Summary
हम पीडीसी के कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक प्रकार का वृक्ष की आशंका वाले चूहों की अस्थि मज्जा से उच्च शुद्धता के साथ plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं (पीडीसी) को अलग करने की छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट।
Protocol
नोट: MRL / सांसद-फैस LPR (MRL / LPR) एक प्रकार का वृक्ष की आशंका वाले चूहों नस्ल और एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त सुविधा में वर्जीनिया टेक (पशु कल्याण आश्वासन संख्या संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) की आवश्यकताओं का पालन करने में बनाए रखा गया: A3208-01)। इस अध्ययन की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों की प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार बाहर किया गया था। सभी पशु प्रयोगों के तहत IACUC प्रोटोकॉल # 12-062 आयोजित की गई।
1. सेल संस्कृति माध्यम और छंटनी बफर
- पूरा सेल संस्कृति के माध्यम से (C10) RPMI 1640 का उपयोग कर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 1% 100 सदस्य गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 10 मिमी HEPES, 55 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल, 2 मिमी एल glutamine और साथ पूरक तैयार 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन।
- छँटाई बफर तैयार (HBSS-पूर्ण) 1x हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) 10 मिमी HEPES के साथ पूरक का उपयोग कर, 2.5 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin,0.05 मिमी 2 MgCl और 0.2 यू / एमएल DNase मैं
2. माउस विच्छेदन
- दो 6 सेमी व्यास 4 मिलीलीटर C10 युक्त व्यंजन तैयार करें। बर्फ पर बर्तन रखें।
- सीओ 2 साँस लेना द्वारा माउस euthanize।
- तिल्ली की फसल और बर्फ पर C10 के साथ एक थाली में रख लो।
- पेट विच्छेदन प्लेट पर का सामना करना पड़ के साथ माउस नीचे पिन। 70% इथेनॉल के छिड़काव द्वारा शरीर जीवाणुरहित।
- त्वचा कट और गर्दन को जघन सहवर्धन से उदर midline के साथ नीचे मांसपेशियों दीवार से त्वचा को अलग।
- टखने के लिए पहले से चीरा हिंद अंग के साथ त्वचा कट।
- त्वचा पक्षों पर वापस पिन और पहली चीरा जगह डायाफ्राम से पक्षों के साथ मांसपेशियों की दीवार काट दिया।
- सिर के दाईं ओर मांसपेशियों की दीवार वापस पिन।
- छोटी आंत के नीचे और पेट के बगल में माउस के सही पक्ष पर तिल्ली का पता लगा। वें के एक छोर उठाओई प्लीहा और पेट से अलग।
- दोनों हिंद अंग बाहर कट, फीमर और टिबिया सहित, और जितना संभव हो सभी की मांसपेशियों को हटा दें।
- एक तेज कैंची के साथ टखने के लिए श्रोणि / कूल्हे से हिंद अंग साथ मांसपेशियों कट, रक्त वाहिकाओं से बचने के लिए कोशिश कर रहा है।
- अस्थि मज्जा सामग्री के जोखिम के बिना श्रोणि / कूल्हे और टखने / पैर संयुक्त पर काटने से बाहर अलग हिंद अंग।
- बार-बार एक धार के साथ scratching और संयुक्त अंक पर मांसपेशियों को काटने से हड्डियों पर स्वच्छ शेष मांसपेशियों।
- बर्फ पर 4 मिलीलीटर C10 युक्त एक 6 सेमी डिश में हड्डियों रखें। अगले माउस विदारक करने के लिए आगे बढ़ें।
3. Splenocyte अलगाव
- 4 मिलीलीटर C10 युक्त तक कोई लाल टुकड़े दिखाई दे रहे हैं पकवान के शीर्ष पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के खिलाफ एक सिरिंज सवार के साथ धीरे तिल्ली Homogenize।
- छलनी एक के माध्यम से डिश में अतिरिक्त 6 मिलीलीटर C10 जोड़ेएन डी तो एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए कुल 10 मिलीलीटर सेल निलंबन हस्तांतरण।
