Introduction
Djur använder chemosensation att skilja fördelaktiga förhållanden bortsett från ofördelaktiga förhållanden. Denna uppfattning kan vara avgörande för sådana saker som att bestämma den bästa maten källan, undvika giftiga ämnen eller bestämma bästa parningspartner 1. Chemosensation är ofta indelade i två sensoriska komponenter: lukt sinnen och smak sinnen. En viktig utmärkande egenskap hos dessa sinnen är att luktsinne (lukt) används för att ta prov på omgivande gasformiga kemiska miljön medan gustation (smak) kräver fysisk kontakt med en icke-flyktig substrat. Båda sensoriska modaliteter stimulera neurologiska svar som behandlas och avkodas i hjärnan att producera lämplig attraktiv eller frånstötande beteende 2. Dessa sinnen är därför avgörande för djurens överlevnad.
Bananflugan Drosophila melanogaster är en modellorganism som fortsätter att växa i popularitet för användning i att förståing hur insekter uppfattar lukt och smak. Fruktflugor har enorma fördelar jämfört med andra modellsystem på grund av den rikedom av genetiska verktyg för dissektion av molekylära, cellulära och beteende vägar. Arbete under de senaste 15 åren har varit särskilt avgörande för att karakterisera de specifika cellulära identiteter, neuronala receptorer och signalering mekanismer som är involverade i både doft och smak. Nu, kraften i Drosophila-genetik används för att ytterligare klarlägga hur dessa processer är kodade vid den enda neuron och enkelkretsnivå 3-6. Därför analyser som ger ett enkelt mål avläsning av förändringar sensoriska vägar är avgörande för den fortsatta förväg av dessa områden.
Även en hel del är känt om hur luktsignaler kodas och bearbetas i hjärnan är mycket mindre förstås om liknande mekanismer i smakvägen. Vi beskriver här ett protokoll som kan användas för att fastställa smak preference i Drosophila. Drosophila, som däggdjur, i allmänhet föredrar söt smak föreningar i motsats till bittersmakande föreningar. Vilken som helst kombination av dessa matkällor kan utnyttjas i denna experimentella utformning för att avgöra hur kända genetiska förändringar påverkar smak val. Dessutom kan farmakologiska interventionsstrategier liknande bedömas för deras effekter på djurens smak föredrar. Den lätthet och flexibilitet för denna analys gör det till ett användbart paradigm för att förstå naturen av luktintrycket perception i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Svält
- Förbereda flyga svält ampuller genom att mätta en bomullstuss med 18,2 Mohm vatten vid botten av en standard fluga ampull. Alternativt, på samma sätt mätta en liten remsa av filterpapper med 18,2 Mohm vatten och plats i en vinkel i flaskan.
- Samla flugor i uppsättningar av ~ 100 djur på en CO 2 pad och sedan lägga till flugorna till ett förberett flaskan.
Obs: De bästa resultaten erhålles med djur som är mindre än 5 dagar gamla. Emellertid kan den exakta åldern på de djur skall styras som en experimentell variabel för att bestämma förändringar i smak preferens över tiden. - Använd en bomullstuss eller skum propp för att säkra flaskorna stängd. Placera flaskorna på sin sida på ett miljömässigt kontrollerad inkubator. Hålla temperaturen vid 25 ° C, och fuktigheten över 70%. Lämna flaskor orört under 24 timmar.
2. Taste preferens Assay
- Förbered alla tastants för analysen på samma dags test.
Obs: De exakta tastants som ska användas kommer att variera beroende på experimentell fråga som ställs. Följande är exempel tastants används i detta protokoll. Se avsnitt 4 för optimeringar.- Preparera kontroll tastant (1 mM sackaros) genom att kombinera 10 pl 100 mM sackaros lösning, 13 pl röd karamellfärg, och 977 pl 18,2 Mohm vatten.
- Förbered experimentella tastant (5 mM sackaros) genom att kombinera 50 pl 100 mM sackaros lösning, 10 pl blå livsmedelsfärg, och 940 pl 18,2 Mohm vatten.
- Göra analyskammare med användning av en standard 100 mm x 15 mm petriskål av plast framställas på följande sätt:
- Placera tre 10 l droppar kontroll tastant närmast plåtkanten vid klockan 12 och ytterligare 3 droppar klockan sex. Se till att avståndet mellan dropparna är likartad.
- Placera tre 10 l droppar av experimentell tastant närmast kanten av plattan klockan tre och enandra tre droppar klockan nio. Se till att avståndet mellan dropparna är likartad.
- Upprepa steg 2.2.1 och 2.2.2 för så många replikat som önskas.
- Tom en injektionsflaska med ~ 100 utsvultna flugor på en CO 2 pad precis tillräckligt länge för att söva alla djur (ca 10 sek). Borsta djuren i mitten av en beredd testkammaren och täck med skålen lock.
Obs: Längre perioder av CO 2 exponering bör undvikas för att förbättra återhämtningstiden och begränsa påverkan på ätbeteende. Exponering för is (~ 5 min) kan användas för att söva att undvika CO 2 beteendeeffekter som kan uppstå från och med begränsad exponering. - Placera analyskammaren i en ogenomskinlig kartong. Var noga med att märka utsidan av lådan med tillstånd och genotyp som testas.
- Placera hela setup (analyskammare innesluten i kartongen från steg 2,4) i en 25 ° C inkubator med minst 70% fuktighet under 2 timmar. Upprepa steg 2,3 till 2,5 för alla replikat.
- Efter 2 timmar, placera analyskamrarna, fortfarande finns inom kartonger, direkt i en -20 ° C frys tills redo för kvantifiering.
3. Smak preferens Assay Kvantifiering
- Tillåta att en enda analys kammare för att värmas upp till rumstemperatur (ca 5 min).
- Enligt en dissektion mikroskop, med en borste eller pincett, grupp djur baserad på färgen på deras buk: röd, blå, lila eller klar (Figur 1).
- Registrera antalet djur i varje grupp. Överväga tydliga djur har inte deltagit i analysen och därför inte inkludera dem i några beräkningar.
- Beräkna preferensindex enligt en av följande ekvationer:
- Om den experimentella tastant av ränta läggs till det röda färgämnet, använd sedan (N röd + 0,5 N lila) / (N röd + N blå + N purple).
- Om den experimentella tastant läggs till den blå färgen, justera sedan ekvationen till (N blå + 0,5 N lila) / (N blå + N röd + N lila).
- Upprepa beräkningarna för alla experimentella förhållanden och replikat.
4. Optimering av Taste preferens analys
- Empiriskt bestämma koncentrationen av karamellfärg indikatorer som ska användas så karamellfärg inte påverka resultatet av smaken analysen, enligt följande:
- Förbereda 4 tastants användning av samma basföreningen (t.ex. 5 mM sackaros) såsom indikeras i steg 2,1, men utelämna karamellfärg.
- Lägg 1,3% röd karamellfärg till en av de tastants. Göra de återstående 3 tastants med blå livsmedelsfärg av varierande koncentrationer i varje rör (t ex 0,6%, 1% och 1,3%).
- Komplett protokoll steg 2,2 till 3,4 för varje tastant par: 1,3% röd vs 0,6% blått; 1,3% röd vs 1% blå och1,3% röd vs 1,3% blå.
- Upprepa steg 4.1.1-4.1.3 med olika procentsatser av blå karamellfärg tills genomsnitt Preferensen index Värdet 0 (Figur 2).
Obs: Som utgångspunkt, 1,3% röd karamellfärg i kombination med 1% blå karamellfärg ger vanligtvis goda resultat. Om ingen tillfredsställande koncentration av blå karamellfärg kan anpassas till 1,3% färgämne, sedan steg 4.1.1 till 4.1.3 kan upprepas med varierande koncentrationer av röd färg och en konstant koncentration av blå karamellfärg. - Analysera alla villkor som skall testas med samma optimerade karamellfärg koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Några typiska resultat från smakpreferens analyser visas nedan. I de flesta experiment viss variation i intensiteten av abdominal färgning kommer att ses (Figur 1). Alla färg i buken om intensiv eller svag anses vara en positiv förtäring. Det är därför lämpligt för forskare att göra mål djur medan blinda för den experimentella tillstånd för att begränsa eventuella fördomar.
