Introduction
動物は不利な条件とは別に有利な条件を区別するためにchemosensationを使用しています。この認識は、最良の食料源を決定する有毒物質を避けるか、最高の交配相手1を決定するようなもののために重要であることができます。嗅覚と味覚の五感：Chemosensationは、多くの場合、2つの感覚のコンポーネントに分割されています。これらの感覚の主な際立った特徴は、嗅覚（臭い）が味覚（味）は、不揮発性基板との物理的接触を必要としながら、周囲のガス状の化学環境をサンプリングするために使用されていることです。どちらの感覚モダリティは、適切な魅力や反発動作2を生成するために、脳内で処理し、デコードされた神経学的応答を刺激します。これらの感覚は、動物の生存のためにきわめて重要です。
キイロショウジョウバエのショウジョウバエは理解での使用のために人気が成長を続けているモデル生物であります昆虫は香りと味を感じるかる。ショウジョウバエは、分子の細胞、および行動経路の解剖のために利用可能な遺伝子ツールの富のために他のモデルシステムを超える多大な利点を提供します。過去15年間の仕事は、特定の細胞のアイデンティティ、神経細胞の受容体を特徴付けるし、香りと味の両方に関与するシグナル伝達機構に特に尽力してきました。さて、 ショウジョウバエ遺伝学の力はさらにこれらのプロセスは、単一のニューロンと単一回路レベル3-6で符号化されているかを解明するために使用されています。したがって、感覚経路に変更の容易得点読み出しを提供するアッセイは、これらのフィールドの継続的な前進に不可欠です。
多大を符号化し、脳内でどのように処理されるか嗅覚信号については知られているが、はるかに少ないが味覚経路における同様のメカニズムについて理解されています。ここで味preferenを確認するために使用できるプロトコルを記述します苦味化合物とは対照的に、 ショウジョウバエ 。 ショウジョウバエのCEは、哺乳類のように、一般的に甘味化合物を好みます。これらの食物源の任意の組み合わせは、遺伝子改変は、味の選択にどのように影響するか、既知決定するために、この実験の設計に利用することができます。さらに、薬理学的介入戦略は、同様に動物の味覚嗜好に対するそれらの効果について評価することができます。このアッセイの使いやすさと柔軟性はショウジョウバエの味覚知覚の性質を理解するために有用なパラダイムになります。
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Protocol
1.飢餓
- 標準フライバイアルの底に18.2MΩの水でコットンボールを飽和させることにより、フライ飢餓バイアルを準備します。また、同様にバイアル内の角度で18.2MΩ水と場所とのろ紙の小片を飽和。
- CO 2パッドの上に〜100の動物のセットにハエを収集してから、準備されたバイアルにハエを追加します。
注：最良の結果が5日未満齢である動物を用いて得られます。しかし、動物の正確な年齢は、経時的な味の好みの変化を決定するための実験変数として制御することができます。 - バイアルを閉じて固定するためにコットンボールやフォームストッパーを使用してください。環境制御インキュベーター中で彼らの側にバイアルを置きます。 25℃の温度、および70％以上の湿度を維持。 24時間そのままのバイアルを残します。
2.味の好みアッセイ
- 同じ日Aのアッセイのためのすべての味物質を準備sのテスト。
注意：使用する正確な味物質が求められている実験的な質問によって異なります。以下は、このプロトコルで使用される例の味物質です。最適化のためのセクション4を参照してください。- 100mMのスクロース溶液10μl、食紅の13μlを、および18.2MΩの水977μLを組み合わせることにより、制御味物質（1 mMのスクロース）を準備します。
- 100mMのスクロース溶液50μl、青色食品着色料を10μl、および18.2MΩの水940μLを組み合わせることにより、実験的味覚（5 mMのスクロース）を準備します。
- 以下のようにして調製し、標準的な100ミリメートル×15ミリメートルのプラスチックシャーレを用いたアッセイチャンバーを行います。
- 12時位置にプレートの端に最も近い制御味物質の三10μlの滴と6時位置に別の3滴を置きます。液滴間の間隔が類似していることを確認してください。
- 3時とでプレートの端に最も近い実験味物質の三10μlの滴を置きます他の3は、9時位置にドロップします。液滴間の間隔が類似していることを確認してください。
- 所望のように繰り返しては、多くの複製のために2.2.1と2.2.2を繰り返します。