- 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र।
- centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला aspirate और 2 मिलीलीटर 1 एक्स लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर में सेल गोली resuspend। 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र।
- centrifugation के बाद, aspirate सतह पर तैरनेवाला और 1 मिलीलीटर C10 में सेल गोली resuspend। किसी भी बड़े गुच्छों (मृत कोशिकाओं) त्यागें और बाद के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें।
नोट: कई छोटे गुच्छों देखते हैं, तो एक बार सेल निलंबन फिल्टर करने के लिए एक 70 माइक्रोन सेल झरनी का उपयोग करें। - एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग trypan नीले रंग के साथ सेल संख्या की गणना।
4. अस्थि मज्जा सेल अलगाव
- एक मोर्टार में 4 मिलीलीटर C10 के साथ हड्डियों स्थानांतरण और कुल 10 मिलीलीटर C10 की एक मात्रा बनाने के लिए 6 मिलीलीटर C10 जोड़ें।
- एपी का उपयोग करके मोर्टार में धीरे हड्डियों क्रैकestle।
- मूसल C10 में अस्थि मज्जा को रिहा करने के साथ धीरे हिलाओ।
- एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अस्थि मज्जा से युक्त 10 मिलीलीटर C10 स्थानांतरण। अभी भी हड्डियों से युक्त मोर्टार में 10 मिलीलीटर ताजा C10 जोड़ें।
नोट: पिपेट समाधान झरनी के माध्यम से गुजर रहा है, तो लाल गुच्छों दिखाई दे रहे हैं इससे पहले कि अस्थि मज्जा ऊपर और नीचे कई बार युक्त। - दो बार दोहराएँ 4.4 करने के लिए 4.2 कदम। पिछले धोने के बाद, हड्डियों सफेद दिखाई देनी चाहिए।
- 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र। इस बीच, 5 मिलीलीटर आरटी पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में तैयार करने के लिए उपयोग घनत्व ढाल मध्यम तैयार करते हैं।
- centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला aspirate और 10 मिलीलीटर C10 में सेल गोली resuspend।
- धीरे-धीरे 5 मिलीलीटर घनत्व ढाल माध्यम की चोटी पर 10 मिलीलीटर सेल निलंबन परत, दो चरणों के बीच स्पष्ट इंटरफेस को बनाए रखने। फिर 30 मिनट के लिए 1,363 ग्राम में 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्रआर टी (20 डिग्री सेल्सियस) 9 के रूप में त्वरण सेट और मंदी के रूप में 0 (या ब्रेक से) सेट के साथ।
- centrifugation के बाद, ध्यान से शीर्ष 8 मिलीलीटर समाधान निकालने और एक नया 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में इंटरफेस (mononuclear कोशिकाओं की एक परत) पर 2 मिलीलीटर बफी कोट इकट्ठा।
- 15 मिलीलीटर अस्थि मज्जा कोशिकाओं mononuclear, टोपी युक्त शंक्वाकार ट्यूब 12 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे C10 जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से, फिर 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र के लिए कई बार पलटना।
FACS के लिए 5. सेल सतह धुंधला
- नमूना धुंधला
- विरोधी माउस CD16 / 32 एंटीबॉडी समाधान (में 1 से 100 कमजोर पड़ने HBSS-भरा, 5 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) तैयार करें।
