модель организм , который продолжает расти в популярности для использования в понимать ,ING, как насекомые воспринимают запах и вкус. Плодовые мушки предлагают огромные преимущества по сравнению с другими системами модели благодаря богатству генетических инструментов, доступных для рассечения молекулярных, клеточных и поведенческих путей. Работа в течение последних 15 лет было особенно важную роль при характеристике специфических клеточных идентичности, нейронные рецепторы, и механизмы, участвующие в обоих запаха и вкуса сигнализации. Теперь сила дрозофилы генетики используется для дальнейшего выяснения , каким образом эти процессы кодируются на один нейрон и одного контура уровня 3-6. Поэтому анализы, которые обеспечивают забиваются легко считывания изменений в сенсорных путей являются жизненно важными для продолжения наступления этих полей.
В то время как много известно о том, как обонятельные сигналы кодируются и обрабатываются в головном мозге, гораздо меньше понимают о подобных механизмах в вкусового пути. Здесь мы опишем протокол, который может быть использован для установления вкуса preferenв.п. в дрозофилы. дрозофилы, как и у млекопитающих, как правило , предпочитают сладкие соединения дегустации , в отличие от горьких соединений дегустации. Любое сочетание этих источников пищи могут быть использованы в этой экспериментальной конструкции, чтобы определить, как известные генетические изменения влияют на выбор вкуса. Кроме того, фармакологические стратегии вмешательства так же можно оценить на предмет их влияния на вкусовые предпочтения животных. Легкость и гибкость этого анализа делает его полезным для парадигмы понимания природы вкусового восприятия у дрозофилы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Голодание
- Приготовьте летать на голодном ампул насыщением ватный тампон с 18,2 МОм воды в нижней части стандартного флакона летать. В качестве альтернативы, так же насыщают небольшую полоску фильтровальной бумаги с 18,2 МОм воды и место под углом в пузырьке.
- Сбор мух в наборы ~ 100 животных на CO 2 площадки , а затем добавить мух в подготовленную пробирку.
Примечание: Наилучшие результаты получают с животными, которые менее чем за 5 дней. Тем не менее, точный возраст животных можно контролировать в качестве экспериментальной переменной для определения изменений вкусовых предпочтений в течение долгого времени. - Используйте ватный шарик или пены пробку, чтобы обеспечить закрытым флаконах. Поместите ампул на их стороне в экологически контролируемом инкубаторе. Поддерживают температуру при 25 ° С, а влажность выше 70%. Оставьте флаконы нетронутым в течение 24 часов.
2. Вкус Предпочтение Анализ
- Подготовьте все Tastants для анализа на тот же деньs тестирование.
Примечание: Точные Tastants, которые будут использоваться будет варьироваться в зависимости от экспериментальных нами вопроса. Ниже приведены примеры Tastants, используемые в данном протоколе. Смотрите раздел 4 для оптимизации.- Подготовка управления tastant (1 мМ сахарозы) путем объединения 10 мкл 100 мМ раствора сахарозы, 13 мкл красного пищевого красителя, и 977 мкл 18,2 МОм воды.
- Подготовьте экспериментальную tastant (5 мМ сахарозы) путем объединения 50 мкл 100 мМ раствора сахарозы, 10 мкл голубого пищевого красителя, и 940 мкл 18,2 МОм воды.
- Сделать опробования камеры с использованием стандартного 100 мм х 15 мм пластиковые чашки блюдо, приготовленное следующим образом:
- Поместите три 10 мкл капли управления tastant ближайшего края пластины в 12 часов и еще 3 капли в 6 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
- Поместите три 10 мкл капли экспериментальной tastant ближайшего края пластины в 3 часа ночи идругие 3 капли в 9 часов. Убедитесь, что расстояние между каплями аналогично.
- Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 столько повторов, как хотелось бы.
- Пустой 1 флакон ~ 100 голодающих мух на СО 2 колодки просто достаточно долго , чтобы обезболить всех животных (около 10 сек). Кисть животных в середину подготовленной аналитической камеры и накрыть крышкой блюдо.
Примечание: более длительные периоды воздействия CO 2 , следует избегать , чтобы улучшить время восстановления и ограничения вмешательства в пищевом поведении. Воздействие льда (~ 5 мин) может быть использован для обезболивающее , чтобы избежать CO 2 , поведенческие эффекты , которые могут возникнуть в результате даже ограниченным воздействием. - Поместите камеру для анализа в непрозрачном картонной коробке. Обязательно маркировать вне коробки с условием и генотип испытывается.
