Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Published: November 4, 2016 doi: 10.3791/54641
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

Summary

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Protocol

LET OP: MRL / Mp-Fas lpr (MRL / LPR) lupus vatbaar voor muizen werden gekweekt en onderhouden in een specifiek pathogeen-vrije faciliteit volgens de eisen van de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op Virginia Tech (Animal Welfare Assurance-nummer: A3208-01). Dit onderzoek is uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health uitgevoerd. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd onder IACUC protocol # 12-062.

1. celkweekmedium en sorteren Buffer

  1. Bereid volledig celkweekmedium (C10) gebruikt RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1 mM natriumpyruvaat, 1% 100 MEM niet-essentiële aminozuren, 10 mM HEPES, 55 pM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine en 100 U / ml penicilline-streptomycine.
  2. Bereid sorteren buffer (HBSS-vol) met behulp 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), aangevuld met 10 mM HEPES, 2,5 mg / ml runderserumalbumine,0,05 mM MgCl2 en 0,2 U / ml DNase I.

2. Mouse Dissection

  1. Bereid twee 6-cm diameter gerechten met 4 ml C10. Leg de gerechten op ijs.
  2. Euthanaseren de muis door CO 2 inhalatie.
  3. Oogst de milt en bewaar het op een schotel met C10 op het ijs.
    1. Speld de muis naar beneden met de buik naar boven gericht op de dissectie plaat. Steriliseer het lichaam door sproeien van 70% ethanol.
    2. Snijd de huid en scheiden de huid van de spier muur onder langs de ventrale middellijn van de symfyse aan de nek.
    3. Snijd de huid langs de achterpoot van het eerste incisie aan de enkel.
    4. Speld de huid weer aan de zijkanten en snijd de spier muur langs de zijkanten van de eerste incisie plaats om middenrif.
    5. Speld de spierwand weer aan de rechterzijde van het hoofd.
    6. Zoek de milt aan de rechterzijde van de muis onder de dunne darm en aan de maag. Pick-up de ene kant van The milt en scheiden van de maag.
  4. Snijd beide achterpoten, onder meer bovenbeen en onderbeen, en verwijder alle spieren zo veel mogelijk.
    1. Snijd de spieren langs de achterpoot van het bekken / heupgewricht aan de enkel met een scherpe schaar, proberen om de bloedvaten te voorkomen.
    2. Scheid de achterste ledematen door te snijden in het bekken / heupgewricht en de enkel / voet joint zonder de blootstelling van de inhoud van het beenmerg.
    3. Schone resterende spieren aan de botten door krassen met een scheermes herhaaldelijk snijden van de spieren aan de gemeenschappelijke punten.
  5. Houd de botten in een 6 cm schaaltje met 4 ml C10 op ijs. Ga verder met het ontleden van de volgende muis.

3. splenocyten Isolation

  1. Homogeniseer de milt voorzichtig met een zuiger tegen een 70-um zeef cel boven het schaaltje met 4 ml C10 totdat er geen rode stukken zijn toegankelijk.
  2. Voeg extra 6 ml C10 in de schaal door de zeef van eennd vervolgens over de totale 10 ml celsuspensie aan een 15 ml conische buis.
  3. Centrifugeer de conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C.
  4. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 2 ml 1 x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  5. Na incubatie gecentrifugeerd conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C.
  6. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml C10. Gooi alle grote klonten (dode cellen) en hou de buis op ijs voor later.
    LET OP: Als er veel kleine groepjes, gebruik maken van een 70-um cel zeef aan de celsuspensie een keer te filteren.
  7. Tel het aantal cellen met trypan blauw met behulp van een geautomatiseerde cel teller.

4. Bone Marrow Cell Isolation

  1. Breng de botten met 4 ml C10 in een vijzel en voeg 6 ml C10 tot een volume van 10 ml in totaal C10 maken.
  2. Crack de botten voorzichtig in de mortel met behulp van apEstle.
  3. Roer voorzichtig met de stamper naar het beenmerg vrij in C10.
  4. Breng de ml C10 10 met beenmerg in een 50 ml conische buis op ijs door een 70-um cel zeef. Voeg 10 ml vers C10 in de mortel nog met de botten.
    LET OP: Pipette de oplossing die het beenmerg en neer meerdere malen voor het passeren van de zeef als rode klonten zichtbaar zijn.
  5. Herhaal stap 4,2-4,4 keer. Na de laatste wasbeurt, moet de botten verschijnen wit.
  6. Centrifugeer de 50 ml conische buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C. Bereid ondertussen 5 ml kant-en-klare dichtheidsgradiënt medium in een 15 ml conische centrifugebuis bij kamertemperatuur.
  7. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml C10.
  8. laag langzaam de 10 ml celsuspensie bovenop de 5 ml medium dichtheidsgradiënt, handhaven duidelijk grensvlak tussen de twee fasen. Centrifugeer de 15 ml conische buis bij 1363 g gedurende 30 minuten bijRT (20 ° C) met versnelling set als 9 en vertraging ingesteld op 0 (of Brake OFF).
  9. Na centrifugeren verwijdert de bovenste 8 ml oplossing voorzichtig en laat de 2 ml buffy coat bij de interface (een laag van mononucleaire cellen) in een nieuwe 15 ml conische buis.
  10. Voeg 12 ml ijskoud C10 de 15 ml conische buis met beenmerg mononucleaire cellen, cap en keer herhaaldelijk goed te mengen, centrifugeer de buis bij 800 xg gedurende 10 min, 4 ° C.

