Summary
Vi rapporterer en protokol under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering til isolering plasmacytoide dendritiske celler (PDC) med høj renhed fra knoglemarven af lupus-tilbøjelige mus for funktionelle studier af pDC.
Protocol
BEMÆRK: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / lpr) lupus-tilbøjelige mus blev avlet og holdt i en SPF-facilitet efter kravene i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Virginia Tech (Animal Welfare Assurance-nummer: A3208-01). Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. blev udført Alle eksperimenter dyr under IACUC protokol # 12-062.
1. Cell Culture Medium og sortering Buffer
- Forbered komplet celledyrkningsmedium (C10) under anvendelse af RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1 mM natriumpyruvat, 1% 100 MEM ikke-essentielle aminosyrer, 10 mM Hepes, 55 pM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin-streptomycin.
- Forbered sortering puffer (HBSS-fuld) under anvendelse 1x Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) suppleret med 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml bovint serumalbumin,0,05 mM MgCl2 og 0,2 U / ml DNase I.
2. Mus Dissektion
- Forbered to 6-cm diameter skåle indeholdende 4 ml C10. Placer retterne på is.
- Aflive musen ved CO 2 inhalation.
- Høst milten og holde det i et fad med C10 på is.
- Pin musen ned med maven opad på dissektion plade. Sterilisere kroppen ved sprøjtning 70% ethanol.
- Skære huden og adskille huden fra musklen væggen nedenunder langs den ventrale midterlinjen fra skambenssammenføjning til halsen.
- Skære huden langs bagbenet fra den første indsnit til anklen.
- Pin huden tilbage på siderne og skæres musklen væg langs siderne fra det første indsnit sted at membranen.
- Pin muskelvæggen tilbage på højre side af hovedet.
- Find milten på højre side af musen nedenunder tyndtarmen og ved siden af maven. Saml den ene ende af the milt og adskille den fra maven.
- Skær begge bagben ud, herunder lårben og skinneben, og fjerne alle muskler så meget som muligt.
- Skær musklerne langs bagbenet fra bækken / hofteleddet til anklen med en skarp saks, forsøger at undgå blodkar.
- Adskil bagbenet ud ved at skære i bækken / hofteled og ankel / fod joint uden eksponering af knoglemarv indhold.
- Rene resterende muskler på knoglerne ved at skrabe med et barberblad gentagne gange og skære musklerne ved de fælles punkter.
- Holde knoglerne i en 6 cm skål indeholdende 4 ml C10 på is. Fortsæt til dissekere den næste mus.
3. splenocyt Isolering
- Homogenisere milten forsigtigt med et sprøjtestempel mod en 70-um cellefilter oven på skål indeholdende 4 ml C10, indtil ingen røde stykker er synlige.
- Tilføj yderligere 6 ml C10 i fadet gennem sien ennd derefter overføre det samlede 10 ml cellesuspension til en 15 ml konisk rør.
- Centrifugeres konisk rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 2 ml 1 x røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Efter inkubation centrifugeres konisk rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml C10. Kassér nogen store klumper (døde celler) og holde røret på is til senere.
BEMÆRK: Hvis der er mange små klumper, brug en 70-um celle si at filtrere cellesuspensionen gang. - Tæl celletallet med trypanblåt ved hjælp af en automatiseret celletæller.
4. knoglemarv Cell Isolation
- Overfør knoglerne med 4 ml C10 i en morter, og der tilsættes 6 ml C10 for at gøre et volumen på 10 ml C10 i alt.
- Knæk knoglerne forsigtigt i morteren ved at bruge apestle.
- Rør forsigtigt med pistil til at frigive knoglemarven i C10.
- Overfør 10 ml C10 indeholder knoglemarv ind i en 50 ml konisk rør på is gennem en 70-um celle si. Tilsæt 10 ml frisk C10 i mørtel stadig indeholder knoglerne.
BEMÆRK: Pipette opløsningen indeholdende knoglemarv op og ned flere gange, før passage gennem sien hvis røde klumper er synlige. - Gentag trin fra 4,2 til 4,4 gange. Efter den sidste vask, bør knoglerne fremtræder hvide.
- Centrifugeres 50 ml konisk rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C. Mellemtiden forbereder 5 ml klar-til-brug densitetsgradient-medium i et 15 ml konisk centrifugerør ved stuetemperatur.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml C10.
- lag langsomt 10 ml cellesuspensionen oven på 5 ml densitetsgradient medium, opretholdelse klar grænseflade mellem de to faser. Derefter centrifugeres 15 ml konisk rør ved 1.363 g i 30 minutter vedRT (20 ° C) med acceleration sæt som 9 og deceleration indstillet som 0 (eller Brake OFF).
