Introduction
Dyr bruger chemosensation at skelne fordelagtige vilkår bortset fra ufordelagtige betingelser. Denne opfattelse kan være afgørende for sådanne ting som at bestemme den bedste fødekilde, undgå giftige stoffer eller bestemme den bedste parring partner 1. Chemosensation er ofte opdelt i to sensoriske komponenter: lugtesans og smagsmæssige sanser. En af de vigtigste kendetegn for disse sanser er, at lugtesansen (lugt) bruges til at prøve det omgivende gasformige kemiske miljø mens gustation (smag) kræver fysisk kontakt med en flygtig substrat. Begge sensoriske modaliteter stimulere neurologiske reaktioner, som behandles og afkodes i hjernen til at producere den passende tiltrækkende eller frastødende opførsel 2. Disse sanser er derfor afgørende for dyr overlevelse.
Bananfluen Drosophila melanogaster er en model organisme, som fortsætter med at vokse i popularitet til brug i forståring hvordan insekter opfatter lugt og smag. Bananfluer giver enorme fordele i forhold til andre modelsystemer grund af rigdom af genetiske værktøjer til rådighed for dissektion af molekylære, cellulære og adfærdsmæssige veje. Arbejdet i de sidste 15 år har været særligt medvirkende til at karakterisere de specifikke cellulære identiteter, neuronale receptorer, og signaler mekanismer involveret i både duft og smag. Nu er kraften i Drosophila genetik bliver brugt til yderligere at belyse, hvordan disse processer er kodet på enkelt neuron og enkelt kredsløb niveau 3-6. Derfor analyser, som giver let scorede udlæsninger af ændringer i sensoriske veje er afgørende for den fortsatte forud for disse områder.
Mens en hel del viden om, hvordan olfaktoriske signaler kodet og behandlet i hjernen, er meget mindre forstået om lignende mekanismer i smagssansen pathway. Vi beskriver her en protokol, som kan bruges til at fastslå smag preference i Drosophila. Drosophila, ligesom pattedyr, generelt foretrækker søde smag forbindelser i modsætning til bitre vinsmagning forbindelser. Enhver kombination af disse fødekilder kan anvendes i dette eksperimentelle design at bestemme, hvordan kendte genetiske ændringer påvirker smag valg. Desuden kan farmakologiske interventionsstrategier ligeledes vurderes for deres virkninger på dyrenes smag præference. Den lethed og fleksibilitet af denne analyse gør det til et nyttigt paradigme for forståelsen af gustatory opfattelse i Drosophila.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sult
- Forbered flyve sult hætteglas ved at mætte et stykke vat med 18,2 MOhm vand i bunden af en standard flue hætteglas. Alternativt ligeledes mætte en lille strimmel af filtrerpapir med 18,2 MOhm vand og sted i en vinkel inden for hætteglasset.
- Saml fluer i sæt af ~ 100 dyr på en CO2-pad og derefter tilføje fluerne til en forberedt hætteglas.
Bemærk: De bedste resultater opnås med dyr, som er mindre end 5 dage gamle. Imidlertid kan den nøjagtige dyrenes alder styres som en eksperimentel variabel at bestemme ændringer i smag præference over tid. - Brug et stykke vat eller skum prop til at sikre hætteglassene lukket. Placer hætteglas på deres side på en miljømæssigt kontrolleret inkubator. Hold temperaturen ved 25 ° C, og fugtigheden over 70%. Lad hætteglas uberørt i 24 timer.
2. smagspræference Assay
- Forbered alle smagsstoffer for analysen på samme dag ens test.
Bemærk: De præcise smagsstoffer, der skal anvendes, vil variere afhængigt af eksperimentel spørgsmål bliver stillet. Følgende er eksempler på smagsstoffer, der anvendes i denne protokol. Se afsnit 4 for optimeringer.- Forbered kontrol smagsstof (1 mM saccharose) ved at kombinere 10 pi 100 mM saccharoseopløsning, 13 pi af rød frugtfarve, og 977 pi 18,2 MQ vand.
