Introduction
Les animaux utilisent chemosensation pour distinguer des conditions avantageuses en dehors des conditions désavantageuses. Cette perception peut être critique pour des choses telles que la détermination de la meilleure source alimentaire, en évitant les substances toxiques ou de déterminer le meilleur partenaire d'accouplement 1. Chemosensation est souvent divisée en deux composants sensoriels: sens olfactif et les sens gustatifs. Une principale caractéristique distinctive de ces sens est que l'olfaction (odorat) est utilisé pour échantillonner l'environnement chimique gazeux environnant tout gustation (goût) nécessite un contact physique avec un substrat non volatile. Les deux modalités sensorielles stimulent les réponses neurologiques qui sont traités et décodés dans le cerveau pour produire le comportement attractives ou répulsives appropriée 2. Ces sens sont donc essentiels pour la survie des animaux.
La mouche des fruits Drosophila melanogaster est un organisme modèle qui continue de croître en popularité pour une utilisation dans comprendrement comment les insectes perçoivent l'odeur et le goût. Les mouches des fruits offrent d'énormes avantages par rapport aux autres systèmes de modèles en raison de la richesse des outils génétiques disponibles pour la dissection des voies moléculaires, cellulaires et comportementales. Le travail au cours des 15 dernières années a été particulièrement important dans la caractérisation des identités cellulaires spécifiques, des récepteurs neuronaux, et les mécanismes impliqués à la fois l'odeur et le goût de signalisation. Maintenant, la puissance de la génétique chez la drosophile est utilisée pour élucider la façon dont ces processus sont codés au neurone unique et un seul circuit niveau 3-6. Par conséquent, les essais qui fournissent facilement marqué des lectures altérations des voies sensorielles sont essentielles à l'avance continue de ces champs.
Alors que beaucoup est connu sur la façon dont les signaux olfactifs sont codées et traitées dans le cerveau, beaucoup moins, on entend à propos des mécanismes similaires dans la voie de gustatifs. Nous décrivons ici un protocole qui peut être utilisé pour déterminer le goût préférenCE chez la drosophile. Drosophila, comme les mammifères, préfèrent généralement composés de goût sucré , par opposition à des composés de goût amer. Toute combinaison de ces sources de nourriture peut être utilisée dans cette conception expérimentale pour déterminer comment des altérations génétiques connues affectent le choix du goût. En outre, les stratégies d'intervention pharmacologiques peuvent être évalués de manière similaire pour leurs effets sur la préférence du goût des animaux. La facilité et la flexibilité de ce test, il est un paradigme utile pour comprendre la nature de la perception gustative chez la drosophile.
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Protocol
1. Starvation
- Préparer voler des flacons de famine en saturant une boule de coton avec 18,2 MQ eau au fond d'un flacon de mouche standard. Alternativement, saturer de même une petite bande de papier filtre avec 18,2 MQ eau et lieu à un angle dans le flacon.
- Recueillir les mouches dans des ensembles de ~ 100 animaux sur un coussin de CO 2, puis ajouter les mouches à un flacon préparé.
Remarque: Les meilleurs résultats sont obtenus avec les animaux qui sont âgés de moins de 5 jours. Cependant, l'âge exact des animaux peut être contrôlée comme une variable expérimentale pour déterminer les changements dans les préférences des goûts au fil du temps. - Utiliser une boule de coton ou de mousse bouchon pour fixer les flacons fermés. Placez les flacons de leur côté dans un incubateur à environnement contrôlé. Maintenir la température à 25 ° C et le taux d'humidité supérieur à 70%. Laisser les flacons intacts pendant 24 heures.
2. Goût préférence Assay
- Préparer tous sapides pour le test le même jour uns tests.
Remarque: Les tastants exactes à utiliser varie en fonction de la question expérimentale posées. Ce qui suit est un exemple tastants utilisés dans ce protocole. Voir la section 4 pour les optimisations.- Préparer le contrôle exhausteur de goût (1 mM de saccharose) en combinant 10 ul de 100 mM solution de saccharose, 13 pi de colorant alimentaire rouge, et 977 pi de 18,2 MQ eau.
