Immunology and Infection

荧光激活细胞分选从小鼠骨髓浆树突状细胞的分离纯化

Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54641

Xiaofeng Liao¹, Melissa Makris², Xin M. Luo¹

¹Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, ²Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

我们使用荧光激活细胞分选来分离浆细胞样树突细胞（PDC）与来自狼疮易感小鼠的骨髓供的pDC的功能研究的高纯度报告的协议。

Protocol

注：MRL / MP-FAS ^LPR狼疮易感小鼠饲养，并保持在以下机构动物护理和使用委员会（IACUC）在弗吉尼亚理工大学（动物福利保障号码要求的无特定病原体设施（MRL / LPR）： A3208-01）。本研究是在严格按照指南中的建议，美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用进行。所有动物实验均根据IACUC协议＃12-062进行。

1.细胞培养基和排序缓冲区

准备完整的细胞培养基（C10），使用RPMI 1640补充有10％胎牛血清，1mM的丙酮酸钠，1％100 MEM非必需氨基酸，10毫米的HEPES，55μM2-巯基乙醇，2mM的L-谷氨酰胺和100U / ml的青霉素 - 链霉素。
制备分拣缓冲液（HBSS满），使用1×Hank氏补充有10mM HEPES平衡盐溶液（HBSS），2.5毫克/毫升牛血清白蛋白，0.05毫米氯化镁₂和0.2 U / ml的DNA酶I.

2.鼠标解剖

准备包含4毫升C10两个6厘米直径的菜肴。将餐具上的冰。
安乐死的CO ₂吸入鼠标。
收获脾肾保持以上ice用C10一个dish，
1. 针按下鼠标与夹层板朝上的肚子。通过喷洒70％的乙醇消毒的机构。
2. 切开皮肤和皮肤从肌肉壁沿着从耻骨联合到颈部腹侧中线下方分开。
3. 切割沿从第一切口到脚踝的后肢皮肤。
4. 针在皮肤背面的两侧，并从第一切口的地方膜片切割沿两侧的肌肉壁。
5. 针肌壁背面的头部的右侧。
6. 定位在小鼠小肠下方和胃旁的右侧脾脏。拿起日的一端Ë脾它从肚子分开。
切都后肢了包括股骨和胫骨，并尽可能去除所有的肌肉成为可能。
1. 切沿骨盆/髋关节用锋利的剪刀脚踝后肢肌肉，尽量避免血管。
2. 通过在骨盆/髋关节和踝/足关节无切削的骨髓内容曝光分开后肢出来。
3. 骨头上的清洁剩余肌肉通过用刀片反复刮伤和在接合点切割的肌肉。
保持骨骼含有冰4毫升C10一个直径6cm培养皿。继续解剖下一个鼠标。

3.脾细胞分离

与反对含4毫升C10，直到没有红条是可见的菜的顶部有70微米的细胞过滤注射器活塞轻轻均质脾脏。
通过一个过滤器添加其他6毫升C10入菜第二则总共10个ml的细胞悬液转移到15毫升锥形管中。
离心锥形管在800×g离心5分钟，4℃。
离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在2ml 1×红细胞（RBC）溶胞缓冲液。孵育在室温下5分钟。
温育后，离心锥形管在800×g离心5分钟，4℃。
离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在1ml C10。放弃任何大的团块（死细胞），并保持管冰上更高版本。
注：如果有许多小团块，用一个70微米的细胞过滤一次过滤细胞悬液。
计数使用自动细胞计数器用锥虫蓝的细胞数。