- Forbered eksperimentel smagsstof (5 mM saccharose) ved at kombinere 50 gi 100 mM saccharoseopløsning, 10 pi blå frugtfarve, og 940 pi 18,2 MQ vand.
- Gør assay kamre ved anvendelse af en standard 100 mm x 15 mm plastik petriskål fremstilles på følgende måde:
- Placer tre 10 pi dråber kontrol smagsstof nærmest kanten af pladen ved 12-tiden og en anden 3 dråber klokken 6. Sørg for, at afstanden mellem dråber er ens.
- Placer tre 10 pi dråber eksperimentel smagsstof nærmest kanten af pladen klokken 3 og enandre 3 dråber klokken ni. Sørg for, at afstanden mellem dråber er ens.
- Gentag trin 2.2.1 og 2.2.2 for så mange gentagelser som ønsket.
- Empty 1 hætteglas med ~ 100 udsultede fluer på en CO 2 pad lige længe nok til at bedøve alle dyr (ca. 10 sek). Børste dyrene ind i midten af en forberedt assay kammer og dække med skålen låg.
Bemærk: Længere perioder af CO 2 eksponering bør undgås for at forbedre inddrivelsen tid og begrænse indgreb i fodring adfærd. Udsættelse for is (~ 5 min) kan anvendes til at bedøve for at undgå CO 2 adfærdsmæssige effekter, der kan opstå fra selv begrænset eksponering. - Placer assaykammeret i en uigennemsigtig papkasse. Sørg for at mærke uden på kassen med den betingelse og genotype, der testes.
- Placere hele opsætningen (assaykammeret indeholdt i papkasse fra trin 2.4) i en 25 ° C inkubator med mindst 70% fugtighed i 2 timer. Gentag trin 2.3 gennem 2,5 for alle replikater.
- Efter 2 timer placere assay kamre, stadig indeholdt i papkasser, direkte ind i en -20 ° C fryser indtil den er klar til kvantificering.
3. smagspræference Assay Kvantificering
- Give en enkelt assay kammer til at varme op til stuetemperatur (ca. 5 min).
- Under en dissektion mikroskop, ved hjælp af en pensel eller tang, gruppe dyr baseret på farven på deres mave: rød, blå, lilla eller klar (figur 1).
- Notér antallet af dyr i hver gruppe. Overveje klare dyr har ikke deltaget i analysen, og derfor ikke medtage dem i beregninger.
- Beregn præference indekset ifølge et af de følgende ligninger:
- Hvis der tilsættes den eksperimentelle smagsstoffet af interesse for rødt farvestof, og brug derefter (N rød + 0,5N lilla) / (N rød + N blå + N viole).
- Hvis der tilsættes den eksperimentelle smagsstof til den blå farve, derefter justere ligningen til (N blå + 0,5N lilla) / (N blå + N rød + N lilla).
- Gentag beregningerne for alle forsøgsbetingelser og gentagelser.
4. Optimering af Taste Preference Assay
- Empirisk bestemme koncentrationen af fødevarer farvelægning indikatorer, der skal bruges, så frugtfarve ikke påvirker resultatet af smag analysen, som følger:
- Forbered 4 smagsstoffer anvendelse af den samme base forbindelse (f.eks 5 mM saccharose) som angivet i trin 2.1, men udelader levnedsmiddelfarvestof.
- På 1,3% rødt frugtfarve til en af smagsstoffer. Foretag de resterende 3 smagsstoffer med blå levnedsmiddelfarve af varierende koncentrationer i hvert rør (fx 0,6%, 1%, og 1,3%).
- Komplet protokol trin 2.2 gennem 3,4 for hvert smagsstof par: 1,3% rød vs. 0,6% blue; 1,3% rød vs. 1% blå og1,3% rød vs. 1,3% blå.
- Gentag trin 4.1.1-4.1.3 med forskellige procentdele af blå frugtfarve indtil præference indeks gennemsnit en værdi på 0 (figur 2).