5. celoppervlak kleuring voor FACS

  1. sample kleuring
    1. Bereid anti-muis CD16 / 32 antilichaamoplossing (1 tot 100 verdunning in HBSS vol, 5 ug / ml eindconcentratie).
    2. Na centrifugatie in stap 4,10, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 gl anti-muis CD16 / 32 antilichaamoplossing Fc-receptor op de mononucleaire cellen. Incubeer op ijs gedurende 10 min.
    3. Bereid fluorescentie-geconjugeerd antilichaam mengsel (anti-muis CD11c-PE 1:40 verdunning, anti-muis CD11b-APC-CY7 1:80 verdunning, anti-muis PDCA-1-FITC 1:40 verdunning en anti-muis B220-V500 1:40 verdunning in HBSS- full zoals aanbevolen door de fabrikant aan 100 gl eindvolume per monster).
      NB: Het is belangrijk om antilichamen te titreren voor gebruik.
    4. Na 10 min incubatie in stap 5.1.2, voeg 4 ml ijskoud HBSS vol en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C ongebonden anti-muis CD16 / 32 te verwijderen.
    5. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 ui fluorescentie-geconjugeerd antilichaam mengsel. Incubeer op ijs gedurende 15 minuten in het donker.
    6. Na 15 minuten incubatie wordt 4 ml ijskoud HBSS vol en centrifugeer bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C om ongebonden fluorescentie-geconjugeerde antilichamen te verwijderen.
    7. Bereid FACS laden oplossing (500 ng / ml DAPI in HBSS-vol).
    8. Na centrifugatie in stap 5.1.6, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 μ; L FACS laden oplossing. Breng de celsuspensie in een 12 x 75 mm met ronde bodem buis (FACS buis) en hou de buis op ijs in het donker totdat het sorteren binnen 1 uur.
  2. Kleuring voor compensatie
    1. Label 6 FACS buizen als PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI of ongekleurd. Aliquot splenocyten van 1 x 10 6 cellen / buis in de FACS buizen en wassen met 4 ml HBSS vol bij 800 xg gedurende 5 min, 4 ° C.
      LET OP: Het gebruik van DNA-bindende fluorescentie kleurstof, DAPI, om levende cellen te onderscheiden van dode cellen. DAPI kan passeren de plasmamembraan van dode cellen (maar niet die van levende cellen) en bind chromosoom DNA.
    2. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 100 ui HBSS vol.
    3. In elke overeenkomstige FACS buis, voeg een van de volgende antilichamen: anti-muis CD19-PE 1:40 verdunning, anti-muis CD11b-APC-CY7 1:80 verdunning, anti-muis PDCA-1-FITC 1:40 verdunning of anti-muis B220-V500 1:40 verdund zoals aanbevolen door de manufacturer. Laat de 5 e (DAPI) en 6e (ongekleurd) FACS buizen zoals ze zijn. Meng goed door schudden en incubeer de FACS buisjes op ijs in het donker gedurende 15 min.
    4. Na incubatie wordt 4 ml ijskoud HBSS-full in elke buis en centrifugeer de FACS buizen bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C.
    5. Na centrifugatie, zuig de supernatant en resuspendeer de celpellet in 500 ul ijskoud HBSS vol behalve de pellet in de buis gemerkte DAPI, welke wordt geresuspendeerd in 500 pi FACS beladingsoplossing. Het houden van alle 6 buizen op ijs in het donker totdat het sorteren.

6. sorteren op de Cell Sorter

LET OP: De werking van het sorteren procedure op de cytometer en de software is gestandaardiseerd met een gedetailleerde instructies geleverd door het bedrijf. In het kort, maken we gebruik van 100 micron nozzle bij 20 psi, stelt doelcel concentratie tussen 5-10000000 per ml, en efficiëntie aan te passen tot 70% of hoger (dat wil zeggen, conflicten gehouden onder 30%).