- कदम 4.10 में centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला aspirate और mononuclear कोशिकाओं पर एफसी रिसेप्टर को ब्लॉक करने के लिए 100 μl विरोधी माउस CD16 / 32 एंटीबॉडी समाधान में सेल गोली resuspend। 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- प्रतिदीप्ति संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें (चींटीमैं माउस CD11c पीई 01:40 कमजोर पड़ने, विरोधी माउस CD11b एपीसी-CY7 1:80 कमजोर पड़ने, विरोधी माउस PDCA-1-FITC 1:40 कमजोर पड़ने और विरोधी माउस B220-V500 HBSS- में 1:40 कमजोर पड़ने पूर्ण रूप नमूना प्रति 100 μl अंतिम मात्रा) पर निर्माता से सिफारिश की।
नोट: यह प्रयोग करने से पहले एंटीबॉडी titrate करने के लिए महत्वपूर्ण है। - कदम 5.1.2 में 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, अपार विरोधी माउस CD16 / 32 को हटाने के लिए 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर 4 मिलीलीटर बर्फ ठंड HBSS-भरा और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
- centrifugation के बाद, aspirate सतह पर तैरनेवाला और 100 μl प्रतिदीप्ति संयुग्मित एंटीबॉडी मिश्रण में सेल गोली resuspend। अंधेरे में 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
- बाद में 15 मिनट ऊष्मायन, अपार प्रतिदीप्ति संयुग्मित एंटीबॉडी को दूर करने के लिए 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर 4 मिलीलीटर बर्फ ठंड HBSS-भरा और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें।
- FACS लोड हो रहा है समाधान (500 एनजी / एमएल HBSS-पूर्ण में DAPI) तैयार करें।
- कदम 5.1.6 में centrifugation के बाद, aspirate सतह पर तैरनेवाला और 500 μ में सेल गोली resuspendएल FACS लोड हो रहा है समाधान। एक 12 x 75 मिमी दौर नीचे ट्यूब (FACS ट्यूब) में सेल निलंबन स्थानांतरण और 1 घंटा के भीतर छँटाई जब तक अंधेरे में बर्फ पर ट्यूब रखें।
- मुआवजे के लिए धुंधला
- लेबल 6 FACS पीई, एपीसी-CY7, FITC, V500, DAPI या अस्थिर रूप में ट्यूबों। 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / FACS ट्यूबों में ट्यूब, और कम से विभाज्य splenocytes 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर 4 मिलीलीटर HBSS भरा से धो लें।
नोट: उपयोग डीएनए बाध्यकारी प्रतिदीप्ति डाई, DAPI, मृत कोशिकाओं से जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए। DAPI मृत कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली (नहीं बल्कि जीवित कोशिकाओं के) और बाँध गुणसूत्र डीएनए के माध्यम से पारित कर सकते हैं। - सतह पर तैरनेवाला Aspirate और 100 μl HBSS-पूर्ण में सेल गोली resuspend।
- विरोधी माउस CD19 पीई 01:40 कमजोर पड़ने, विरोधी माउस CD11b एपीसी-CY7 1:80 कमजोर पड़ने, विरोधी माउस PDCA-1-FITC 1:40 कमजोर पड़ने या: प्रत्येक इसी FACS ट्यूब में, निम्न एंटीबॉडी का एक जोड़ विरोधी माउस B220-V500 01:40 कमजोर पड़ने के रूप में विनिर्माण द्वारा की सिफारिश कीcturer। छोड़ दो 5 वीं (DAPI) और 6 वीं (अस्थिर) FACS ट्यूबों के रूप में वे कर रहे हैं। झटकों से अच्छी तरह मिक्स और 15 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर सभी FACS ट्यूबों सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद, 4 मिलीलीटर बर्फ ठंड HBSS भरा प्रत्येक ट्यूब और अपकेंद्रित्र में FACS ट्यूबों 800 XG पर 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए जोड़ें।
- centrifugation के बाद, aspirate सतह पर तैरनेवाला और 500 μl बर्फ में सेल गोली ट्यूब लेबल DAPI, जो 500 μl FACS लोड हो रहा है समाधान में resuspended है में गोली के अलावा ठंड HBSS भरा resuspend। छँटाई जब तक अंधेरे में बर्फ पर सभी 6 नलियों रखते हुए।
