Introduction
动物用chemosensation从不利条件，除了区分了有利条件。这种看法可能是这样的事情作为确定最好的食物来源，避免有毒物质或确定最佳的交配伙伴1关键。 Chemosensation通常分为两种感官部分：嗅觉和味觉的感官。这些感官的主要鉴别特征是，嗅觉（气味）被使用，而味觉（味道）需要与非易失性基板的身体接触来样周围的气态化学环境。这两种形式的感官刺激而被处理，并在大脑中产生相应的吸引力或排斥行为2解码神经系统的反应。这些感官因此对动物生存至关重要。
果蝇果蝇是不断增长的普及在了解使用模式生物ING昆虫如何感知气味和滋味。果蝇由于可用于分子，细胞，和行为途径的解剖遗传工具的丰富提供优于其他模型系统的巨大的优势。在过去15年的工作一直在表征特定细胞的身份，神经元受体和信号参与了嗅觉和味觉机制特别的工具。现在， 果蝇遗传学的功率被用来进一步阐明这些过程是如何在单个神经元和单电路级3-6编码。因此，它们提供了测定轻松打进改建感觉通路的读数是对这些字段的持续进步至关重要。
而大量的已知如何嗅觉信号进行编码并在大脑中处理的，要少得多理解有关在味觉通路类似的机制。我们在这里描述了可用于确定味道preferen一个协议行政长官在果蝇 ， 果蝇，像哺乳动物，一般喜欢甜味的化合物，而不是苦味化合物。这些食物源的任何组合可以在本实验设计来确定已知的遗传改变如何影响口味的选择可以利用。此外，药理学干预策略可以类似地评估其对动物的口味偏好效应。该测定的便利性和灵活性使得它有用的范例为理解在果蝇味觉感知的性质。
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Protocol
1.饥饿
- 制备通过在标飞小瓶的底部饱和18.2兆欧水棉球飞饥饿小瓶中。另外，同样在药瓶内的角度饱和滤纸的18.2MΩ水的地方一小片。
- 收集到的苍蝇套〜100只的二氧化碳垫，然后苍蝇添加到小瓶的准备。
注意：最好的结果是用动物是少于5天获得。然而，动物的确切年龄可被控制作为实验变量，以确定随时间的口味偏好的变化。 - 使用棉球或泡沫塞子以固定小瓶封闭。放在自己身边瓶在环境控制孵化器。保持在25℃的温度，并在70％以上的湿度。离开瓶触及24小时。
2.口味偏好分析
- 制备用于测定所有促味剂在同一天一小号测试。
注意：要使用将根据实验的问题各不相同的确切促味剂被要求。以下是在本协议所使用的例子促味剂。请参阅优化第4节。- 结合10微升的100毫米蔗糖溶液，13微升的红色食用色素和977微升18.2MΩ水准备控制呈味物质（1毫米蔗糖）。
- 结合50微升100毫米蔗糖溶液，10微升蓝色食用色素，和940微升18.2MΩ水准备实验呈味物质（5毫米蔗糖）。
- 使用以下述方式制备的标准的100毫米×15毫米的塑料陪替氏培养皿使测定室：
- 放置在12点和最靠近所述板的边缘控制促味剂的3个10微升滴在6点钟另一个3滴。确保液滴之间的间隔是相似的。
- 放置最靠近所述板的边缘实验促味剂的3个10微升滴在3点和一个其他3滴在9点钟。确保液滴之间的间隔是相似的。
- 根据需要重复尽可能多的重复步骤2.2.1和2.2.2。
- 空1瓶〜100饿死的苍蝇到的 CO 2垫或许足够用来麻醉所有动物（约10秒）。刷动物进入事先准备好的测定室的中间，并与菜盖上盖子。
应避免较长的CO 2的曝光时间，以改善恢复时间和限制干扰取食行为：注意。暴露于冰（〜5分钟）可以用于麻醉，以避免可能由即使是有限的曝光产生的 CO 2的行为的效果。 - 放置测定室在一个不透明的纸板箱。请务必使用条件和基因型被检测到标签的包装盒外面。
- 将整个设置程序（从步骤2.4所含纸箱内测定室）到25℃的培养箱具有至少70％的湿度为2小时。 重复步骤2.3到2.5的所有重复。
- 2小时后，放置在测定室中，仍含有纸箱内，直接放入-20℃的冰箱，直到准备定量。
3.口味偏好量化分析
- 允许单个测定室温至室温（约5分钟）。
- 在解剖镜下，用刷子或钳子的基础上，其腹部的颜色组动物：红色，蓝色，紫色或清除（ 图1）。
- 记录动物在每个分组的数目。考虑没有参加试验明确动物，因此不包括他们在任何计算。
- 根据下列方程之一计算优先指标：
- 如果感兴趣的实验促味剂被添加到红色染料，然后用（N- 红色 + 0.5N 紫色 ）/（N 红色 + N 蓝色 + N purplE）。
