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Immunology and Infection

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocit�des do rato de Medula Óssea

Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54641
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Relata-se um protocolo de utilização de células activada por fluorescência para isolar células dendríticas plasmocitoides (PDC) com elevado grau de pureza a partir da medula óssea de ratinhos lúpus-propenso para estudos funcionais de PDC.

Protocol

NOTA: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) ratos com lúpus-propensa foram criados e mantidos em uma instalação livre de patógenos específicos seguindo as exigências do Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) no número Virginia Tech (Animal Welfare Assurance: A3208-01). Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. Todos os experimentos com animais foram realizados sob IACUC protocolo número 12-062.

1. celular Meio de Cultura e Tampão Sorting

  1. Prepare meio de cultura celular completo (C10), utilizando meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino, piruvato de sódio 1 mM, 1% 100 de MEM aminoácidos não essenciais, 10 mM de HEPES, 55 uM de 2-mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
  2. Preparar tampão de triagem (HBSS-cheia) usando Solução Salina Equilibrada de Hank 1x (HBSS) suplementada com 10 mM de HEPES, 2,5 mg / ml de albumina de soro bovino,0,05 mM de MgCl 2 e 0,2 U / ml de ADNase I.

2. Rato Dissection

  1. Preparar dois pratos diâmetro de 6 cm contendo 4 ml C10. Coloque os pratos em gelo.
  2. Euthanize o mouse por inalação de CO 2.
  3. Colheita do baço e mantê-lo em um prato com C10 em gelo.
    1. Pin o mouse para baixo com a barriga virada para cima na placa de dissecação. Esteriliza-se o corpo de pulverização 70% de etanol.
    2. Cortar a pele e separar a pele da parede muscular debaixo ao longo da linha mediana ventral a partir da sínfise púbica para o pescoço.
    3. Cortar a pele ao longo do membro posterior a partir da primeira incisão para o tornozelo.
    4. Pin a pele volta sobre os lados e cortar a parede muscular ao longo dos lados a partir do primeiro local de incisão do diafragma.
    5. Pin parede do músculo volta no lado direito da cabeça.
    6. Localize o baço do lado direito do rato debaixo do intestino delgado e ao lado do estômago. Pegue uma extremidade do the baço e separá-lo do estômago.
  4. Cortar ambos os membros posteriores para fora, incluindo o fémur ea tíbia, e remover todos os músculos, tanto quanto possível.
    1. Corte os músculos ao longo do membro posterior do pélvica joint / quadril até o tornozelo com uma tesoura afiada, tentando evitar vasos sanguíneos.
    2. Separar o membro posterior pelo corte no pélvica / articulação do quadril e articulação do tornozelo / pé, sem a exposição do conteúdo da medula óssea.
    3. músculos restantes limpas nos ossos por riscar com uma lâmina de barbear repetidamente e cortando os músculos nos pontos comuns.
  5. Manter os ossos em um prato de 6 cm, que inclua 4 ml C10 em gelo. Proceder para dissecar a próxima mouse.

Isolamento 3. esplen�ito

  1. Homogeneizar o baço suavemente com um êmbolo de seringa de encontro a um filtro de células de 70 mícrons no topo do prato contendo 4 ml C10 até há peças vermelhos são visíveis.
  2. Adicionar adicional C10 6 ml no prato através do filtro umaND depois transferir a suspensão de células total de 10 ml para um tubo de 15 ml.
  3. Centrifuga-se o tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
  4. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de lise de 1 x de glóbulos vermelhos (RBC). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
  5. Após a incubação, centrifugar o tubo cónico a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
  6. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de C10. Descartar qualquer grandes aglomerados (células mortas) e manter o tubo em gelo para mais tarde.
    NOTA: Se há muitas pequenas aglomerações, usar um filtro de células 70 mícrons para filtrar a suspensão de células uma vez.
  7. Contar o número de células com azul de tripano utilizando um contador de células automatizado.