- लेबल 6 FACS पीई, एपीसी-CY7, FITC, V500, DAPI या अस्थिर रूप में ट्यूबों। 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / FACS ट्यूबों में ट्यूब, और कम से विभाज्य splenocytes 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर 4 मिलीलीटर HBSS भरा से धो लें।
6. सेल सॉर्टर पर छंटनी
नोट: कोशिकामापी और सॉफ्टवेयर पर प्रक्रिया छँटाई का ऑपरेशन कंपनी द्वारा प्रदान की एक विस्तृत निर्देश के साथ मानकीकृत है। संक्षेप में, हम 20 साई से कम 100 माइक्रोन नोक के बीच 5 लक्ष्य सेल एकाग्रता सेट का उपयोग करें - 10 लाख मिलीलीटर प्रति, और 70% या अधिक करने के लिए दक्षता समायोजित (यानी, संघर्ष 30 के तहत रखा%)।
- 500 μl FBS / ट्यूब 100 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त संग्रह FACS ट्यूबों तैयार करें।
- कदम 5.2 से एकल दाग मुआवजा ट्यूब का उपयोग सेल सॉर्टर का मुआवजा मापदंडों को समायोजित करें।
- प्रत्येक फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए नकारात्मक गेट स्थापित करने के लिए बेदाग ट्यूब में 10,000 कोशिकाओं रिकॉर्ड।
- प्रत्येक फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए सकारात्मक गेट स्थापित करने के लिए अन्य एकल दाग मुआवजा ट्यूबों में 10,000 कोशिकाओं रिकॉर्ड।
ध्यान दें: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से मुआवजे के मानकों को खरीदते हैं।
- 3,000 कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के अनुसार क्रमबद्ध सेल आबादी के द्वार स्थापित करने के लिए 5.1 कदम से एक नमूना का प्रयोग करें। एक्स और वाई अक्ष ग्राफ, गेट लक्ष्य सेल की आबादी मैन्युअल डॉट्स जाहिरा तौर पर अन्य डॉट्स से अलग कर के एक समूह के रूप में के मापदंडों के रूप में फ्लोरोसेंट तीव्रता का उपयोग करना।
नोट: इस gating सेट शोधकर्ताओं की आवश्यकताओं के आधार पर लचीला और मनमाना है। शोधकर्ताओं ने एक या एक से अधिक मार्करों के आधार पर उच्च शुद्धता की उम्मीद है, फाटक के लिए कदमउच्च इसी फ्लोरोसेंट तीव्रता के आधार पर। - एक संग्रह ट्यूब लोड और लक्ष्य सेल की आबादी सुलझाने के लिए शुरू करते हैं।
- जब तक सभी नमूना ट्यूबों किया जाता है छंटाई के बाद बर्फ पर संग्रह ट्यूब रखें।
- 4 मिलीलीटर, टोपी के लिए ऊपर संग्रह ट्यूब के लिए बर्फ के ठंडे C10 जोड़ें और मिश्रण करने के लिए पलटना।
- 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र संग्रह ट्यूब, और फिर सतह पर तैरनेवाला aspirate, अछूता सेल गोली के साथ लगभग 200 μl छोड़ने।
- 1 मिलीलीटर बर्फ के ठंडे C10 सेल गोली resuspend और एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी सेल निलंबन हस्तांतरण करने के लिए जोड़ें।
- अपकेंद्रित्र 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 800 XG पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और सतह पर तैरनेवाला aspirate, सेल गोली अछूता के साथ 100 μl छोड़ने।
- उपयोग करें जब तक बर्फ पर हल सेल आबादी स्टोर।
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Representative Results