- 如果实验促味剂被添加到蓝色染料，然后调整公式（N- 蓝 + 0.5N 紫色 ）/（N 蓝色 + N 红色 + N 紫色 ）。
- 重复计算所有的实验条件和重复。
4.口味偏好分析的优化
- 经验确定的食品着色指标浓度被使用，因此食品着色不影响味道试验的结果，如下所示：
- 使用如步骤2.1所示相同的基化合物（ 例如 5毫米蔗糖）准备4促味，但省略了食用色素。
- 加1.3％的红色食品着色的促味剂的一种。使剩余的3促味剂在每个管不同浓度的蓝色食用色素（ 例如 ，0.6％，1％和1.3％）。
- 完整的协议步骤2.2至3.4为每对呈味物质：1.3％红与0.6％的蓝色; 1.3％的红色与1％蓝色和1.3％的红色与1.3％的蓝色。
- 重复步骤4.1.1-4.1.3与蓝色食用色素不同百分比直到偏好指数平均值为0（ 图2）的值。
注：作为一个起点，再加上1％的蓝色食用色素1.3％的红色食用色素通常会产生良好的效果。如果蓝色食用色素没有令人满意的浓度可以匹配到1.3％的染料，则步骤4.1.1通过4.1.3可以与不同浓度的红色着色和蓝色食品着色恒定浓度的重复。 - 分析用相同的优化食用色素浓度待测试的所有条件。
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Representative Results
从口味偏好分析一些典型结果如下所示。在大多数实验中腹部着色强度的一些变化可以看出（ 图1）。在腹部是否强烈或弱任何色素被认为是一个积极的摄入。因此，建议研究者将比分动物盲目的实验条件，同时，以限制任何潜在的偏见。
同样重要的是要选择食品染料不影响优先测定的结果的浓度。的使用各种食用色素浓度的后果的例子示于图2在这个例子中，红色食用染料的数量保持在1.3％，而蓝色食品染料的量变化：0.6％，1％和1.3 ％。每种染料加入至5mM蔗糖以确保参与者在测定高百分比。味道prefereNCE测定然后从每个条件，并根据在3.4.1的公式计算出的偏好指数3个重复进行。加上1.3％红色染料百分之一蓝染料被发现动物的失败来选择蔗糖存在于一个颜色比其他（优先指标值接近0.5），为证明是最适用于这些实验。当只有0.6％的蓝色染料，用1.3％红色染料配对，动物明显地选择了红色染料蔗糖样品（接近1优先索引值），即使在蔗糖浓度为两种颜色相同。用食用染料等量导致轻微的，虽然统计上显著，偏爱含有蓝色染料（优先指标值<0.5）的样品蔗糖。发现这里所确定的最优值，得到在蔗糖浓度范围为1mM至10mM的10倍范围一致的结果。然而，在这里确定的数量，应考虑开始值和实际concentrati项应凭经验计算之前运行实验样品进行测试的所有条件。
的用于计算偏好指数，方程的选择是基于实验的设置和吸引力相对于实验的厌恶的目标。如在图3的实例中所示，苍蝇展示了高浓度的蔗糖与浓度较低的偏好和该首选项可以通过添加酸来逆转。等式（N- 蓝 + 0.5N 紫色 ）从3.4.2 /（N 蓝色 + N 红色 + N 紫色 ）来计算的每个实验条件3次重复的优先索引，因为所关注的化合物被放置在蓝色染料。近1的优先指标表明，当提供1毫米蔗糖（红色）和5毫米蔗糖之间的选择（蓝色），苍蝇几乎总是选择较高的精矿通货膨胀。相反地，苍蝇的第二分组被赋予不同的是10％乙酸相同的选项，用5毫蔗糖选项（蓝色）相结合。与优先指标接近0，具有高浓度的酸7已知的反应一致见过苍蝇几乎完全避免这种情况。
图1： 口味偏好的分析结果 。在腹部着色的变化的一些实施例被示出。暗红色的摄入（A）。淡红色的摄入（B）。深蓝色摄入（C）。淡蓝色摄入（D）。当整个着色出现紫色（E） -紫色腹部被认为是时，或当红色（箭头）腹部显示部分和蓝（箭头）分离的部分（F）的不同的区域。//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2： 控制食品着色效果 。在加入食用色素的促味剂应不会对动物的口味偏好任何影响。变蓝染料的浓度，同时保持红色染料的浓度恒定揭示的1.3％的红色至1.0％的蓝色的最佳组合。这是由近0.5偏好指数值指示。值是平均值±标准偏差。 * P <0.05，*** P <0.001从双面学生t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 用于吸引和厌恶 果蝇 的口味偏好法给予5毫米蔗糖（蓝色）和1毫米蔗糖之间的选择时（红色），自然吸引到近1偏好指标值所看到的高浓度蔗糖。