- Efter centrifugering, fjerne det øverste 8 ml opløsning omhyggeligt og indsamle de 2 ml fibrinlag ved grænsefladen (et lag af mononukleære celler) i en ny 15 ml konisk rør.
- Tilsættes 12 ml iskold C10 til de 15 ml koniske rør indeholdende knoglemarvsceller mononukleære celler, og vend adskillige gange for at blande godt, centrifugeres røret ved 800 xg i 10 min, 4 ° C.
5. Cell Surface Farvning for FACS
- Prøve farvning
- Forbered anti-muse CD16 / 32 antistofopløsning (1 til 100-fortynding i HBSS-fuld, 5 ug / ml slutkoncentration).
- Efter centrifugering i trin 4.10, aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 100 pi anti-muse CD16 / 32 antistofopløsning at blokere Fc-receptor på mononukleære celler. Der inkuberes på is i 10 min.
- Forbered fluorescens-konjugeret antistof blanding (anti-muse CD11-PE 01:40 fortynding, anti-muse CD11-APC-CY7 1:80 fortynding, anti-muse PDCA-1-FITC 1:40 fortynding og anti-muse B220-V500 1:40 fortynding i HBSS- fuld som anbefalet af producenten ved 100 pi slutvolumen per prøve).
BEMÆRK: Det er vigtigt at titrere antistoffer før brug. - Efter 10 minutters inkubation i trin 5.1.2, tilsættes 4 ml iskold HBSS-fuld og der centrifugeres ved 800 xg i 5 min, 4 ° C for at fjerne ubundet anti-muse CD16 / 32.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 100 pi fluorescens-konjugeret antistof blanding. Der inkuberes på is i 15 minutter i mørke.
- Efter 15 minutters inkubation tilsættes 4 ml iskold HBSS-fuld og der centrifugeres ved 800 xg i 5 min, 4 ° C for at fjerne ubundne fluorescens-konjugeret antistoffer.
- Forbered FACS loading-opløsning (500 ng / ml DAPI i HBSS-fuld).
- Efter centrifugering i trin 5.1.6, aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 500 μL FACS loading opløsning. Overfør cellesuspensionen i en 12 x 75 mm rundbundet rør (FACS rør) og holde røret på is i mørke, indtil sortering inden for 1 time.
- Farvning om erstatning
- Label 6 FACS rør som PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI eller ufarvede. Alikvote splenocytter på 1 x 10 6 celler / rør i FACS-rør, og vask med 4 ml HBSS-fuld ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
BEMÆRK: Brug DNA-bindende fluorescens farvestof, DAPI, at skelne levende celler fra døde celler. DAPI kan passere gennem plasmamembranen af døde celler (men ikke af levende celler) og binder kromosom-DNA. - Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten i 100 pi HBSS-fuld.
- I hver tilsvarende FACS rør, tilsæt en af følgende antistoffer: anti-muse CD19-PE 01:40 fortynding anti-muse CD11-APC-CY7 1:80 fortynding anti-muse PDCA-1-FITC 1:40 fortynding eller anti-mus B220-V500 01:40 fortynding som anbefalet af manufacturer. Lad det 5. (DAPI) og 6 th (uplettet) FACS rør, som de er. Bland godt ved rystning og inkuber alle FACS rør på is i mørke i 15 min.
- Efter inkubering tilsættes 4 ml iskold HBSS-fuld i hvert rør og centrifuger FACS rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten og resuspender cellepelleten i 500 pi iskold HBSS-fuld bortset pelleten i røret mærket DAPI, som resuspenderes i 500 pi FACS loading opløsning. Holde alle 6 rør på is i mørke, indtil sortering.
- Label 6 FACS rør som PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI eller ufarvede. Alikvote splenocytter på 1 x 10 6 celler / rør i FACS-rør, og vask med 4 ml HBSS-fuld ved 800 xg i 5 min, 4 ° C.
6. Sortering på Cell Sorter
BEMÆRK: Drift af sortering procedure på cytometret og software er standardiseret med en detaljeret instruktion fra selskabet. Kort fortalt bruger vi 100 micron dyse ved 20 psi, sæt mål cellekoncentrationen mellem 5 til 10.000.000 pr ml, og justere effektiviteten til 70% eller højere (dvs. konflikter holdes under 30%).
- Forbered indsamling FACS rør med 500 pi FBS / rør indeholdende 100 U / ml penicillin-streptomycin.
- Juster kompensation parametre cellesorteringsapparatet anvendes enkelt-pletten kompensation rør fra trin 5.2.
- Optag 10.000 celler i ufarvede rør for at indstille negative gate for hver fluorescensintensitet.
- Optag 10.000 celler i andre single-plet kompensation rør for at indstille positive gate for hver fluorescensintensitet.