4.骨髓细胞分离

传送用4ml C10骨头研钵中，加入6毫升C10，使在总10毫升C10的体积。
通过使用AP轻轻敲碎骨头砂浆estle。
用杵释放骨髓成C10轻轻搅拌。
通过一个70微米的细胞滤网转移含有骨髓10毫升C10到50毫升锥形管在冰上。加10毫升的新鲜C10成仍含有骨头砂浆。
注：含吸取骨髓上下几次通过过滤网，如果红色团块可见之前的解决方案。
重复步骤4.2至4.4倍。最后一次洗涤后，骨头应该显示为白色。
离心50ml锥形管中，在800×g离心5分钟，4℃。同时，准备5毫升现成使用密度梯度介质中在RT 15毫升锥形离心管中。
离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在10ml C10。
慢慢层上中的5毫升的密度梯度介质的顶部10 ml的细胞悬液中，并保持两相之间的明确的界面。然后离心15毫升锥形管在1363克在30分钟RT（20°C）以设置的加速度为9和减速设置为0（或制动OFF）。
离心后，小心地取出顶部8ml上述溶液，并收集在界面（单核细胞的层）2 mL萃取棕黄层到一个新的15毫升锥形管中。
基础上加12 1ml冰冷C10到15毫升锥形管含有骨髓单个核细胞，帽和颠倒几次拌匀，然后在800 XG离心管10分钟，4℃。

5.细胞表面染色用于FACS

样品染色
1. 制备抗小鼠CD16 / 32抗体溶液（1至100稀释于HBSS-充分，5微克/毫升的最终浓度）。
2. 在步骤4.10离心后，吸出上清液和重悬细胞沉淀在100μl抗小鼠CD16 / 32的抗体溶液以阻止在单核细胞Fc受体。在冰上孵育10分钟。
3. 制备荧光缀合的抗体混合物（蚂蚁的i-小鼠的CD11c-PE的1点40稀释，抗 - 小鼠的CD11b-APC-CY7 1:80稀释，抗 - 小鼠PDCA-1-FITC 1点40的稀释和抗小鼠B220-V500 1点40稀释在HBSS-满于每个样品100μl的最终体积）制造商推荐的。
  注意：使用前滴定的抗体是非常重要的。
4. 10分钟温育在步骤5.1.2后，加入4ml冰冷的HBSS-充分和离心机在800×g离心5分钟，4℃以除去未结合的抗小鼠CD16 / 32。
5. 离心后，吸出上清液并重新悬浮于100μl荧光缀合的抗体混合物的细胞沉淀。冰上孵育在黑暗中15分钟。
6. 15分钟温育后，加入4ml冰冷的HBSS-充分和离心机在800×g离心5分钟，4℃以除去未结合的荧光标记的抗体。
7. 准备FACS装载溶液（500毫微克/毫升的DAPI在HBSS满）。
8. 在步骤5.1.6离心后，吸出上清液，重悬在500μ细胞沉淀; l FACS负载的解决方案。细胞悬液转移到12×75mm的圆底管（FACS管），并保持在管上在黑暗中冰上直至1小时内分选。
染色赔偿
1. 标签6 FACS管为PE，APC-CY7，FITC，V500，DAPI或不染。以1×10 ^6个细胞/管进入FACS管，和等分脾细胞用4ml的HBSS-充分洗涤，在800×g离心5分钟，4℃。
  注意：使用DNA结合的荧光染料，DAPI，从死细胞区分活细胞。 DAPI可以穿过死细胞的质膜（但不是活细胞），并结合染色体的DNA。
2. 吸上清，悬浮细胞沉淀在100微升HBSS满。
3. 在每一个相应的FACS管中，加入下列抗体之一：抗鼠CD19-PE 1:40稀释，抗小鼠的CD11b-APC-CY7 1:80稀释，抗小鼠PDCA-1-FITC 1:40稀释或所推荐的厂家专业抗小鼠B220-V500 1:40稀释cturer。离开^第 5（DAPI）和^第 6 ^次（未染色的）FACS管，因为它们。通过摇动拌匀，并在冰上所有的流式细胞仪管在黑暗中15分钟。
4. 温育后，在800 xg离心加4ml冰冷的HBSS满到每个管中，离心FACS管5分钟，4℃。
5. 离心后，吸出上清液并重新悬浮于500μl冰冷的细胞沉淀冷HBSS满除了在管标记的DAPI，其再悬浮于500μlFACS加载溶液沉淀。保持所有6管冰在黑暗中，直到排序。

6.排序的细胞分选

注：上仪和软件排序程序的操作是规范与公司提供的详细的说明。简言之，我们用在20psi 100微米的喷嘴，5之间设置靶细胞浓度-在10万元左右毫升，并调整效率到70％或更高（即，冲突保持在30％）。