- Préparer exhausteur de goût expérimental (5 mM de saccharose) en combinant 50 ul de 100 mM solution de saccharose, 10 pi de colorant alimentaire bleu, et 940 pi de 18,2 MQ eau.
- Faire des chambres d'essai en utilisant un x 15 mm plat en plastique de Pétri 100 mm standard préparé de la manière suivante:
- Placez trois 10 gouttes ul de contrôle exhausteur de goût le plus proche du bord de la plaque à 12 heures et un autre 3 gouttes à 6 heures. Assurez-vous que l'espacement entre les gouttes est similaire.
- Placez trois 10 gouttes ul d'exhausteur de goût expérimental le plus proche du bord de la plaque à 3 heures et uneautre 3 gouttes à 9 heures. Assurez-vous que l'espacement entre les gouttes est similaire.
- Répétez les étapes 2.2.1 et 2.2.2 pour autant de répétitions que désiré.
- Empty 1 flacon de ~ 100 mouches affamées sur un tampon juste assez longtemps pour anesthésier les animaux (environ 10 sec) CO 2. Badigeonner les animaux dans le milieu d'une chambre de dosage préparée et couvrir avec le couvercle plat.
Remarque: plus longue période de CO 2 l' exposition doit être évitée afin d' améliorer le temps de récupération et de limiter les interférences avec le comportement alimentaire. L' exposition à la glace (~ 5 min) peut être utilisé pour anesthésier pour éviter CO 2 effets comportementaux qui peuvent découler de même exposition limitée. - Placer la chambre de dosage dans une boîte en carton opaque. Assurez-vous d'étiqueter l'extérieur de la boîte avec la condition et le génotype testé.
- Placer l'ensemble de l'installation (chambre dosage contenue dans une boîte en carton à l'étape 2.4) dans un incubateur à 25 ° d'au moins 70% d'humidité pendant 2 heures. Répétez les étapes 2.3 à 2.5 pour toutes les répétitions.
- Après 2 heures, placer les chambres d'analyse, encore contenus dans des boîtes en carton, directement dans un -20 ° C au congélateur jusqu'au moment pour la quantification.
3. Goût préférence Assay Quantification
- Permettre une chambre de dosage unique se réchauffer à la température ambiante (environ 5 min).
- Sous un microscope de dissection, en utilisant une brosse ou une paire de pinces, les animaux du groupe sur la base de la couleur de leur abdomen: rouge, bleu, violet ou clair (Figure 1).
- Notez le nombre d'animaux dans chaque groupe. Considérer les animaux claires de ne pas avoir participé à l'essai, et donc ne pas les inclure dans les calculs.
- Calculer l'indice de préférence selon l'une des équations suivantes:
- Si l'exhausteur de goût expérimental d'intérêt est ajouté au colorant rouge, puis utilisez (N rouge + 0,5N violet) / (N + N rouge bleu + N purple).
- Si l'exhausteur de goût expérimental est ajouté au colorant bleu, puis ajuster l'équation (N bleu + 0,5N violet) / (N + N bleu rouge + N violet).
- Répéter les calculs pour toutes les conditions expérimentales et répétitions.
4. Optimisation du Goût Préférence Assay
- Déterminer empiriquement la concentration des indicateurs de colorants alimentaires à être utilisé si le colorant alimentaire ne modifie pas les résultats de l'essai de goût, de la manière suivante:
- Préparer 4 tastants en utilisant le même composé de base (par exemple mM de sucrose 5) comme indiqué dans l' étape 2.1, mais omettre le colorant alimentaire.
- Ajouter 1,3% colorant alimentaire rouge à l'un des sapides. Faire les 3 tastants restants avec colorant alimentaire bleu de concentrations variables dans chaque tube (par exemple 0,6%, 1% et 1,3%).
- protocole complète les étapes 2.2 à 3.4 pour chaque paire exhausteur de goût: 1,3% contre 0,6% rouge bleu; 1,3% contre 1% rouge et bleu1,3% contre 1,3% rouge bleu.
- Répétez l' étape 4.1.1-4.1.3 avec différents pourcentages de colorant alimentaire bleu jusqu'à ce que les moyennes de l' indice de préférence une valeur de 0 (Figure 2).
Remarque: En tant que point de départ, 1,3% du colorant alimentaire rouge couplé avec 1% de colorant alimentaire bleu donne généralement de bons résultats. Si aucune concentration satisfaisante de colorant alimentaire bleu peut être adaptée à 1,3% de colorant, puis l'étape 4.1.1 à travers 4.1.3 peut être répété avec des concentrations variables de colorant rouge et une concentration constante de colorant alimentaire bleu. - Analyser toutes les conditions à tester avec les mêmes concentrations optimisées de colorant alimentaire.
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Representative Results
Quelques résultats typiques de goût des tests de préférence sont présentés ci-dessous. Dans la plupart des expériences une certaine variation de l'intensité de la coloration abdominale On voit (figure 1). Toute coloration dans l'abdomen si intense ou faible est considéré comme une ingestion positive. Il est donc conseillé aux chercheurs de marquer les animaux tout en aveugle à la condition expérimentale afin de limiter les biais potentiels.
Il est également important de choisir des concentrations de colorants alimentaires qui ne touchent pas le résultat du test de préférence. Un exemple des conséquences de l' utilisation de différentes concentrations de colorant alimentaire est illustré sur la figure 2 Dans cet exemple, la quantité de colorant alimentaire rouge a été maintenue à 1,3% , tandis que la quantité de colorant alimentaire bleu a été modifiée. 0,6%, 1% et 1,3 %. Chaque colorant a été ajouté à 5 mM de saccharose pour assurer un pourcentage élevé de participants à l'essai. Le goût preferetest nce a ensuite été réalisée sur 3 répétitions de chaque état et l'indice de préférence calculé selon l'équation en 3.4.1. Un pour cent colorant bleu couplé avec 1,3% de colorant rouge a été jugée optimale pour ces expériences comme en témoigne l'échec des animaux à choisir saccharose présent en une seule couleur sur l'autre (valeur d'indice de préférence proche de 0,5). Lorsque seulement 0,6% de colorant bleu a été jumelé avec 1,3% de colorant rouge, les animaux ont clairement choisi la (valeur d'indice de préférence à proximité de 1) colorant rouge des échantillons de saccharose, même si la concentration en saccharose est identique pour les deux couleurs. En utilisant des quantités égales de colorant alimentaire a entraîné une légère, mais statistiquement significative, la préférence pour les échantillons de saccharose contenant un colorant bleu (valeur d'indice de préférence <0,5). Les valeurs optimales identifiées ici ont été trouvés pour donner des résultats cohérents sur une plage de 10 fois des concentrations de saccharose allant de 1 mM à 10 mM. Néanmoins, les quantités identifiées ici devraient être considérées à partir des valeurs et réelles concentrations dons doit être calculé de manière empirique pour toutes les conditions à tester avant d'exécuter les échantillons expérimentaux.
Le choix de l'équation à utiliser pour le calcul de l'indice de préférence est basée sur la configuration de l'expérience et de l'attraction par rapport aux objectifs de l'aversion de l'expérience. Comme on le voit dans l'exemple de la figure 3, les mouches ont montré une préférence pour les concentrations élevées de saccharose par rapport à des concentrations plus faibles , et cette préférence peut être inversée par l'addition d'acide. L'équation (N bleu + 0,5N violet) / (N + N bleu rouge + N violet) de 3.4.2 a été utilisé pour calculer l'indice de préférence pour 3 répétitions de chaque condition expérimentale puisque le composé d'intérêt a été placé dans le colorant bleu . Un indice de préférence proche de 1 indique que lorsqu'il est offert le choix entre le saccharose 1 mM (en rouge) et du saccharose 5 mM (en bleu), les mouches presque toujours choisi le concentr supérieur ation. A l'inverse, un second groupe de mouches a été donné les mêmes options, sauf que l'acide acétique à 10% a été combinée avec la possibilité mM de saccharose 5 (en bleu). Les mouches presque complètement évité cette situation comme on le voit avec l'indice de préférence proche de 0, en accord avec les réponses connues à des concentrations élevées d'acide 7.
Figure 1: les résultats d'analyse des préférences de goût. Quelques exemples de la variation de coloration abdominale sont représentés. Rouge foncé ingérée (A). Lumière rouge ingérée (B). Dark blue ingérée (C). Bleu clair ingérée (D). Abdomens pourpres sont pris en compte la totalité de la coloration apparaît violet (E), ou lorsque des régions distinctes de l'exposition des parties de l' abdomen de couleur rouge (flèche) et des parties séparées de bleu (flèche) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Contrôle des effets de coloration des aliments. L'ajout de colorant alimentaire pour les tastants ne devrait pas avoir d'effet sur la préférence de goût des animaux. Varier la concentration du colorant bleu, tout en maintenant une concentration constante de colorant rouge révèle une combinaison optimale de 1,3% à 1,0% de rouge bleu. Ceci est indiqué par une valeur d'indice de préférence proche de 0,5. Les valeurs sont la moyenne ± écart-type. * p <0,05, *** p <t-test de l' étudiant 0,001 à partir de deux côtés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Le test de préférence de goût utilisé pour l' attraction et l' aversion Drosophila sont naturellement attirés par fortes concentrations de saccharose comme on le voit par une valeur d'indice de préférence près de 1 lorsqu'il a le choix entre le saccharose 5 mM (en bleu) et 1 mM de saccharose (en rouge) . L'ajout d'un composé tel que l'acide aversif à l'option de saccharose à 5 mM inverse ce choix pour une grande saccharose comme indice de préférence tombe à près de 0. Les valeurs sont la moyenne ± l'écart type. *** p <0,0001 de test t de l' étudiant recto-verso. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous avons décrit un protocole simple mais efficace pour déterminer la préférence de goût chez la drosophile. Les versions de ce test sont couramment utilisés dans des expériences pour déterminer les contributions des récepteurs gustatifs (Grs) pour percevoir les différentes qualités (amer, sucré, acide, salé et umami) des composés de goût. Le génome de la Drosophile contient environ 60 gènes qui codent pour 68 récepteurs gustatifs identifiés par l' épissage alternatif 8,9. Cependant, d' autres protéines telles que les récepteurs ionotropiques du glutamate et des canaux de TRP ont également été mis en évidence pour jouer un rôle dans le goût 10-13. Par conséquent, il y a une vaste diversité dans le pouvoir discriminant du goût chez les insectes. En outre, à la différence des récepteurs pour l'odorat, les récepteurs du goût sont exprimés dans les cellules situées partout dans la volée. Sensilles contenant des combinaisons de neurones exprimant différents récepteurs du goût peut être trouvé sur les labelle, les jambes, les ailes et OVISCAPTE 14. En tant que tel,Drosophila reposent sur la discrimination fondée sur le goût pour une foule de comportements au - delà de l' acquisition de la nutrition , y compris la cour et la ponte.
Cette technique d'analyse du goût peut être appliqué pour traiter de nombreuses questions différentes expérimentales. Par exemple, étant donné que les comportements de pose goût, séduction, et des œufs sont des considérations importantes pour de nombreux animaux, ce protocole peut être évolutive à d'autres insectes importants tels que les tiques et les moustiques. Cette progression pourrait se révéler utile pour la gestion des vecteurs de maladies et le développement des pesticides. En outre, ce test pourrait être étendu pour une utilisation dans les écrans génétiques à terme qui ont fait la drosophile un puissant outil d' enquête depuis des décennies. La compréhension moléculaire complète des voies de goût on ne sait pas. Identification des perturbations dans les nouveaux gènes qui interviennent dans les préférences gustatives dans ce test pourrait aider à combler les lacunes importantes dans les connaissances du circuit de goût. En outre, comme l'importance des modèles précliniques de la maladie continue d'augmenter, les écrans pharmacologiques affectant les mécanismes de signalisation gustatifs peuvent facilement être réalisées en ajoutant des composés thérapeutiques aux sapides dans ce protocole. Par conséquent, le dosage solide décrit ici est un outil potentiellement précieux pour beaucoup de différentes lignes de recherche.