4. Isolamento de medula óssea celular

  1. Transferir os ossos com 4 ml de C10 em um almofariz e ainda 6 ml C10 para perfazer um volume de 10 ml no total C10.
  2. Quebrar os ossos delicadamente na argamassa usando apestle.
  3. Agita-se suavemente com o pilão para libertar a medula óssea em C10.
  4. Transferir as ml C10 10 contendo medula óssea em um tubo cônico de 50 ml no gelo através de um filtro de células 70 mícrons. Adicionar C10 10 ml fresco na argamassa ainda contendo os ossos.
    NOTA: Pipeta a solução contendo medula óssea cima e para baixo várias vezes antes de passar através do filtro se contiver pedaços vermelhos são visíveis.
  5. Repita os passos de 4,2 a 4,4 vezes. Após a última lavagem, os ossos devem aparecer branco.
  6. Centrifuga-se o tubo de 50 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C. Enquanto isso, preparar 5 ml de meio de gradiente de densidade de pronto-a-usar num tubo de centrífuga de 15 mL cónico, à TA.
  7. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de C10.
  8. camada lentamente a suspensão a 10 ml de células no topo do meio de gradiente de densidade de 5 ml, mantendo clara interface entre as duas fases. Em seguida, centrifugar a 15 ml tubo cônico de 1.363 g por 30 min aRT (20 ° C) com o conjunto de aceleração como 9 e desaceleração definido como 0 (ou Brake OFF).
  9. Após centrifugação, remover a parte superior 8 ml de solução cuidadosamente e recolher o revestimento 2 ml de Buffy na interface (uma camada de células mononucleares) para um novo tubo de 15 ml.
  10. Adicionar C10 12 mL de gelo frio para as tubo de 15 ml contendo células mononucleares de medula óssea, tampa e gire várias vezes para misturar bem, em seguida, centrifugar o tubo a 800 xg durante 10 min, 4 ° C.

Manchas na superfície 5. celular para FACS

  1. coloração amostra
    1. Prepare de murganho anti-CD16 / 32 solução de anticorpo (diluição 1 a 100 em HBSS-cheia, 5 ug / ml de concentração final).
    2. Após centrifugação no passo 4.10, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 ul de solução de anticorpo anti-ratinho CD16 / 32 para bloquear o receptor de Fc nas células mononucleares. Incubar em gelo durante 10 min.
    3. Prepare a mistura de anticorpo conjugado com fluorescência (formigadiluição i-rato CD11c-PE 01:40, anti-rato CD11b-APC-CY7 1:80 de diluição, diluição 1:40 anti-rato PDCA-1-FITC e anti-rato B220-V500 diluição 1:40 em HBSS- completo, tal como recomendado pelo fabricante em 100 ul de volume final por amostra).
      NOTA: É importante para titular anticorpos antes do uso.
    4. Após 10 minutos de incubação no passo 5.1.2, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-cheia e centrifugar a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para remover o material não ligado Anti-ratinho de CD16 / 32.
    5. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 mistura de anticorpo conjugado com fluorescência-ul. Incubar em gelo durante 15 min no escuro.
    6. Após 15 min de incubação, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-cheia e centrifugar a 800 xg durante 5 min, 4 ° C para remover os anticorpos não ligados fluorescência conjugado.
    7. Preparar a solução de carregamento de FACS (500 ng / ml de DAPI em HBSS-cheio).
    8. Após centrifugação no passo 5.1.6, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 μ; L FACS solução de carga. Transferir a suspensão de células em um 12 x 75 mm em volta do tubo inferior (tubo de FACS) e manter o tubo em gelo no escuro até triagem dentro de 1 h.
  2. A coloração para compensação
    1. Etiqueta de 6 tubos de FACS como PE, a APC-CY7, FITC, V500, DAPI ou corados. Esplenócitos alíquota a 1 X 10 6 células / tubo para os tubos de FACS, e lava-se com 4 mL de HBSS-completo a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
      NOTA: Use DNA de ligação de corante fluorescente, DAPI, distinguir células vivas a partir de células mortas. DAPI pode passar através da membrana plasmática de células mortas (mas não de células vivas) e ADN se ligam cromossoma.
    2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 100 uL de HBSS-cheia.
    3. Em cada tubo de FACS correspondente, adicionar um dos seguintes anticorpos: CD19-PE anti-ratinho de diluição 1:40, anti-ratinho de diluição 1:80 CD11b-APC-CY7, anti-ratinho PDCA-1-FITC ou diluição 1:40 anti-ratinho B220-V500 diluição 1:40 como recomendado pelo manufacturer. Deixar o 5º (DAPI) e 6º (sem manchas) FACS tubos como elas são. Misture bem, por agitação e incuba-se todos os tubos de FACS em gelo no escuro durante 15 min.
    4. Após a incubação, adicionar 4 ml de HBSS arrefecido em gelo-completo a cada tubo e os tubos de centrífuga de FACS a 800 xg durante 5 min, 4 ° C.
    5. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 500 uL de gelo frio HBSS completa excepto para o sedimento no tubo rotulado DAPI, que é ressuspenso em 500 ul de solução de FACS de carregamento. Manter todos os tubos de 6 em gelo no escuro até triagem.