准备用含100 U / ml青霉素，链霉素500微升FBS /管收集流式细胞仪管。
采用单染色补偿管从步骤5.2调整细胞分选仪的补偿参数。
1. 记录10,000个细胞中未染色的管设置负门对每个荧光强度。
2. 记录10,000个细胞在其他单污点补偿管设置正栅极每个荧光强度。
  注意：软件自动计算补偿参数。
从步骤5.1使用一个样本通过记录3000细胞组分类的细胞群的大门。使用荧光强度为X轴和Y轴曲线图中，栅极靶细胞群体手动作为一组从其他点明显分开的点的参数。
注意：此浇口套是柔性的和任意基于研究人员的要求。如果研究人员期望基于一个或多个标记物纯度较高，将栅极更高根据相应的荧光强度。
装入收集管，并开始排序的靶细胞群。
保持收集管冰排序，直到所有的样品管完成之后。
冰冷的C10添加到收集管达4毫升，帽和反转混合。
离心收集管，在800×g离心5分钟，4℃，然后吸出上清液，留下约200微升与细胞沉淀不变。
加入1ml冰冷的C10至重悬细胞沉淀，并转移所有细胞悬浮到1.5毫升离心管中。
离心机在800×g离心5分钟，4℃1.5 ml管和吸出上清液，留下100微升与细胞沉淀不变。
储存在冰上排序的细胞群，直到使用。

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Representative Results

我们的目的是丰富的骨髓PDC上高纯度，且无其它细胞类型的影响，从年轻和老年学习的PDC对他们产生IFNα能力的功能变化的MRL / lpr狼疮狼疮易感小鼠。使用的第一纯化策略是MCS，其中， 如图1所示，导致只有7.75纯度％的富集。相比于MCS，FACS丰富的pDC，纯度高达96.4％。以确保高纯度，进行一步一步门控策略。正如图2所示，单核细胞进行门控，并通过前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数从碎片分离。利用FSC-宽度（FSC-W）与 FSC高度（FSC-H）和SSC-W与SSC-H，单个细胞进行门控，以避免由聚集体产生的假阳性信号。接活的单细胞被门控的DAPI ^-人口（DAPI ⁺细胞死亡或凋亡）。从活的单细胞，CD11c的⁺ CD11b的^-人口门控，从中B220 ⁺ PDCA-1 ⁺人口进一步门控为PDC。排序后的pDC不仅纯度高，而且功能正常。他们不得不产生IFNα 中在CpG的刺激体外 如图3（重新打印与从我们以前的出版物¹⁷权限的能力。

图1 的pDC排序的通过任一的MCS和FACS法代表流式细胞示出的pDC的百分比（的CD11c ⁺细胞CD11b ^- B220 ⁺ PDCA-1 ^+）附图中的纯度。在分选的细胞由MCS（顶部）和FACS（下部），分别。所述的CD11c ⁺细胞CD11b ^-人口从总活细胞（左），然后的pDC如B220 ⁺ PDCA-1选通 +细胞的表面CD11c ⁺ CD11b的内门^-人口（右）点击此处查看该图的放大版本。

图2. 浇注战略pDC的富集FACS按以下顺序的一步一步设门：单核细胞的单细胞FSC，单细胞SSC，以DAPI ^-活细胞，CD11c的⁺ CD11b的^{- ，}并B220 ⁺ PDCA-1 ⁺作为活的pDC。 pDC的总单体电池是2.95±1.42％;排序的pDC数目是0.88±0.28×10 ^5个每小鼠用回收率在50％左右。（12 MRL / lpr狼疮小鼠中，数据被示为平均值的平均值±标准差在95％CI）。 641fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3.IFNα生产用流式细胞仪分选的pDC排序骨髓的pDC，用A级的CpG处理（ODN1585; 5μM） 在体外 6小时。在图中，“Y”代表年轻，6周大的老鼠; “O”代表年纪大了，16周大的老鼠。 MRL代表MRL老鼠一样健康对照组; LPR代表MRL / lpr狼疮小鼠为狼疮易感小鼠。 IFNα的培养上清中的浓度用ELISA测定。 * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，单向ANOVA。数据显示为平均值±平均值（每组n = 3只小鼠）的标准误差。这个数字是从我们在免疫学杂志出版与转载^。17PLOAD / 54641 / 54641fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl₂	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences