Summary
Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.
Protocol
HINWEIS: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) Lupus anfällige Mäuse wurden in einem spezifischen Pathogen freien Anlage entsprechend den Anforderungen des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Virginia Tech (Animal Welfare Assurance Anzahl gezüchtet und gepflegt: A3208-01). Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tierversuche wurden unter IACUC Protokoll # 12-062 durchgeführt.
1. Zellkulturmedium und Sortierpuffer
- Bereiten komplette Zellkulturmedium (C10) unter Verwendung von RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 1 mM Natriumpyruvat, 1% 100 MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 10 mM HEPES, 55 uM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
- Bereiten Sortierpuffer (HBSS-full) unter Verwendung von 1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), supplementiert mit 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml Rinderserumalbumin,0,05 mM MgCl 2 und 0,2 U / ml DNase I.
2. Maus Dissection
- Bereiten Sie zwei 6-cm Durchmesser Schalen mit 4 ml C10. Die Schalen werden auf Eis.
- Euthanize die Maus durch CO 2 Inhalation.
- Ernten Sie die Milz und halten Sie sie in eine Schüssel mit C10 auf dem Eis.
- Pin der Maus mit dem Bauch nach unten nach oben auf der Dissektion Platte. Sterilisieren Sie den Körper 70% Ethanol durch Sprühen.
- Schneiden Sie die Haut und trennen Sie die Haut von der Muskelwand unterhalb entlang der ventralen Mittellinie von der Symphyse bis zum Hals.
- Schneiden Sie die Haut an der hinteren Gliedmaßen vom ersten Schnitt bis zum Knöchel.
- Pin der Haut zurück an den Seiten und schneiden Sie die Muskelwand entlang der Seiten von der ersten Einschnitt statt abblendet.
- Pin der Muskelwand auf der rechten Seite des Kopfes zurück.
- Lokalisieren der Milz auf der rechten Seite der Maus unter dem Dünndarm und neben dem Magen. Pick-up ein Ende the Milz und es aus dem Magen zu trennen.
- Schneiden Sie die beiden hinteren Extremitäten, einschließlich Femur und Tibia, und entfernen Sie alle Muskeln so viel wie möglich.
- Schneiden Sie die Muskeln entlang der hinteren Gliedmaßen aus dem Becken / Hüftgelenk bis zum Knöchel mit einer scharfen Schere, versuchen, die Blutgefäße zu vermeiden.
- Trennen Sie die hinteren Gliedmaßen, indem du den Becken / Hüftgelenk Schneiden und Knöchel / Fußgelenk ohne die Exposition von Knochenmark Inhalte.
- Saubere verbleibenden Muskeln an den Knochen durch wiederholt mit einer Rasierklinge Kratzen und die Muskeln an den Verbindungspunkten schneiden.
- Halten Sie die Knochen in einer 6 cm Schale mit 4 ml C10 auf dem Eis. Fahren Sie die nächste Maus zu sezieren.
3. Splenozyten- Isolation
- Homogenisieren der Milz vorsichtig mit einem Spritzenkolben gegen eine 70 & mgr; m Zellsieb auf der Oberseite der Schale mit 4 ml C10 bis keine roten Stück sichtbar sind.
- Fügen Sie weitere 6 ml C10 in die Schale durch das Sieb einnd dann übertragen die insgesamt 10 ml Zellsuspension auf eine 15 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die konische Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
- Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und Zellpellet in 2 ml 1 x roter Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer. 5 min bei RT inkubiert.
- zentrifugieren der konischen Röhrchen bei 800 xg Nach der Inkubation für 5 min, 4 ° C.
- Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 1 ml C10 resuspendieren. Entsorgen Sie alle großen Klumpen (tote Zellen) und halten Sie die Röhrchen auf Eis für später.
HINWEIS: Wenn es viele kleine Klumpen sind, verwenden Sie eine 70-um-Zelle Sieb einmal die Zellsuspension zu filtern. - Zählen Sie die Zellzahl mit Trypanblau unter Verwendung eines automatisierten Zellzähler.
4. Knochenmarkzellisolierung
- Übertragen Sie die Knochen mit 4 ml C10 in einen Mörser und 6 ml C10 auf ein Volumen von 10 ml C10 insgesamt machen.