6. Classificando no Sorter celular

NOTA: A operação de triagem procedimento no citômetro e software é padronizado com instruções detalhadas fornecidas pela empresa. Resumidamente, usamos 100 bocal micron a 20 psi, a concentração de células alvo definido entre 5-10.000.000 por ml, e ajustar a eficiência de 70% ou superior (ou seja, os conflitos mantida sob 30%).

  1. Preparar tubos de recolha de FACS com 500 mL de FBS / tubo contendo 100 U / ml de penicilina-estreptomicina.
  2. Ajustar os parâmetros de compensação do classificador de células utilizando tubos de compensação-mancha única a partir do passo 5.2.
    1. Grave 10.000 células em tubos sem mácula para definir porta negativo para cada intensidade de fluorescência.
    2. Grave 10.000 células em outros tubos de compensação mancha única para definir portão positivo para cada intensidade de fluorescência.
      NOTA: O software calcula automaticamente os parâmetros de compensação.
  3. Use uma amostra a partir do passo 5.1 para definir as portas de populações de células classificadas segundo a gravação 3.000 células. Usando intensidade fluorescente como parâmetros de X e do eixo Y do gráfico, a população de células alvo porta manualmente como um grupo de pontos aparentemente separados dos outros pontos.
    NOTA: Este conjunto gating é flexível e arbitrária com base nos requisitos de pesquisadores. Se os pesquisadores esperam maior pureza com base em um ou mais marcadores, mover o portãomais elevada com base na intensidade de fluorescência correspondente.
  4. Carregar um tubo de recolha e começar a separar a população de células alvo.
  5. Mantenha o tubo de coleta no gelo após a triagem até que todos os tubos de amostras são feitas.
  6. Adicione gelo frio C10 ao tubo de recolha de até 4 ml, tampa e inverta para misturar.
  7. Centrifuga-se o tubo de recolha a 800 xg durante 5 min, 4 ° C, e, em seguida, aspirar o sobrenadante, deixando cerca de 200 ul com sedimento de células intactas.
  8. Adicionar 1 mL de gelo frio C10 para ressuspender a pelete de células e transferir toda a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
  9. Centrifugar o tubo de 1,5 ml a 800 xg durante 5 min, 4 ° C e aspirar o sobrenadante, deixando 100? L com o sedimento de células intactas.
  10. Armazenar as populações de células ordenadas em gelo até à sua utilização.