हम उच्च शुद्धता के साथ अस्थि मज्जा पीडीसी को समृद्ध करने के उद्देश्य से, और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के प्रभाव, दोनों जवान और बूढ़े उनकी IFNα उत्पादन करने की क्षमता के बारे में पीडीसी के कार्यात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए उम्र के MRL / LPR एक प्रकार का वृक्ष की आशंका वाले चूहों से बिना। पहले शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया रणनीति एमसीएस, जो, चित्रा 1 शो के रूप में, संवर्धन के बाद ही 7.75% शुद्धता के लिए नेतृत्व किया था। एमसीएस की तुलना में, FACS 96.4% के रूप में उच्च शुद्धता के साथ पीडीसी समृद्ध। उच्च शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए एक कदम-दर-कदम gating रणनीति प्रदर्शन किया गया था। चित्रा 2 में दिखाया गया है, mononuclear कोशिकाओं gated और आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) के मापदंडों द्वारा मलबे से अलग हो गए थे। एफएससी-चौड़ाई (एफएससी-W) बनाम FSC-ऊंचाई (एफएससी-एच) और एसएससी-W बनाम एसएससी-एच का प्रयोग, एकल कक्षों समुच्चय द्वारा उत्पादित झूठी सकारात्मक संकेतों से बचने के लिए gated थे। लाइव एकल कक्षों के रूप में तो DAPI gated थे - जनसंख्या (DAPI + कोशिकाओं मर चुके हैं या apoptotic)।लाइव एकल कक्षों से, CD11c + CD11b - जनसंख्या गेटेड गया था, जिसमें से B220 + PDCA -1 + आबादी आगे पीडीसी के रूप में gated था। हल किया पीडीसी उच्च शुद्धता की लेकिन यह भी कार्यात्मक सामान्य ही नहीं थे। वे के रूप में चित्रा 3 (हमारे पिछले प्रकाशन 17 से अनुमति के साथ फिर से प्रिंट में दिखाया गया सीपीजी उत्तेजना पर इन विट्रो में IFNα का उत्पादन करने की क्षमता थी।
चित्रा 1. या तो एमसीएस और FACS विधि पीडीसी का प्रतिशत (CD11c + CD11b - B220 + PDCA -1 +) दिखा आंकड़े cytometry प्रतिनिधि प्रवाह के माध्यम से पीडीसी छाँटे की पवित्रता। हल कोशिकाओं में एमसीएस (ऊपर) और FACS (नीचे) से, क्रमशः। CD11c + CD11b - जनसंख्या के रूप में B220 + PDCA -1 कुल जीवित कोशिकाओं (बाएं), और फिर पीडीसी से gated था + कोशिकाओं CD11c + CD11b भीतर gated थे -। जनसंख्या (दाएं) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. FACS द्वारा पीडीसी संवर्धन के लिए gating रणनीति निम्न क्रम में एक कदम-दर-कदम gating रणनीति:। एकल कक्षों एफएससी, एकल कक्षों के लिए एसएससी, DAPI करने के लिए कोशिकाओं mononuclear - जीवित कोशिकाओं, CD11c + CD11b के लिए - और करने के लिए B220 + PDCA -1 + लाइव पीडीसी के रूप में। कुल एकल कक्षों में पीडीसी 2.95 ± 1.42% है; हल किया पीडीसी नंबर एक वसूली दर 50% के आसपास के साथ है 0.88 ± 0.28 x 10 5 माउस प्रति। (एन = 12 MRL / चूहों LPR, डेटा मतलब ± एसडी 95% में मतलब की सीआई के रूप में दिखाया जाता है)। 641fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
। इन विट्रो में 6 घंटे के लिए, चित्रा 3. IFNα उत्पादन FACS हल पीडीसी के अनुसार क्रमबद्ध अस्थि मज्जा पीडीसी वर्ग एक सीपीजी साथ इलाज किया गया (5 माइक्रोन के ODN1585)। चित्र में, "वाई" छोटी, 6 सप्ताह पुराने चूहों के लिए खड़ा है; "ओ" पुराने, 16 सप्ताह पुराने चूहों के लिए खड़ा है। MRL MRL चूहों के रूप में स्वस्थ चूहों पर नियंत्रण के लिए खड़ा है; LPR एक प्रकार का वृक्ष की आशंका वाले चूहों के रूप में MRL / LPR चूहों के लिए खड़ा है। संस्कृति सतह पर तैरनेवाला में IFNα की एकाग्रता एलिसा के साथ मापा गया था। * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001, एक तरह से एनोवा। डेटा के रूप में मतलब ± मतलब (एन = 3 समूह के प्रति चूहों) की मानक त्रुटि दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा अनुमति के साथ इम्यूनोलॉजी के जर्नल में हमारे प्रकाशन से reproduced है। 17पलोड करें / 54641 / 54641fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
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