- Knacken Sie die Knochen sanft in den Mörtel von ap mitestle.
- Rühren Sie vorsichtig mit dem Stößel des Knochenmarks in C10 zu lösen.
- Übertragen Sie die 10 ml C10 enthält Knochenmark in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis durch einen 70-um-Zelle Sieb. 10 ml frisch C10 in den Mörtel noch die Knochen enthält.
HINWEIS: Pipettieren Sie die Lösung, die auf Knochenmark und nach unten mehrmals, bevor sie durch das Sieb vorbei, wenn roten Klumpen sichtbar sind. - Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.4 zweimal. Nach der letzten Waschung sollten die Knochen weiß erscheinen.
- Zentrifugation der 50 ml konischen Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C. Inzwischen bereiten 5 ml ready-to-use-Dichtegradienten-Medium in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen bei RT.
- Nach dem Zentrifugieren der Überstand absaugen und das Zellpellet in 10 ml C10 resuspendieren.
- die 10 ml Zellsuspension auf dem 5 ml Dichtegradientenmedium, die Aufrechterhaltung klare Schnittstelle zwischen den beiden Phasen langsam die Schicht. zentrifugieren dann den 15 ml konischen Röhrchen bei 1.363 g für 30 min beiRT (20 ° C) mit einer Beschleunigung Satz als 9 und Verzögerung eingestellt als 0 (oder Bremse AUS).
- die Top 8 ml Lösung sorgfältig und sammeln Sie die 2 ml Leukozytenmanschette an der Schnittstelle (eine Schicht aus einkernigen Zellen) in eine neue 15 ml konischen Röhrchen Nach der Zentrifugation zu entfernen.
- In 12 ml eiskaltem C10 zu den 15 ml konischen Röhrchen mit einkernigen Zellen des Knochenmarks, Kappe und mehrmals umdrehen gut zu mischen, dann zentrifugiert werden die Röhrchen bei 800 g für 10 min, 4 ° C.
5. Zeiloberflächenfärbung für FACS
- Probenfärbung
- Bereiten anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung (1 bis 100 Verdünnung in HBSS-voll, 5 ug / ml Endkonzentration).
- Nach der Zentrifugation in Schritt 4.10, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 100 ul anti-Maus-CD16 / 32-Antikörperlösung resuspendieren Fc-Rezeptor auf den mononukleären Zellen zu blockieren. Inkubieren auf Eis für 10 min.
- Bereiten Fluoreszenz-konjugiertes Antikörpermischung (anti-Maus CD11c-PE Verdünnung von 1:40, Anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 und anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40 in HBSS- voll, wie bei 100 & mgr; l Endvolumen pro Probe vom Hersteller empfohlen).
HINWEIS: Es ist wichtig, Antikörper vor dem Gebrauch zu titrieren. - Nach 10 min Inkubation in Schritt 5.1.2, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundenen Anti-Maus-CD16 / 32 zu entfernen.
- Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 100 ul fluoreszenz konjugierten Antikörpermischung. Inkubieren auf Eis für 15 min im Dunkeln.
- Nach 15 min Inkubation, 4 ml eiskaltem HBSS voll und Zentrifuge bei 800 xg für 5 min, 4 ° C ungebundene Fluoreszenz-konjugierte Antikörper zu entfernen.
- Bereiten Sie FACS Ladelösung (500 ng / ml DAPI in HBSS-voll).
- Nach der Zentrifugation in Schritt 5.1.6, der Überstand absaugen und das Zellpellet in 500 μ resuspendieren; L FACS Beladungslösung. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 12 x 75 mm Rundbodenrohr (FACS-Röhrchen) und halten Sie das Rohr auf Eis im Dunkeln innerhalb von 1 Stunde bis zu sortieren.
- Das Anfärben zur Kompensation
- Label-6 FACS-Röhrchen wie PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI oder ungefärbt. Aliquotieren Splenozyten bei 1 x 10 6 Zellen / Röhrchen in die FACS - Röhrchen und waschen mit 4 ml HBSS-Voll bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
HINWEIS: Die Verwendung DNA-bindenden Fluoreszenzfarbstoff, DAPI, lebende Zellen von toten Zellen zu unterscheiden. DAPI kann die Plasmamembran von toten Zellen durchlaufen (aber nicht von lebenden Zellen) und binden Chromosom DNA. - Den Überstand aspirieren und Zellpellet in 100 ul HBSS-voll.