Il y a plusieurs avantages à utiliser ce protocole pour l'analyse des préférences gustatives. Les premières versions de ce paradigme d'alimentation utilisé une seule couleur pour la détection de tastants ingérées et les applications actuelles populaires font usage de plaques de microtitrage pour la livraison de 15-18 exhausteur de goût. La chambre de dosage de la boîte de Petri utilisé dans ce protocole est un produit peu commun dans les laboratoires pas actuellement préparés pour effectuer des tests de goût. La probabilité d'avoir une chambre d'essai déjà en main, par conséquent, contribue à faciliter l'essai de nouvelles hypothèses sans temps ou de l'investissement de l'argent dans de nouveaux équipements. En outre, la combinaison de l'utilisation des colorants rouges et bleus est utile pour assurer queles animaux comptés dans l'expérience ont effectivement participé à l'expérience. Même après 24 heures de faim, certains animaux en bonne santé avec des abdomens claires après la période d'alimentation peuvent être vus. L'élimination de ces animaux dans le calcul de l'indice de préférence est nécessaire d'assurer une mesure précise de la population. En outre, après la famine certains animaux seront invariablement meurent avant qu'ils ne soient en mesure de participer à l'essai. Alors que certains animaux morts peuvent dessécher et peuvent facilement être enlevés avant le comptage, d'autres animaux morts peuvent être plus difficiles à identifier. Par conséquent, l'inclusion de colorant dans les deux choix alimentaires garantit que les animaux ne sains qui ont consommé une source de nourriture sont pris en considération pour l'expérience. Ceci réduit considérablement la variabilité des résultats qui peuvent être vus dans les versions à une seule couleur de cet essai. En outre, l'utilisation de deux couleurs permet aussi des animaux qui se nourrissent sur les deux substrats à être identifiés par la coloration pourpre mixte dans leur abdomen. Ces animaux are important, car ils démontrent que certaines personnes peuvent avoir des préférences plus faibles que l'ensemble du groupe. Il convient de noter que nous avons également eu du succès en utilisant des colorants alimentaires jaune et bleu pour cet adulte goût dosage où les animaux se nourrissant sur les deux substrats présentent des abdomens verts. Dans ce contexte, nous avons constaté que les abdomens jaunes sont un peu moins évident pour marquer que abdomens rouge, mais néanmoins certains chercheurs pouvons préférer cette option. Comme avec les couleurs utilisées dans ce protocole, un bon équilibre entre les colorants alimentaires doit être déterminée de manière empirique pour assurer les colorants ne sont pas avoir un effet sur la préférence des animaux.
Bien que ce test de préférence de goût est bon à déterminer comment une population de mouches répond à différentes sapides, il ne fournit pas d'informations sur les réponses des animaux simples ou l'ingestion de nourriture réelle. D' autres essais qui sont couramment utilisés pour l' étude de goût dans les systèmes de Drosophila offrent une meilleure résolution de ces paramètres 19 </ Sup>. Plus précisément, l'essai d'extension du proboscis est très utile pour le suivi de la réponse comportementale réelle des mouches simples à des gouttes de liquides alimentaires. De même un paradigme capillaire d'alimentation (CAFE) offre un moyen robuste d'évaluer la quantité de composés ingérés en une seule mouche, avec l'avantage supplémentaire que le dosage peut être facilement contrôlé sur de longues périodes de temps. Une autre limitation de l'essai de goût en fonction de la population ici ne réside dans la nature quelque peu subjective de la notation. Comme cela est illustré sur la figure 1 , il y a toujours un certain degré de variation de la quantité de nourriture consommée et / ou excrétée par chaque animal. Par conséquent, l'intensité de la couleur varie abdominale. Il est bon pour les chercheurs de marquer les animaux tout en aveugle aux conditions de la plaque. Pour ce faire, il est recommandé d'éviter d'écrire des identités exhausteur de goût sur les plaques, mais au lieu d'étiqueter les boîtes, les plaques sont placées dans de telle sorte que les plaques peuvent être comptées en tant impartiale une manner que possible. Il est également prudent de confirmer les résultats en faisant tourner l'exhausteur de goût intéressant de couleurs alternées dans des expériences séparées. Cette analyse supplémentaire devrait assurer l'exactitude robuste des résultats.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
- Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
- Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
- Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
- Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
- Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042 (2013).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