- Поместите всю установку (пробирного камеры содержится в картонной коробке с шага 2.4) в 25 ° C инкубаторе с по крайней мере, 70% влажности в течение 2 часов. Повторите шаги 2,3 через 2,5 для всех повторах.
- После 2-х часов, поместите пробирного камеры, все еще содержащиеся в картонные коробки, непосредственно в -20 ° C морозильнике до готовности к количественному.
3. Вкус Предпочтение Анализ Количественное
- Разрешить один тест камеры нагреться до комнатной температуры (примерно 5 мин).
- Под микроскопом рассечение, используя щетку или пару щипцов, группы животных на основе цвета их живота: красный, синий, фиолетовый или ясно (рисунок 1).
- Записывают число животных в каждой группе. Рассмотрим четкие животных не участвовали в анализе, и поэтому не включать их в каких-либо расчетов.
- Вычислить индекс предпочтений согласно одному из следующих уравнений:
- Если экспериментальная tastant интерес добавляется к красным красителем, а затем использовать (N красный + 0,5н фиолетовый) / (N + N красный синий + N Purplд).
- Если экспериментальная tastant добавляется к синим красителем, а затем настроить уравнение к (N синий + 0,5н фиолетовый) / (N синий + красный + N N фиолетовый).
- Повторите расчеты для всех условий эксперимента и повторах.
4. Оптимизация вкуса Предпочтение Пробирной
- Эмпирически определить концентрацию показателей пищевой краситель для использования таким образом пищевой краситель не влияет на результат анализа вкуса, следующим образом:
- Подготовьте 4 Tastants с использованием того же основного соединения (например , 5 мМ сахарозы) , как показано на шаге 2.1, но опустить пищевой краситель.
- Добавить 1,3% красный пищевой краситель к одному из Tastants. Выполните оставшиеся 3 Tastants с синим пищевым красителем различных концентраций в каждой пробирке (например , 0,6%, 1% и 1,3%).
- Полный протокол шаги 2.2 через 3.4 для каждой пары tastant: 1,3% против 0,6 красный% синий; 1,3% красного против 1% синего и1,3% по сравнению с красным 1,3% синим цветом.
- Повторите шаг 4.1.1-4.1.3 с различным процентным содержанием синего пищевого красителя , пока средние значения индекса предпочтения значение 0 (Рисунок 2).
Примечание: В качестве отправной точки, 1,3% краситель красный пищевой в сочетании с 1% синей окраски пищи, как правило, дает хорошие результаты. Если нет удовлетворительной концентрации синего пищевого красителя не могут быть сопоставлены с 1,3% красителя, а затем шаг 4.1.1 через 4.1.3 можно повторить с различными концентрациями красной окраски и постоянной концентрации синего пищевого красителя. - Анализировать все условия, чтобы быть проверены с помощью тех же самых оптимизированных концентрациях пищевой краситель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Некоторые типичные результаты вкусовых предпочтений анализов приведены ниже. В большинстве экспериментов некоторые различия в интенсивности окраски брюшной будет видно (рисунок 1). Любая окраска в брюшной полости ли интенсивным или слабым считается положительным проглатывания. Поэтому целесообразно для исследователей забивать животных в то время закрывать глаза на условия эксперимента так, чтобы ограничить любые потенциальные уклоны.
Важно также, чтобы выбрать концентрации пищевых красителей, которые не влияют на результаты анализа предпочтений. Примером последствий использования различных концентраций пищевого красителя показано на рисунке 2 В этом примере количество красного пищевого красителя поддерживалась на уровне 1,3% , в то время как количество голубого пищевого красителя варьировали:. 0,6%, 1% и 1,3 %. Каждый краситель добавляют к 5 мМ сахарозы, чтобы обеспечить высокий процент участников в анализе. Вкус PrefereАнализ сть Затем проводили на 3-х повторностях из каждого состояния и индекса предпочтений, рассчитанного в соответствии с уравнением в пункте 3.4.1. Один процент синего красителя в сочетании с 1,3% красного красителя было установлено, что оптимальным для этих экспериментов, о чем свидетельствует неспособность животных выбирать сахарозы, присутствующей в одном цвете над другим (индекс предпочтительным значением близким к 0,5). Когда только 0,6% синего красителя в паре с 1,3% красного красителя, животные явно выбрал (значение индекса предпочтение близок к 1) красный краситель образцы сахарозы, даже если концентрация сахарозы была одинакова для обоих цветов. Использование равных количеств пищевых красителей привело к незначительному, хотя статистически значимым, предпочтение для образцов, содержащих сахарозы синий краситель (индекс предпочтение значение <0,5). Были найдены оптимальные значения, определенные здесь, чтобы дать стабильные результаты в диапазоне 10-кратным концентрации сахарозы в пределах от 1 до 10 мм. Тем не менее, количество выявленных здесь следует рассматривать начальные значения и фактические КонцентрацДополнения должны быть рассчитаны эмпирически для всех условий, которые будут проверены перед проведением экспериментальных образцов.
Выбор, от которого уравнение использовать для вычисления индекса предпочтений основан на установке эксперимента и привлекательности в сравнении с отведения их целей эксперимента. Как показано в примере , показанном на рисунке 3, мух продемонстрировали предпочтение высоких концентраций сахарозы по сравнению с более низкими концентрациями и это предпочтение может быть изменено с добавлением кислоты. Уравнение (N синий + 0,5н фиолетовый) / (N + N синий красный + N , фиолетовый) от 3.4.2 использовали для расчета индекса предпочтения для 3 -х повторах каждого условия эксперимента , так как интерес соединение помещают в синий краситель , Индекс предпочтения около 1 указывает на то, что, когда предложили выбор между 1 мМ сахарозы (в красном) и 5 мМ сахарозы (в синем), мухи почти всегда выбирали более высокую Конц вания. С другой стороны, вторая группировка мух дали те же параметры, за исключением того, что 10% -ной уксусной кислоты в сочетании с мМ вариант 5 сахарозы (голубого цвета). Мухи почти полностью избежать этой ситуации , как видно с индексом предпочтения около 0, в соответствии с известными ответами на высокой концентрации кислоты 7.
Рисунок 1: Вкус предпочтения Результаты анализа. Некоторые примеры в изменении окраски брюшную показаны. Темно - красный заглатывании (A). Светло - красный заглатывании (B). Темно - синий заглатывании (C). Светло - синий заглатывании (D). Фиолетовый животы считаются , когда вся окраска появляется фиолетовый (E), или когда различные области живота показывают порции красного (стрелки) и отдельные части синего (стрелка) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Управление для пищевой окраски эффектов. Добавление пищевого красителя к Tastants не должны иметь никакого влияния на вкус предпочтения животных. Изменяя концентрацию синего красителя при сохранении постоянной концентрации красного красителя показали оптимальное сочетание красного 1,3% до 1,0% синего. Об этом свидетельствует значение индекса предпочтение около 0,5. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. * р <0,05, *** р <т-тест 0,001 из Двустороннее студента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Анализ вкус предпочтения используется для привлечения и неприятия дрозофилы естественным образом привлекают высокие концентрации сахарозы , как видно по значению индекса предпочтения близких к 1 , когда предоставляется возможность выбора между 5 мМ сахарозы (в синем) и 1 мМ сахарозы (в красном цвете) , Добавление отталкивающее соединения, такие как кислоты до 5 мМ сахарозы вариант переворачивает этот выбор для высоким содержанием сахарозы в качестве индекса предпочтение падает до около 0. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение. *** р <0,0001 от Т-тест Двустороннее студента. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали простой , но эффективный протокол для определения вкусовых предпочтений у дрозофилы. Версии этого анализа обычно используются в экспериментах для определения вклада вкусовых рецепторов (ГР), чтобы воспринимать различные качества (горький, сладкий, кислый, соленый, и умами) вкусовых соединений. Геном дрозофилы содержит около 60 генов , которые кодируют 68 идентифицированные вкусовых рецепторов путем альтернативного сплайсинга 8,9. Тем не менее, другие белки , такие как ионотропных глутаматных рецепторов и TRP каналов также были продемонстрированы играть определенную роль во вкусе 10-13. Таким образом, существует обширное разнообразие в дискриминационного силе вкуса у насекомых. Кроме того, в отличие от рецепторов обоняния, вкуса рецепторы экспрессируются в клетках, расположенных по всему ходу. Сенсиллы содержащие комбинации нейронов , экспрессирующих различные рецепторы вкуса могут быть найдены на labellum, ноги, крылья и яйцеклад 14. Как таковой,Drosophila полагаются на вкус дискриминации для хозяина поведения за приобретение питания , включая ухаживание и яйцекладки.