Bemærk: Som udgangspunkt, 1,3% rød frugtfarve kombineret med 1% blå frugtfarve typisk giver gode resultater. Hvis nogen tilfredsstillende koncentration af blå levnedsmiddelfarve kan matches til 1,3% farvestof, derefter trin 4.1.1 gennem 4.1.3 kan gentages med varierende koncentrationer af røde farvestoffer og en konstant koncentration af blå levnedsmiddelfarve. - Analyser alle forhold, der skal testes med de samme optimerede mad farvelægning koncentrationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nogle typiske resultater fra smagspræference assays er vist nedenfor. I de fleste eksperimenter vis variation i intensiteten af abdominal farvestoffer vil ses (figur 1). Enhver farve i maven, om intens eller svag betragtes som en positiv indtagelse. Det er derfor tilrådeligt for forskere at score dyr, mens blinde til den eksperimentelle tilstand for at begrænse eventuelle afvigelser.
Det er også vigtigt at vælge koncentrationer af farvestoffer til levnedsmidler, der ikke påvirker resultatet af præference assay. Et eksempel på konsekvenserne af at bruge forskellige levnedsmiddelfarvestof koncentrationer er vist i fig 2 I dette eksempel blev mængden af røde mad farvestof holdt ved 1,3%, mens mængden af blåt mad farvestof blev varieret:. 0,6%, 1%, og 1,3 %. Hver farvestof blev tilsat til 5 mM sucrose at sikre en høj andel af deltagerne i assayet. Smagen preference assay blev derefter udført på 3 replikater fra hver betingelse og præference indeks beregnes ifølge ligningen i 3.4.1. Én procent blåt farvestof koblet med 1,3% rødt farvestof blev fundet at være optimal for disse eksperimenter som påvist af svigt af dyr til at vælge saccharose til stede i en farve over den anden (præference indeksværdi tæt på 0,5). Når der kun 0,6% blåt farvestof blev parret med 1,3% rødt farvestof, dyr valgte klart rødt farvestof saccharose prøver (præference indeksværdi tæt på 1), selv om saccharose-koncentrationen var identiske for begge farver. Brug af lige store mængder af fødevarer farvestof resulterede i en let, men statistisk signifikant, præference for saccharose prøver indeholdende blåt farvestof (præference indeksværdi <0,5). De optimale værdier er identificeret her blev fundet at give konsistente resultater over en 10 fold række saccharose koncentrationer i området fra 1 mM til 10 mM. Ikke desto mindre bør de mængder, identificerede her blive overvejet at starte værdier og faktiske Concentrations skal beregnes empirisk for alle forhold, der skal testes, inden du kører eksperimentelle prøver.
Valget af hvilken ligning der skal bruges til beregning af præference indeks er baseret på opsætningen af eksperimentet og tiltrækning versus aversion mål for eksperimentet. Som vist i eksemplet i figur 3, fluer demonstrerede en præference for høje koncentrationer af saccharose versus lavere koncentrationer og denne præference kan vendes ved tilsætning af syre. Ligningen (N blå + 0,5N lilla) / (N blå + N rød + N lilla) fra 3.4.2 blev anvendt til at beregne præference indekset for 3 gentagelser af hver eksperimentel betingelse, da forbindelsen af interesse blev anbragt i det blå farvestof . En præference indeks nær 1 angiver, at når den pågældende får valget mellem 1 mM saccharose (i rødt) og 5 mM saccharose (i blåt), fluerne næsten altid valgte den højere concentr ation. Omvendt blev en anden gruppering af fluer givet de samme muligheder, bortset fra at 10% eddikesyre blev kombineret med mM sucrose mulighed (i blåt) 5. Fluer næsten helt undgås denne situation som set med præference indeks nær 0, i overensstemmelse med kendte reaktioner på høje koncentrationer af syre 7.
Figur 1: smagspræference analyseresultater. Nogle eksempler på variationen af abdominal farvning er vist. Mørkerød indtages (A). Lys rød indtages (B). Mørkeblå indtages (C). Lyseblå indtages (D). Lilla underliv anses når hele farvning lilla (E), eller når forskellige regioner af maven viser dele af rød (pilespids) og særskilte portioner af blå (pil) (F).//www.jove.com/files/ftp_upload/54403/54403fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kontrol for fødevarer farvning effekter. Tilføjelsen af frugtfarve til smagsstoffer bør ikke have nogen effekt på dyrenes smag præference. Variere koncentrationen af blåt farvestof under opretholdelse af en konstant koncentration af rødt farvestof afslørede en optimal kombination af 1,3% rød til 1,0% blå. Dette er angivet med en præference indeks værdi nær 0,5. Værdier er gennemsnittet ± standardafvigelse. * p <0,05, *** p <0,001 fra tosidet t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Den præference smag assay anvendes til tiltrækning og modvilje Drosophila er naturligt tiltrukket af høje saccharose koncentrationer set ud fra en præference indeksværdi nær en, når det gives valget mellem 5 mM saccharose (i blåt) og 1 mM saccharose (i rødt) . Tilføjelse et afskrækningsmiddel forbindelse, såsom syre til saccharose option 5 mM vender dette valg for højt saccharoseindhold som præference indekset falder til nær 0. Værdier er gennemsnittet ± standardafvigelsen. *** p <0,0001 fra tosidet t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en enkel, men effektiv protokol til bestemmelse af smag præference i Drosophila. Versioner af denne analyse anvendes rutinemæssigt i eksperimenter for at bestemme bidrag smagsmæssige receptorer (GRS) til at opfatte de forskellige kvaliteter (bitter, sødt, surt, salt, og Umami) af smag forbindelser. Drosophila genom indeholder ca. 60 gener, der koder 68 identificerede smagsmæssige receptorer ved alternativ splejsning 8,9. Men andre proteiner, såsom ionotrope glutamatreceptorer og TRP kanaler er også blevet påvist, at spille en rolle i smag 10-13. Derfor er der en omfattende mangfoldighed i diskriminerende magt smag i insekter. Derudover, i modsætning til receptorer for lugt, er smagsreceptorer udtrykkes i celler placeret over hele flue. Sensilla indeholdende kombinationer af neuroner udtrykker forskellige smagsreceptorer kan findes på labellum, ben, vinger og ovipositer 14. Som sådan,Drosophila stole på diskrimination smag for et væld af adfærd over ernæring erhvervelse, herunder frieri og æglægning.
Denne smag analyseteknik kan anvendes til at løse mange forskellige eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, da smag, frieri, og æglæggende adfærd er vigtige overvejelser for mange dyr, kan denne protokol være skalerbar til andre vigtige insekter som flåter og myg. En sådan forfremmelse kan vise sig nyttige for smittebærende ledelse og udvikling af pesticider. Desuden kunne dette assay skaleres op til anvendelse i fremadgående genetiske skærme, der har gjort Drosophila sådan et kraftfuldt undersøgelsesværktøj i årtier. Den komplette molekylære forståelse af smag veje er ikke kendt. Identificering afbrydelser i nye gener, der medierer smagspræferencer i denne analyse kan hjælpe med at udfylde vigtige huller i smag kredsløb viden. Da betydningen af prækliniske modeller af sygdom confortsætter for at øge, kan farmakologiske skærme påvirker smagsmæssige signaling mekanismer let udføres ved at tilsætte terapeutiske forbindelser til de smagsstoffer i denne protokol. Derfor er den robuste analyse beskrevet her er et potentielt værdifuldt redskab for mange forskellige forskningsområder.
Der er flere fordele ved at bruge denne protokol til analyse af smag præference. Tidlige versioner af denne fodring paradigme udnyttes kun en enkelt farve til detektion af indtagne smagsstoffer og populære nuværende applikationer gør brug af mikrotiterplader til smagsstof levering 15-18. Petriskålen assay kammer anvendt i denne protokol er en noget almindeligt produkt fundet i laboratorier i øjeblikket ikke parat til at udføre smag analyser. Sandsynligheden for at have en analyse kammer allerede på hånden, derfor hjælper lette afprøvning af nye hypoteser uden tid eller penge investering i nyt udstyr. Også kombinationen af anvendelse af blå og røde farvestoffer er værdifuldt at sikre, at alledyrene tælles i eksperimentet faktisk deltog i eksperimentet. Selv efter 24 timers af sult, kan nogle sunde dyr med klare underliv efter fodring periode ses. Eliminering disse dyr fra beregningen præference indeks er nødvendig for at sikre en nøjagtig måling af befolkningen. Hertil kommer, efter udsultning nogle dyr vil uvægerligt dø, før de er i stand til at deltage i assayet. Mens nogle døde dyr kan tørre ud og kan let fjernes før optælling, kan andre døde dyr være vanskeligere at identificere. Inddragelsen af farvestof i begge valg af fødevarer, sikrer derfor, at kun sunde dyr, der forbruges en fødekilde, betragtes til eksperimentet. Dette reducerer variabiliteten af de resultater, som kan ses i ensfarvede versioner af dette assay. Desuden er anvendelsen af to farver giver også dyr, som lever af begge substrater, der skal identificeres af blandet lilla farvning i deres underliv. Disse dyr are vigtige, fordi de viser, at nogle personer kan have svagere præferencer end hele gruppen. Det skal bemærkes, at vi også har haft succes ved hjælp blå og gule farvestoffer til levnedsmidler for denne voksne smag assay, hvor dyr, der fodres på begge substrater udviser grønne underliv. I den forbindelse har vi fundet, at de gule underliv er noget mindre indlysende at score end røde underliv, men ikke desto mindre nogle forskere måske foretrække denne mulighed. Som med de farver, der anvendes i denne protokol, har brug for en god balance af fødevarer farvestoffer til at være empirisk fast besluttet på at sikre, at farvestoffer ikke har en effekt på dyrenes præference.
Mens denne præference smag assay er god til at bestemme, hvordan en population af fluer reagerer på forskellige smagsstoffer, betyder det ikke give nogen oplysninger om enkelte dyr svar eller faktiske fødeindtagelse. Andre assays, der er almindeligt anvendt til undersøgelse af smag i Drosophila systemer tilbyder bedre opløsning af disse parametre 19 </ Sup>. Specifikt proboscis forlængelse assayet er meget nyttigt til at overvåge den faktiske adfærdsmæssige respons af enkelte fluer til dråber af flydende fødevarer. Ligeledes en kapillær fodring paradigme (CAFE) tilbyder en robust middel til vurdering af mængden af indtaget forbindelser i enkelte fluer, med den ekstra fordel, at analysen er i stand til nemt overvåges over lange perioder. En anden begrænsning af befolkningen baseret smag assay her ikke ligge i den noget subjektive karakter af scoring. Som illustreret i figur 1 er der altid en vis variation i mængden af fødevarer forbruges og / eller udskilles af hvert dyr. Derved intensiteten af den abdominale farve varierer. Det er god praksis for forskere at score dyrene mens blinde til betingelserne i pladen. For at opnå dette, anbefales det at undgå at skrive smagsstof identiteter på pladerne, men i stedet mærke kasserne pladerne anbringes i således at pladerne kan tælles i så unbiased en manner som muligt. Det er også klogt at bekræfte resultater ved at rotere smagsstoffet af interesse for alternative farver i separate eksperimenter. Denne yderligere analyse bør sikre robuste nøjagtigheden af resultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blue Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1 and Red 40, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Cryo/Freezer Boxes w/o Dividers | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E Stereozoom 0.63X-4.0X microscope | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| Petri dish (100 mm x 15 mm) | BD Falcon | 351029 | Reuseable if thoroughly washed and dried |
| Quick-Snap Microtubes | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| Red Food Coloring (Water, Propylene Glycol, FD&C Reds 40 and 3, Propylparaben) | McCormick | N/A | |
| Sucrose | IBI Scientific | IB37160 |
References
- Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
- Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
- Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
- Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
- Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042 (2013).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R.
- Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C.
- Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