- CO 2パッドの上に〜100飢えたハエの空のバイアル1本だけの十分な長さのすべての動物（約10秒）を麻酔しました。準備された検定室の中央に動物をブラシと皿蓋でカバーしています。
注：CO 2露出が回復時間を改善し、摂食行動との干渉を制限するために避けるべきであるの長い期間を。氷（約5分）への暴露も、限られた暴露から生じ得るCO 2行動の影響を回避するために麻酔のために使用することができます。 - 不透明な段ボール箱に分析室を置きます。テストされている状態と遺伝子型と箱の外側にラベルを付けてください。
- 2時間の少なくとも70％の湿度で25℃のインキュベーターに全体のセットアップ（ステップ2.4から段ボール箱内に含まれるアッセイ室）を配置します。 繰り返しは、すべての複製のために2.5を介して2.3を繰り返します。
- 2時間後、定量化のための準備が整うまで直接-20℃の冷凍庫の中に、まだ段ボール箱内に含まれるアッセイチャンバーを配置。
3.味の好みアッセイ定量化
- 単一のアッセイチャンバーは室温（約5分）まで昇温することを可能にします。
- 赤、青、紫やクリア（ 図1）：解剖顕微鏡下では、ブラシや鉗子のペアを使用して、グループの動物、その腹部の色に基づいて。
- 各グループの動物数を記録します。アッセイに参加していないために、したがって、任意の計算に含めていない明確な動物を考えてみましょう。
- 以下の式のいずれかに記載の優先度を計算します。
- 関心の実験味覚が赤色染料に追加された場合、（ 紫 0.5N + 赤 N）/（N 赤 + N 青 + N purplを使用E）。
- 実験味物質が、青色色素に追加された場合、（ 紫 0.5N + 青 N）/（ 紫 N 青 + N 赤 + N）に式を調整します。
- すべての実験条件および複製のための計算を繰り返します。
味の好みアッセイの4最適化
- 経験的に次のように食品着色料は、味アッセイの結果には影響しませんので、使用する食品着色料指標の濃度を決定します。
- ステップ2.1で示したように同じ塩基化合物（ 例えば、5 mMのスクロース）を用いて、4味物質を準備したが、食品着色料を省略します。
- 味物質の1に1.3％食紅を追加します。各チューブ内の様々な濃度の青色食品着色料（ 例えば 、0.6％、1％、および1.3％）で、残りの3味物質を作ります。
- 完全なプロトコルは、それぞれの味物質ペアについて3.4を介して2.2ステップ：1.3％赤対0.6％青; 1.3％赤対1パーセントの青と1.3％の青対赤の1.3％。
- 選好指数平均までの青色食品着色料の異なるパーセンテージ0（ 図2）の値を持つ手順を繰り返し4.1.1-4.1.3。
注：出発点として、1％の青色食品着色料と相まって1.3％食紅は、典型的には、良好な結果をもたらします。青い食品着色料の満足のいく濃度が1.3％の染料に一致することができない場合は、4.1.3を経てステップ4.1.1は、赤色の着色と青の食品着色料の一定濃度の様々な濃度で繰り返すことができます。 - 同じ最適化された食品着色料の濃度で試験されるべきすべての条件を分析します。
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Representative Results
味覚嗜好アッセイからのいくつかの典型的な結果を以下に示します。ほとんどの実験では、腹部発色強度のいくらかの変動は、（ 図1）に見られるであろう。強烈なまたは弱いか腹部内の任意の着色は、正の摂取であると考えられます。任意の潜在的なバイアスを制限するように、研究者は実験条件に盲目ながら動物を獲得することはことをお勧めです。
好みのアッセイの結果には影響しません食用色素の濃度を選択することも重要です。様々な食品着色濃度を用いた結果の例を図2に示されている青色食用色素の量を変化させながら、この例では、赤色食用色素の量を1.3％に維持した。0.6％、1％、および1.3 ％。各色素は、アッセイの参加者の高い割合を確保するために、5 mMのスクロースを添加しました。味prefereNCEアッセイを各条件と3.4.1において式に従って計算優先度から3反復で行いました。 1.3％の赤色染料と結合された1％の青色色素は、他の（0.5に近い選好指標値）上の1つの色に存在するスクロースを選択する動物の失敗によって示されるように、これらの実験のために最適であることが見出されました。唯一の0.6％の青色染料を1.3％赤色染料と対にされたときに、動物は、明らかに、スクロースの濃度は、両方の色で同一であっても、赤色染料スクロースサンプル（1に近い嗜好指標値）を選択しました。食用色素の等量を使用すると、青色染料を含有するスクロースサンプルについてわずかな、しかし統計的に有意な、優先（選好指標値<0.5）が得られました。ここで同定された最適値を、1mMから10mMの範囲のショ糖濃度の10倍の範囲にわたって一貫性のある結果を与えることが見出されました。それにもかかわらず、ここで同定された数量が値と実際のconcentratiを開始すると見なされるべきですすべての条件は、実験サンプルを実行する前に、試験するためのアドオンは、経験的に計算されるべきです。