- In jedes Röhrchen FACS entspricht, fügen Sie eine der folgenden Antikörper: anti-Maus-CD19-PE Verdünnung von 1:40, anti-Maus-CD11b-APC-CY7 1:80 Verdünnung, anti-Maus-PDCA-1-FITC Verdünnung von 1:40 oder Anti-Maus-B220-V500 Verdünnung von 1:40, wie durch die manufa empfohlencturer. Lassen Sie das 5. (DAPI) und 6. (ungefärbten) FACS - Röhrchen , wie sie sind. Gut mischen durch Schütteln und Inkubation alle FACS-Röhrchen auf Eis im Dunkeln für 15 min.
- Nach der Inkubation 4 ml eiskaltem HBSS voll in jedes Rohr und Zentrifuge die FACS-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
- Nach Zentrifugation absaugen Überstand und Zellpellet in 500 ul eiskaltem HBSS-full Ausnahme des Pellets in dem Rohr DAPI markiert, die in 500 & mgr; l FACS Beladungslösung resuspendiert. Halten Sie alle 6 Röhrchen auf Eis im Dunkeln bis zu sortieren.
- Label-6 FACS-Röhrchen wie PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI oder ungefärbt. Aliquotieren Splenozyten bei 1 x 10 6 Zellen / Röhrchen in die FACS - Röhrchen und waschen mit 4 ml HBSS-Voll bei 800 g für 5 min, 4 ° C.
6. Sortierung auf dem Cell Sorter
HINWEIS: Der Betrieb auf dem Zytometer Verfahren Sortieren und Software wird mit einer ausführlichen Belehrung durch die Firma standardisiert. Kurz gesagt, verwenden wir bei 20 psi 100 Mikron Düse, Konzentration eingestellt Zielzelle zwischen 5-10000000 pro ml, und die Effizienz auf 70% einstellen oder höher (dh gehalten Konflikte unter 30%).
- Bereiten Sammlung FACS-Röhrchen mit 500 & mgr; l FBS / Röhrchen, die 100 U / ml Penicillin-Streptomycin.
- Stellen Sie Kompensationsparameter des Zellsortierer Einzelfleckenkompensations Rohre aus Schritt 5.2 verwendet wird.
- Nehmen 10.000 Zellen in ungefärbten Röhre für jede Fluoreszenzintensität negative Gate einzustellen.
- Nehmen 10.000 Zellen in anderen Single-Fleckenkompensations Röhrchen für jede Fluoreszenzintensität positive Gate einzustellen.
HINWEIS: Die Software berechnet automatisch die Kompensationsparameter.
- Verwenden Sie eine Probe aus Schritt 5.1 die Tore der sortierten Zellpopulationen zu setzen, indem 3.000 Zellen aufnehmen. Verwendung von Fluoreszenzintensität als Parameter X und Y-Achsen-Diagramm, Gate- Zielzellpopulation manuell als Gruppe von Punkten offenbar von anderen Punkten getrennt werden.
HINWEIS: Diese Gating-Set ist flexibel und willkürlich basierend auf den Anforderungen der Forscher. Wenn Forscher eine höhere Reinheit erwarten basierend auf einem oder mehreren Markern, bewegen Sie das Torbasierend höher auf der entsprechenden Fluoreszenzintensität. - Laden Sie ein Sammelrohr und starten Sie die Zielzellpopulation zu sortieren.
- Halten Sie das Sammelröhrchen auf Eis nach dem Sortieren, bis alle Probenröhrchen fertig sind.
- In eiskalter C10 zum Sammelrohr bis zu 4 ml, Kappe und umkehren zu mischen.
- Zentrifugieren Sie die Sammelröhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C, und dann den Überstand aspirieren, so dass etwa 200 & mgr; l mit Zellpellet unberührt.
- 1 ml eiskaltem C10, um das Zellpellet zu resuspendieren und übertragen alle Zellsuspension in ein 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie die 1,5-ml-Röhrchen bei 800 g für 5 min, 4 ° C und den Überstand aspirieren, so dass 100 & mgr; l mit dem Zellpellet unberührt.