BEMÆRK: Softwaren beregner automatisk kompensation parametre.
- Brug en prøve fra trin 5.1 for at indstille porte sorterede cellepopulationer ved at optage 3.000 celler. Brug af fluorescensintensitet som parametre af X og Y-aksen graf, gate målcellepopulation manuelt som en gruppe af prikker tilsyneladende adskilt fra andre prikker.
BEMÆRK: Denne gating sæt er fleksibel og vilkårlig baseret på kravene i forskere. Hvis forskerne forventer højere renhed baseret på en eller flere markører, flytte portenhøjere baseret på den tilsvarende fluorescerende intensitet. - Indlæse en samling rør og begynde at sortere målcellepopulationen.
- Hold opsamlingsrøret på is efter sortering, indtil alle prøverør er færdig.
- Tilføj iskold C10 til samlingen rør op til 4 ml, og vend for at blande.
- Centrifugeres opsamlingsrøret ved 800 xg i 5 min, 4 ° C, og derefter aspireres supernatanten, hvilket efterlader ca. 200 pi med cellepellet uberørt.
- Tilsæt 1 ml iskold C10 at resuspendere cellepelleten og overdrager cellesuspension i et 1,5 ml centrifugerør.
- Centrifuger 1,5 ml rør ved 800 xg i 5 min, 4 ° C og udsuge supernatanten, hvilket efterlader 100 pi med cellepelleten uberørt.
- de sorterede cellepopulationer på is lagre indtil anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi havde til formål at berige knoglemarv pDC med høj renhed, og uden indflydelse af andre celletyper, fra MRL / lpr lupus-tilbøjelige mus af både unge og gamle alder til at studere de funktionelle ændringer PDC for deres evne til at producere IFNa. Den første oprensning anvendte strategi var MCS, der, som fremgår af figur 1, førte til kun 7,75% renhed efter berigelse. I forhold til MCS, FACS beriget pDC med renhed så højt som 96,4%. For at sikre en høj renhed, blev en trin-for-trin gating strategi udføres. Som vist i figur 2, blev mononukleære celler indhegnet og adskilt fra affald ved forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC) parametre. Brug FSC-bredde (FSC-W) vs. FSC-højde (FSC-H) og SSC-W versus SSC-H, blev enkelte celler gated at undgå falske positive signaler produceret af aggregater. Levende enkelte celler blev derefter gated som DAPI - befolkning (DAPI + celler er døde eller apoptotisk).Fra levende enkelte celler, CD11c + CD11b - blev befolkningen gated, hvorfra B220 + PDCA-1 + populationen blev yderligere gated som pDC. Det sorterede pDC var ikke kun med høj renhed, men også funktionelt normale. De havde evnen til at producere IFNa in vitro upon CpG-stimulering som vist i figur 3 (Re-print med tilladelse fra vores tidligere publikation 17.
Figur 1. Renheden af pDC Sorteret gennem enten MCS og FACS Metode repræsentant flowcytometri tal, der viser procentdelen af PDC (CD11c + CD11b - B220 + PDCA-1 +). I sorterede celler ved MCS (øverst) og FACS (nederst), henholdsvis. Den CD11c + CD11 - population blev gated fra totale levende celler (til venstre), og derefter pDC som B220 + PDCA-1 + Celler blev gated i CD11c + CD11b -. Befolkning (til højre) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Gating strategi for pDC berigelse af FACS En trin-for-trin gating strategi i følgende rækkefølge:. Mononukleære celler til enkelte celler FSC, at enkelte celler SSC, til DAPI - levende celler, til CD11c + CD11b - og til B220 + PDCA-1 + som levende pDC. PDC samlede enkeltceller er 2,95 ± 1,42%; ordnet pDC nummer er 0,88 ± 0,28 x 10 5 pr mus med en recovery rate omkring 50%. (N = 12 MRL / lpr mus, er data vist som middelværdi ± SD i 95% CI af middelværdien). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3. IFNa Produktion ved FACS-sorteres pDC Sorteret knoglemarv pDC blev behandlet med klasse A CpG (ODN1585, 5 uM) i 6 timer in vitro. I figuren "y" står for yngre, 6 uger gamle mus; "O" står for ældre, 16 uger gamle mus. MRL står for MRL mus som raske kontrolmus; lpr står for MRL / lpr-mus som lupus-tilbøjelige mus. Koncentrationen af IFNa i kultursupernatanten, blev målt med ELISA. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, en-vejs ANOVA. Data er vist som gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (n = 3 mus pr gruppe). Dette tal er gengivet fra vores publikation i Journal of Immunology med tilladelse. 17pload / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A.
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
- Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
- Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
- Mattanovich, D., Borth, N.
- Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
- Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
- Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
- Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
- Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
- Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
- Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
- Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
- Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
- Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
- Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).