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Representative Results

Nosso objetivo para enriquecer medula óssea pDC com elevado grau de pureza, e sem a influência de outros tipos de células, a partir de ratos lúpus-propensa MRL / lpr de ambos tenra idade e de idade para estudar as mudanças funcionais do PDC em relação à sua capacidade de produzir IFN. A primeira estratégia de purificação usado foi de MCS, a qual, como mostra a Figura 1, conduziu apenas a 7,75% de pureza, após o enriquecimento. Comparado ao MCS, FACS enriquecido pDC com pureza tão elevado como 96,4%. Para garantir uma elevada pureza, foi realizada uma estratégia gating passo-a-passo. Como mostrado na Figura 2, as células mononucleares foram separadas e fechado de detritos por dispersão frontal (FSC) e parâmetros de dispersão lateral (SSC). Usando FSC-width (FSC-W) vs. FSC-altura (FSC-H) e SSC-W vs. SSC-H, células individuais foram fechado para evitar os sinais positivos falsos produzidos por agregados. Células individuais vivos foram, em seguida, fechado como o DAPI - população (células DAPI + estão mortas ou apoptose).A partir de células individuais ao vivo, CD11c + CD11b - população foi fechado, a partir do qual B220 + PDCA-1 + população foi ainda fechado como PDC. O PDC classificadas não eram apenas de alta pureza, mas também funcionalmente normal. Eles tiveram a capacidade de produzir IFN in vitro após estimulação CpG como mostrado na Figura 3 (Re-print com a permissão da nossa publicação anterior 17.

figura 1
Figura 1. A pureza do PDC Ordenado, quer através de MCS e Método FACS fluxo Representante citometria números que mostram a percentagem de PDC (CD11c + CD11b - B220 + PDCA-1 +). Em células classificadas por MCS (topo) e FACS (em baixo), respectivamente. O CD11c + CD11b - população foi fechado a partir de células totais vivas (à esquerda) e, em seguida pDC como B220 + PDCA-1 Células + foram fechado dentro do CD11c + CD11b -. População (à direita) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Estratégia Gating para pDC Enriquecimento por FACS Uma estratégia gating passo-a-passo na seguinte ordem:. Células mononucleares para células individuais FSC, para células individuais SSC, para DAPI - células vivas, para CD11c + CD11b -, e B220 + PDCA-1 + pDC ao vivo. PDC no células totais individuais é 2,95 ± 1,42%; número pDC classificados é de 0,88 ± 0,28 x 10 5 por ratinho, com uma taxa de recuperação de cerca de 50%. (N = 12 murganhos MRL / lpr, os dados são apresentados como média ± DP de 95% CI da média). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
. Figura 3. IFN Produção pela DCP FACS-ordenadas óssea Ordenado medula pDC foram tratados com classe A CpG (ODN1585; 5? M) durante 6 horas in vitro. Na figura, "y" representa ratos mais jovens, 6 semanas de idade; "O" significa mais velhos, ratos 16 semanas de idade. MRL está para ratos MRL ratos de controlo, saudáveis; lpr está para ratos MRL / lpr como ratos lúpus-propensa. A concentração de IFNa no sobrenadante da cultura foi medida por ELISA. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, ANOVA one-way. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 3 ratos por grupo). Este valor é reproduzido de nossa publicação no Journal of Immunology com permissão 17.pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum HyClone SH30396.03
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine  gibco by life technologies 25030-164
Penicillin-Streptomycin gibco by life technologies 15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution  gibco by life technologies 14175-079
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MgCl2 SIGMA M8266
DNase I SIGMA D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer  eBioscience 00-4300-54
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Ficoll-Paque Plus 
anti-mouse CD19-PE BD Pharmingen 553786
anti-mouse CD11c-PE eBioscience 12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7 BD Pharmingen 557657
anti-mouse PDCA-1-FITC eBioscience 11-3172-81
anti-mouse B220-V500  BD Pharmingen 561226
DAPI invitrogen D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotec 130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer  BD Biosciences 643178
BD FACS Diva version 6 BD Biosciences

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References

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Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (117), e54641, doi:10.3791/54641 (2016).

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