選好指数を計算に使用する方程式の選択は、実験のセットアップと実験の嫌悪目標に対する魅力に基づいています。 図3の例に示すように、ハエは、低濃度対スクロースの高濃度のための好みを示し、このプリファレンスは、酸の添加により逆転させることができます。目的の化合物は、青色染料に入れたので、3.4.2から式（N + 青 0.5N パープル ）/（N + 青 Nの赤 + N 紫）を各実験条件の3複製の優先度を計算するために使用しました。 1に近い選好指数は（青）1 mMのスクロース（赤）と5 mMのショ糖の間の選択を提供したときに、ハエはほぼ常に高いconcentrを選んだことを示していますエーション。逆に、ハエの第二のグループは、（青）5 mMのショ糖オプションと組み合わせた、10％酢酸を除いて同じオプションを与えられました。 0近く選好指数で見られるようにほぼ完全に酸7の高濃度既知の応答と一致して、この状況を回避飛びます。
図1： 味覚嗜好アッセイ結果 。腹部の着色の変化のいくつかの例が示されています。暗赤色は、（A）摂取しました。光赤（B）を摂取しました。ダークブルーは、（C）を摂取しました。ライトブルー（D）摂取しました。全体の着色が（E）紫が表示されたとき、または別個の領域青（矢印）（F）の赤（矢じり）と別々の部分の腹部ショー部分のときに紫色の腹部が考慮されます。//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： 食品の着色効果を制御します 。味物質の食品着色料の添加は動物の味の好みに影響を及ぼさないようにしてください。赤色染料の濃度を一定に維持しながら、青色染料の濃度を変化させると、1.0％青色赤1.3％の最適な組み合わせを明らかにしました。これは、0.5付近の優先度値で示されます。値は平均±標準偏差です。 * P <0.05、*** P <0.001から両側スチューデントのt検定。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3：（青）5 mMのスクロースと（赤）1 mMのスクロースの間の選択が与えられたときに1に近い選好インデックス値で見られるような魅力と嫌悪感のために使用される味の好みアッセイ ショウジョウバエは自然に高スクロース濃度に引き付けられます。好みのインデックスは0です。値は平均±標準偏差であるの近くに下がるなど5 mMのショ糖オプションの酸として嫌悪化合物を添加することにより、高ショ糖のためのこの選択を反転させます。 *** P <0.0001、両側スチューデントのt検定から。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、 ショウジョウバエの味の好みを決定するための簡単で効果的なプロトコルを記述しています。このアッセイのバージョンは、日常の味覚化合物の異なる品質（苦味、甘味、酸味、塩味、うま味）を知覚する味覚受容体（GRS）の拠出を決定するための実験で使用されています。 ショウジョウバエのゲノムは、選択的スプライシング8,9により68識別された味覚受容体をコード化する約60の遺伝子が含まれています。しかしながら、このようなイオンチャネル型グルタミン酸受容体とTRPチャネルのような他のタンパク質もまた、味10-13において役割を果たすことが実証されています。したがって、昆虫における味の識別力に広範な多様性があります。また、匂いの受容体とは異なり、味覚受容体は、全てのハエの上に位置する細胞で発現されます。異なる味覚受容体を発現するニューロンの組み合わせを含む感覚器は唇弁、脚、翼と14産卵管で見つけることができます。など、ショウジョウバエは求愛と産卵を含む栄養買収を超えて行動のホストの味の差別に依存しています。