Det är också viktigt att välja koncentrationer av livsmedelsfärger som inte påverkar resultatet av preferens analysen. Ett exempel på konsekvenserna av att använda olika karamellfärg koncentrationer visas i figur 2 I detta exempel var mängden röda mat färgämne hålls vid 1,3% medan mängden blå livsmedelsfärg varierades. 0,6%, 1%, och 1,3 %. Varje färgämne tillsattes till 5 mM sackaros för att säkerställa en hög andel av deltagare i analysen. Smaken Prefereiou-analys utfördes därefter på 3 replikat från varje betingelse och preferensen Index beräknas enligt ekvationen i 3.4.1. En procent blått färgämne i kombination med 1,3% rött färgämne befanns vara optimalt för dessa experiment såsom visas genom misslyckandet av djur att välja sackaros närvarande i en färg över den andra (preferens indexvärde nära 0,5). När endast 0,6% blått färgämne var parat med 1,3% rött färgämne, djur valde tydligt det röda färgämnet sackaros prover (preferens indexvärde nära 1), trots att sackaros koncentrationen var identisk för båda färgerna. Användning av lika mängder mat färgämnet resulterade i en liten, men statistiskt signifikant, preferens för sackaros prover innehållande blått färgämne (preferens indexvärde <0,5). De optimala värdena som identifieras här befanns ge jämna resultat över ett 10-faldigt område av sackaros-koncentrationer varierande från 1 mM till 10 mM. Icke desto mindre bör de kvantiteter som anges här anses startvärden och faktiska concentrations bör beräknas empiriskt för alla villkor som ska testas innan du kör experimentella prover.
Valet av vilken ekvation som ska användas för att beräkna preferens index baseras på inställningen av experimentet och attraktion mot motvilja mål av försöket. Såsom visas i exemplet i fig 3, flugor visade en preferens för höga koncentrationer av sackaros kontra lägre koncentrationer och denna preferens kan vändas med tillsats av syra. Ekvationen (N blå + 0,5N lila) / (N blå + N röd + N lila) från 3.4.2 användes för att beräkna den preferens index för 3 replikat av varje försöksbetingelse eftersom föreningen av intresse placerades i det blåa färgämnet . En preferens index nära 1 indikerar att när möjlighet att välja mellan ett mM sackaros (i rött) och 5 mM sackaros (i blått), nästan flugorna alltid valde högre concentr ation. Omvänt, tillsattes en andra gruppering av flugor givits samma alternativ utom att 10% ättiksyra i kombination med 5 mM sackaros alternativ (i blått). Flugor nästan helt undvikas denna situation som ses med preferens index nära 0, i överensstämmelse med kända reaktioner på höga koncentrationer av syra 7.
Taste preferensanalysresultat: Figur 1. Några exempel i variationen av buken färgning visas. Mörkröd intas (A). Ljusröd intas (B). Mörkblå intas (C). Ljusblå intas (D). Lila abdomens beaktas när hela färgning lila (E), eller när distinkta regioner av buken visar portioner av rött (pilspets) och separata portioner av blå (pil) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Styra för mat färgning effekter. Tillsatsen av karamellfärg till tastants bör inte ha någon effekt på djurens smak föredrar. Att variera koncentrationen av blått färgämne under bibehållande av en konstant koncentration av rött färgämne avslöjade en optimal kombination av 1,3% rött till 1,0% blått. Detta indikeras av en preferens indexvärde nära 0,5. Värden är medelvärde ± standardavvikelse. * p <0,05, *** p <0,001 från dubbelsidig t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Smaken föredrar analysen används för attraktion och aversion Drosophila är naturligt dras till höga sackaroskoncentrationer som ses av en preferens indexvärde nära en när de får välja mellan 5 mM sackaros (i blått) och 1 mM sackaros (i rött) . Tillsats av en aversiv förening såsom syra till 5 mM sackaros alternativet reverserar denna val för hög halt sackaros som preferens index sjunker till nära 0. Värden är medelvärde ± standardavvikelsen. *** p <0,0001 från dubbelsidig t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit ett enkelt men effektivt protokoll för att bestämma smak preferens i Drosophila. Versioner av denna analys används rutinmässigt i experiment för att bestämma bidragen från smakreceptorer (GRS) att uppfatta de olika kvaliteter (bitter, sött, surt, salt och umami) av smakföreningar. Drosophila-genomet innehåller cirka 60 gener som kodar 68 identifierade smakreceptorer genom alternativ splitsning 8,9. Emellertid har andra proteiner, såsom jonotropiska glutamatreceptorer och TRP-kanaler även visats spela en roll i smak 10-13. Därför finns det omfattande mångfald i diskriminerande makt smak hos insekter. Dessutom, till skillnad från receptorer för lukt, är smakreceptorer uttryckta i celler som ligger över hela flugan. Sensilla innehållande kombinationer av neuroner som uttrycker olika smak receptorer kan hittas på de labellum, ben, vingar och Äggläggningsrör 14. Som sådan,Drosophila lita på smak diskriminering för en mängd beteenden bortom näring förvärv inklusive uppvaktning och äggläggning.