加入厌恶化合物如酸至5mM的蔗糖选项作为偏好指数下降到接近0的值是平均值±标准偏差反转为高蔗糖这个选择。 ***从双面学生t检验P <0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们已经描述了一个简单而有效的协议，用于确定在果蝇味道偏好。在实验中经常使用这个实验版本，以确定感知不同品质（苦，甜，酸，咸和鲜味）呈味物质的味觉受体（GRS）的贡献。 果蝇基因组包含大约60个基因其通过选择性剪接8,9-编码68鉴定味觉受体。然而，其他蛋白质，如离子型谷氨酸受体和TRP通道也被证明在味道10-13中发挥作用。因此，在昆虫味道辨别能力的广泛多样性。此外，不同于受体嗅觉，味觉受体在遍布蝇细胞中表达。含表达不同味觉受体神经元的组合感受器可以在唇瓣，腿，翅膀和ovipositer 14被发现。因此，果蝇依靠超越营养收购一台主机的行为，包括求偶和产卵的味道歧视。
这种味道分析技术可以被应用于解决许多不同的实验问题。例如，由于味道，求偶和产蛋行为是重要的考虑因素对于许多动物，这个协议可以扩展到其他重要昆虫如蜱和蚊子。这样的进步可以证明病媒管理和农药的发展非常有用。此外，该测定中，可以按比例增加为在其中作出果蝇这样一个强大的调查工具数十年前遗传筛选中使用。味道途径的分子完全理解是不知道。在确定新基因中断介导在这个实验口味喜好可以协助在口味电路知识的重要填补空白。此外，如疾病CON的临床前模型中的重要性tinues增加，影响味觉信号机制药理屏幕可以很容易地通过增加治疗化合物在本协议中的促味剂进行。因此，这里所描述的鲁棒检测是许多不同的线路的研究潜在的有价值的工具。
有几个优点使用此协议为口味偏好的分析。只使用单一颜色检测摄入促味剂和当前流行的应用程序的这种饲养模式的早期版本利用微孔板为呈味物质交付15-18。在这个协议中使用的培养皿试验室是目前不准备进行化验味实验室发现了一个有点共同的产品。具有已到位的测定室的可能性，因此，有助于促进新的假设测试，而不时间或在新的设备资金投资。此外，使用蓝色和红色染料的组合是有价值的，以确保所有在实验中计数的动物实际上参与了实验。即使在饥饿24小时，一些健康的动物后的哺乳期明确腹部可以看出。从偏好指标计算消除这些动物是必要的，以确保群体的精确测量。此外，饥饿后，一些动物都会不约而同地，他们能够参与试验之前死亡。虽然一些动物的尸体可能变干，并且很容易计算之前被删除，其他动物尸体可能更加难以确定。因此染料在这两种食物的选择纳入，确保其食用的食物来源只有健康的动物被认为是实验。这大大减少了可在此分析中的单一颜色的版本中看到的结果的可变性。此外，使用两种颜色也允许该饲料在两个基片的动物通过在其腹部混合紫色着色来鉴定。这些动物再重要，因为它们表明，一些个体可具有比整个组弱偏好。应该指出的是，我们已经使用蓝色和黄色食用色素此成人品味试验，其中动物在两个基片进给呈现绿色的腹部也有成功。在这方面，我们已经发现，黄色腹部有些得分比红色腹部不太明显，但仍然有些研究人员可能更喜欢这个选项。如在该协议中使用的颜色，食品染料的适当的平衡需要根据经验确定，以确保染料没有对动物的偏好的效果。
虽然这个口味偏好法是善于确定苍蝇的人口如何响应不同的促味剂，它不提供有关单一的动物反应或实际的食物摄入量的任何信息。这通常用于在果蝇系统学习味道其它测定法提供了更好的分辨率这些参数19的</ SUP>。具体地，长鼻延伸测定是监测单蝇到的液体食品滴的实际行为反应非常有用的。同样的毛细管馈送范例（CAFE）提供评估单蝇摄取的化合物的量，用额外的好处，该测定能够容易地在很长一段时间监测的健壮方法。人口基础味法的另一个局限性这里并躺在得分的有些主观性质。如在图1中所示总有某种程度的食物量变化的消耗和/或通过各动物排泄。因此腹部颜色的强度而变化。这是研究人员的得分动物而盲目板的条件很好的做法。要做到这一点，建议避免在板上书写促味剂的身份，而是标注框板被放置在使得板可作为无偏一马算nner越好。它也是明智通过旋转在独立的实验的兴趣到替代颜色的促味剂，以确认结果。这个附加的分析应该保证结果的稳健精度。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
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