この味の分析技術は、多くの異なる実験の質問に対処するために適用されてもよいです。味、求愛、および産卵行動が多くの動物のための重要な考慮事項であるため、例えば、このプロトコルは、ダニや蚊などの他の重要な昆虫に対してスケーラブルであってもよいです。このような進歩は、病気ベクトル管理や農薬の開発に有用であることが証明できました。また、このアッセイは、 ショウジョウバエ何十年もの間このような強力な調査ツール行ったフォワード遺伝子スクリーニングに使用するためにスケールアップすることができました。味覚伝達経路の完全な分子的理解は知られていません。このアッセイにおける味の好みを仲介する新規遺伝子の混乱を特定することは味回路の知識における重要なギャップを埋めるのに役立つ可能性があります。また、病気の詐欺の前臨床モデルの重要性増加するtinues、味覚シグナル伝達機構に影響を与える薬理学的スクリーニングが容易にこのプロトコルで味物質に治療化合物を添加することにより行うことができます。したがって、ここで説明する堅牢なアッセイは、研究の多くの異なるラインのために潜在的に貴重なツールです。
味の好みの分析のためにこのプロトコルを使用することにはいくつかの利点があります。摂取味物質と人気電流アプリケーションの検出のための単色のみを利用し、この送りパラダイムの初期のバージョンは、味物質の配信15-18のためのマイクロタイタープレートを使用しています。このプロトコルで使用されるペトリ皿アッセイ室は、現在の味アッセイを実行するために用意されていない研究室で見出さやや一般的製品です。すでに手元に検定チャンバを有する可能性は、したがって、時間または新しい機器マネー投資せずに新しい仮説のテストを容易にするのに役立ちます。また、青と赤の染料を使用しての組み合わせは、そのすべてを保証するために価値があります実験でカウント動物が実際に実験に参加しました。でも飢餓の24時間後、飼育期間以下の明確な腹部といくつかの健康な動物を見ることができます。優先度計算から、これらの動物を排除する集団の正確な測定を確保する必要があります。彼らは、アッセイに参加することができます前に、また、飢餓の後にいくつかの動物は必ず死にます。いくつかの死んだ動物が乾燥することができ、簡単にカウントする前に除去することができるが、他の動物の死骸を特定するのはより難しいかもしれません。両方の食品の選択肢中の染料を含めることは、したがって、食料源を消費するだけで健康な動物は、実験のために考慮されることが保証されます。これは非常に、このアッセイの単一色のバージョンで見ることができ、結果のばらつきを低減します。また、2色の使用はまた、両方の基板上に餌動物は自分の腹部内の混合紫色によって識別することができます。これらの動物A彼らはいくつかの個人がグループ全体よりも弱い好みを有することができることを実証しているので、重要な再。我々はまた、両基板を餌動物は緑の腹部を呈するこの大人の味のアッセイのために青と黄色の食用色素を使用して成功を収めていることに留意すべきです。この文脈において、我々は黄色の腹部がやや赤い腹よりも得点が少ない明白であることを見出したが、それにもかかわらず、一部の研究者は、このオプションを好むかもしれません。このプロトコルで使用される色と同じように、食用色素の適切なバランスは、動物の好みに影響を持っていない染料を確保するために、経験的に決定する必要があります。
この味の好みアッセイはハエの人口は異なる味物質に応答する方法を決定するのが得意ですが、それは単一の動物の応答または実際の食物摂取量に関する情報を提供していません。一般的にショウジョウバエのシステムで味を研究するために使用されている他のアッセイは、これらのパラメータ19の優れた分解能を提供しています</ SUP>。具体的には、口吻伸長アッセイは、液体食品の滴への単一のハエの実際の行動反応をモニタリングするために非常に有用です。同様に、毛細管送りパラダイム（CAFE）はアッセイが容易に長期間にわたって監視することが可能であるという付加的な利点と、単一のハエに摂取される化合物の量を評価する堅牢な手段を提供しています。人口ベースの味アッセイの別の制限は、ここで得点の多少主観的な性質にあるん。 図1に示すように、消費および/ または各動物によって排泄常に食物の量の変化のある程度があります。したがって、腹部の色の強度が変化します。プレートの条件に盲目ながら研究者が動物を獲得することは良い習慣です。これを達成するためには、プレート上に味物質のアイデンティティを書き込まないようではなく、プレートはとして公平ミリアンペアでカウントすることができるようにプレートが中に配置されているボックスにラベルを付けることをお勧めしますできるだけnner。別々の実験で代替色に関心の味覚を回転させることにより、結果を確認することも賢明です。この追加分析は、結果の頑健な精度を確保する必要があります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
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