Denna smak analysteknik kan tillämpas på de många olika experimentella frågor. Till exempel, eftersom smak, uppvaktning, och äggläggning beteenden är viktiga överväganden för många djur, kan detta protokoll vara skalbar till andra viktiga insekter som fästingar och myggor. En sådan utveckling skulle kunna vara till nytta för bekämpning av smittospridare förvaltning och utveckling av bekämpningsmedel. Dessutom kan denna analys skalas upp för användning i termins genetiska skärmar som har gjort Drosophila sådant kraftfullt undersökande verktyg för årtionden. Den fullständiga molekylär förståelse av smak vägar är inte känd. Identifiera störningar i nya gener som förmedlar smakpreferenser i denna analys kan hjälpa till att fylla i stora luckor i smak krets kunskap. Dessutom, som vikten av prekliniska modeller av sjukdoms confortsätter att öka, kan farmakologiska skärmar påverkar smaksignaleringsmekanismer lätt utföras genom att tillsätta terapeutiska föreningar till tastants i detta protokoll. Därför robust analys som beskrivs här är ett potentiellt värdefullt verktyg för många olika forskningslinjer.
Det finns flera fördelar med att använda detta protokoll för analys av smakpreferens. Tidiga versioner av denna matning paradigm utnyttjas endast en enda färg för detektering av intagna tastants och populära aktuella tillämpningar använder sig av mikrotiterplattor för tastant leverans 15-18. Petriskål testkammaren som används i detta protokoll är en ganska vanligt produkt som finns i laboratorier för närvarande inte beredda att utföra smakanalyser. Sannolikheten för att ha en analyskammare redan på plats, därför hjälper underlätta testning av nya hypoteser utan tid eller pengar investeringar i ny utrustning. Dessutom är kombinationen av användning av blå och röda färgämnen värdefullt för att säkerställa att alladjur räknas i experimentet faktiskt deltog i försöket. Även efter 24 timmar av svält, kan vissa friska djur med tydliga magar efter utfodringsperioden ses. Eliminera dessa djur från beräkningen preferens index är nödvändigt för att säkerställa en korrekt mätning av befolkningen. Dessutom, efter svält vissa djur alltid kommer att dö innan de kan delta i analysen. Medan några döda djur kan torka ut och kan lätt tas bort innan räkning, kan andra döda djur vara svårare att identifiera. Införandet av färgämnet i båda matval därför säkerställer att endast friska djur som konsumeras en näringskälla anses för experimentet. Detta minskar i hög grad variationen för de resultat som kan ses i enda färg versioner av denna analys. Dessutom tillåter användningen av två färger också djur som livnär sig på båda substraten som identifieras genom den blandade rödfärgning i deras magar. Dessa djur are viktiga eftersom de visar att vissa individer kan ha svagare preferenser än hela gruppen. Det bör noteras att vi också har haft framgång med hjälp av blå och gula mat färgämnen för vuxen smak analys där djuren livnär sig på båda substraten uppvisar gröna bakkroppen. I detta sammanhang har vi funnit att de gula magar är något mindre uppenbar att göra mål än röda bakkroppen, men ändå vissa forskare kanske föredrar det här alternativet. Som med de färger som används i detta protokoll måste en lämplig balans av livsmedelsfärger att bestämmas empiriskt för att säkerställa färgämnena inte har någon effekt på djurens önskemål.
Även om denna smak preferens analys är bra på att bestämma hur en population av flugor reagerar på olika tastants, inte ger någon information om enskilda djur svar eller faktiska födointag. Andra analyser som vanligen används för att studera smak i Drosophila-system erbjuder bättre upplösning av dessa parametrar 19 </ Sup>. Närmare bestämt är det snabel förlängning analysen mycket användbar för att övervaka den faktiska beteendesvar enstaka flugor till droppar av flytande livsmedel. Likaså en kapillär matning paradigm (CAFE) erbjuder en robust sätt att bedöma mängden intagna föreningar i enstaka flugor, med den extra fördelen att analysen kan lätt följas över långa tidsperioder. En annan begränsning av populationsbaserad smak analys här inte ligger i något subjektiva karaktär poäng. Såsom illustreras i figur 1 finns det alltid en viss grad av variation i mängden mat som konsumeras och / eller utsöndrade av varje djur. Därför intensiteten hos den abdominala färg varierar. Det är god praxis för forskare att göra mål djuren medan blinda villkoren i plattan. För att åstadkomma detta, är det rekommenderat att undvika att skriva tastant identiteter på plattorna utan märka rutorna plattorna placeras i så att plattorna kan räknas in som opartisk en manner som möjligt. Det är också klokt att bekräfta resultaten genom att rotera tastant av intresse för omväxlande färger i separata experiment. Denna ytterligare analys bör säkerställa robust noggrannhet av resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
- Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
- Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
- Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
- Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
- Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042 (2013).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