Этот метод анализа вкуса может быть применен для решения многих различных экспериментальных вопросов. Например, так как вкус, ухаживания и откладки яиц поведения являются важными факторами для многих животных, этот протокол может быть масштабируемой для других важных насекомых, таких как клещи и комары. Такое улучшение может оказаться полезным для борьбы с переносчиками болезней и развития пестицидов. Кроме того, этот анализ может быть расширен для использования в передних генетических экранов , которые сделали Drosophila такой мощный инструмент расследований в течение многих десятилетий. Полный молекулярный понимание вкусовых путей не известно. Выявление нарушения в новых генов, которые опосредуют вкусовые предпочтения в данном анализе может помочь в заполнении важных пробелов в знаниях вкус цепи. К тому же, как важность доклинических моделей стро заболеванияжает расти, фармакологические экраны, влияющие на вкусовыми сигнальных механизмов, легко может быть выполнена путем добавления терапевтических соединений к Tastants в данном протоколе. Таким образом, надежный анализ, описанный здесь является потенциально ценным инструментом для многих различных направлений исследований.
Есть несколько преимуществ использования этого протокола для анализа вкусовых предпочтений. Ранние версии этой парадигмы питания , используемой только один цвет для обнаружения глотавших Tastants и популярных текущих приложений использовать микротитровальных пластин для доставки tastant 15-18. Блюдо анализа камера Петри используется в данном протоколе является несколько общий продукт найден в лабораториях в настоящее время не готовы для выполнения вкусовых анализов. Вероятность того, чтобы иметь камеру для анализа уже имеются в наличии, поэтому, помогает облегчить тестирование новых гипотез без времени или вложения денег в новое оборудование. Кроме того, комбинация с использованием синих и красных красителей является ценным для обеспечения того, чтобы всеживотные подсчитанные в эксперименте фактически участвовали в эксперименте. Даже после 24 часов голодания, некоторые здоровые животные с явными брюшке следующих за период кормления можно увидеть. Устранение этих животных из расчета индекса предпочтения необходимо обеспечить точное измерение населения. Кроме того, после голодания у некоторых животных неизменно умирают, прежде чем они могут участвовать в анализе. В то время как некоторые мертвые животные могут высыхать и легко могут быть удалены перед подсчетом, другие мертвые животные могут быть более трудно определить. Включение красителя в обоих выбор продуктов питания таким образом, гарантирует, что только здоровые животные, которые потребляли источник пищи считаются для эксперимента. Это значительно снижает изменчивость результатов, которые можно увидеть в единичных цветовых вариантах данного анализа. Кроме того, использование двух цветов также позволяет животным, которые питаются обоих субстратов, чтобы идентифицировать по смешанному фиолетовой окраски в брюшке. Эти животные аRe важно, потому что они показывают, что некоторые люди могут иметь более слабые, чем предпочтения всей группы. Следует отметить, что мы также имели успех, используя синие и желтые пищевые красители для этого взрослого анализа вкуса, где кормления животных на обеих подложках проявляют зеленые животы. В связи с этим, мы обнаружили, что желтые животы несколько менее очевидно, чем забить красный брюшке, но тем не менее, некоторые исследователи могут предпочесть этот вариант. Как и с цветами, используемыми в данном протоколе, надлежащий баланс пищевых красителей должен быть определены эмпирически, чтобы обеспечить красители не оказывают влияние на предпочтения животных.
В то время как этот вкус предпочтения анализ хорош при определении того, как популяция мух реагирует на различные Tastants, он не дает никакой информации о единичных ответов на животных или фактического приема пищи. Другие анализы, которые обычно используются для изучения вкуса в системах Drosophila предлагают более высокое разрешение этих параметров 19 </ SUP>. В частности, анализ расширения хоботок очень полезно для контроля фактического поведенческой реакции одиночных мух до капли жидкой пищи. Точно так же парадигма капиллярная кормления (CAFE) предлагает надежные средства оценки количества проглоченных соединений в одиночных мух, с дополнительным преимуществом, что анализ может легко контролироваться в течение длительных периодов времени. Другим ограничением анализа вкуса на основе населения здесь же лежат в некоторой степени субъективный характер скоринга. Как показано на рисунке 1 , всегда есть некоторая степень изменения количества потребляемой пищи и / или из организма каждого животного. Поэтому интенсивность абдоминальной цвет меняется. Это хорошая практика для исследователей, чтобы забить животных в то время как слепые к условиям пластины. Для достижения этой цели, рекомендуется, чтобы избежать написания tastant идентичностей на пластинах, но вместо того, чтобы маркировать коробки пластины размещены в так, что пластины могут быть подсчитаны в максимально объективной маnner, насколько это возможно. Кроме того, разумно, чтобы подтвердить результаты, вращая tastant интереса к альтернативным цветов в отдельных экспериментах. Этот дополнительный анализ должен обеспечить надежную точность результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
- Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
- Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
- Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
- Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
- Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042 (2013).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