- Speichern Sie die sortierten Zellpopulationen auf Eis bis zum Gebrauch.
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Representative Results
Wir wollten Knochenmark pDC- mit hoher Reinheit und ohne den Einfluss von anderen Zelltypen, von MRL / lpr Lupus anfällige Mäuse von jung und alt Alter zu bereichern die funktionelle Veränderungen der pDC- in Bezug auf ihre Fähigkeit zu untersuchen IFN alpha zu produzieren. Die erste Reinigungsstrategie verwendete MCS, die, wie Figur 1 zeigt, um nach der Anreicherung nur 7,75% Reinheit führte. Im Vergleich zu MCS, angereichert FACS pDC- mit Reinheit so hoch wie 96,4%. Um eine hohe Reinheit zu gewährleisten, ein Schritt-für-Schritt-Gating-Strategie wurde durchgeführt. Wie in Figur 2 gezeigt, wurden mononukleäre Zellen aus gated und Debris durch Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Parameter getrennt. Mit FSC-Breite (FSC-W) gegen FSC-Höhe (FSC-H) und SSC-W vs. SSC-H wurden einzelne Zellen gated die falsch positiven Signale , die durch Aggregate produziert zu vermeiden. Live - Einzelzellen wurden dann gated als DAPI - Bevölkerung (DAPI + Zellen sind tot oder apoptotischen).Von Live - Einzelzellen, CD11c + CD11b - Bevölkerung wurde gated, von der B220 + PDCA-1 + Bevölkerung weiter als pDC- gated wurde. Die sortierte pDC- waren nicht nur von hoher Reinheit, sondern auch funktionell normal. Sie hatten die Fähigkeit , IFN alpha in vitro auf CpG - Stimulation zu erzeugen , wie in Abbildung 3 (Re-Print mit freundlicher Genehmigung von unserer früheren Veröffentlichung 17 gezeigt.
Abbildung 1. Die Reinheit des pDC- Sortiert entweder über MCS und FACS - Methode Repräsentative Durchflusszytometrie Zahlen den Prozentsatz der pDC- (CD11c + CD11b - B220 + PDCA-1 +) zeigt. In sortierten Zellen von MCS (oben) und FACS (unten), beziehungsweise. Die CD11c + CD11b - Bevölkerung wurde aus der Gesamt lebenden Zellen (links) gated, und dann pDC- als B220 + PDCA-1 + Zellen innerhalb der CD11c + CD11b gated wurden -. Bevölkerung (rechts) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Gating - Strategie für pDC- Anreicherung von FACS Eine Schritt- für -Schritt - Gating - Strategie in der folgenden Reihenfolge:. Einkernigen Zellen auf einzelne Zellen FSC, auf einzelne Zellen SSC, zu DAPI - lebenden Zellen zu CD11c + CD11b - und zu B220 + PDCA-1 + als Live - pDC-. pDC- insgesamt einzelnen Zellen beträgt 2,95 ± 1,42%; pDC- sortiert Zahl beträgt 0,88 ± 0,28 x 10 5 pro Maus mit einer Rückgewinnungsrate um 50%. (N = 12 MRL / lpr-Mäuse, werden die Daten dargestellt als Mittelwert ± SD in 95% CI des Mittelwerts). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3. IFN alpha - Produktion durch FACS-sortierten pDC- Sortiert Knochenmark pDC- wurden mit Klasse - A - CpG behandelt (ODN1585; 5 & mgr; M) für 6 Stunden in vitro. In der Figur ist "y" steht für jüngere, 6 Wochen alten Mäusen; "O" steht für ältere, 16 Wochen alten Mäusen. MRL steht für MRL-Mäuse als gesunde Kontrollmäuse; lpr steht für MRL / lpr-Mäusen als Lupus anfällige Mäuse. Die Konzentration von IFN & agr; in dem Kulturüberstand wurde mit ELISA gemessen. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, one-way ANOVA. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (n = 3 Mäuse pro Gruppe) angegeben. Diese Zahl ergibt sich aus unserer Publikation im Journal of Immunology mit Erlaubnis wiedergegeben. 17pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
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