  1. Bereid collectie FACS buizen met 500 ul FBS / buis met 100 U / ml penicilline-streptomycine.
  2. Pas compensatie parameters van de cel sorter met behulp van single-vlek compensatie buizen uit stap 5.2.
    1. Noteer 10.000 cellen in ongekleurd buis negatieve gate te stellen voor elke fluorescentie-intensiteit.
    2. Noteer 10.000 cellen in andere vergoeding single-vlek buizen om positieve gate te stellen voor elke fluorescentie-intensiteit.
      NB: De software berekent automatisch de compensatie parameters.
  3. Met een monster van stap 5.1 tot de poorten van de gesorteerde celpopulaties ingesteld door registratie 3000 cellen. Middels fluorescentie-intensiteit als parameters X en Y-as grafiek poort doelwitcelpopulatie handmatig een groep punten kennelijk gescheiden van andere punten.
    LET OP: Deze venstertijd set is flexibel en willekeurig op basis van de eisen van de onderzoekers. Als onderzoekers verwachten hogere zuiverheid op basis van één of meer markers, verplaats de gatehoger gebaseerd op de bijbehorende fluorescentie-intensiteit.
  4. Laad een verzameling buis en beginnen met de doelcel populatie sorteren.
  5. Houd de collectie buis op ijs na sortering totdat alle monsterbuizen worden gedaan.
  6. Voeg ijskoud C10 aan de collectie buis tot 4 ml, cap en zwenken om te mengen.
  7. Centrifugeer de verzamelbuis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C, en zuig de supernatant, waardoor ongeveer 200 pi met celpellet onaangeroerd.
  8. Voeg 1 ml ijskoud C10 aan de cel pellet te resuspenderen en de overdracht van alle celsuspensie in een 1,5 ml centrifugebuis.
  9. Centrifugeer de 1,5 ml buis bij 800 g gedurende 5 min, 4 ° C en zuig de supernatant, waardoor 100 pi met de celpellet onaangeroerd.
  10. Bewaar de gesorteerde celpopulaties op ijs tot gebruik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We gericht op het verrijken van beenmerg pDC met een hoge zuiverheid, en zonder de invloed van andere celtypen, van MRL / lpr lupus vatbaar voor muizen van jong en oud leeftijd om de functionele veranderingen van pDC met betrekking tot hun vermogen om IFNa produceren studeren. De eerste zuiveringsstrategie gebruikt was MCS, die zoals figuur 1 toont, leidde tot slechts 7,75% zuiverheid na de verrijking. Vergeleken met MCS, FACS verrijkt pDC met zuiverheid zo hoog als 96,4%. Om een ​​hoge zuiverheid te verzekeren, werd een stap-voor-stap gating strategie uitgevoerd. Zoals getoond in figuur 2, werden mononucleaire cellen afgesloten en afgescheiden van afval door voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) parameters. Het gebruik van FSC-breedte (FSC-W) vs. FSC-hoogte (FSC-H) en SSC-W vs. SSC-H, werden enkele cellen gated om de valse positieve signalen geproduceerd door aggregaten te voorkomen. Levende enkele cellen werden vervolgens afgesloten als DAPI - populatie (DAPI + cellen zijn dood of apoptotische).Live enkele cellen, CD 11 c + CD11b - populatie werd afgesloten, waaruit B220 + PDCA-1 + bevolking werd verder afgesloten als pDC. De gesorteerde pDC waren niet alleen van hoge zuiverheid, maar ook functioneel normaal. Ze had de mogelijkheid om IFNa in vitro na CpG stimulatie te produceren zoals getoond in figuur 3 (Re-druk met toestemming van onze eerdere publicatie 17.

Figuur 1
Figuur 1. De zuiverheid van pDC gesorteerde zowel via MCS en FACS werkwijze Representatieve doorstroomcytometrie gegevens die het percentage pDC (CD 11 c + CD11b - B220 + PDCA-1 +). In gesorteerde cellen door MCS (boven) en FACS (bodem), respectievelijk. De CD 11 c + CD11b - populatie werd afgesloten van de totale levende cellen (links), en vervolgens pDC als B220 + PDCA-1 + Cellen werden afgesloten binnen de CD 11 c + CD11b -. Populatie (rechts) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Strategie voor Gating pDC verrijking door FACS Een stap-voor-stap gating strategie in deze volgorde:. Mononucleaire cellen enkele cellen FSC, SSC tot enkele cellen te DAPI - levende cellen, te CD11c + CD11b -, en B220 + PDCA-1 + live pDC. pDC in totaal enkele cellen is 2,95 ± 1,42%; naargelang pDC nummer is 0,88 ± 0,28 x 10 5 per muis met een recovery rate rond de 50%. (N = 12 MRL / lpr-muizen, worden de gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD van 95% betrouwbaarheidsinterval van het gemiddelde). 641fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
. Figuur 3. IFNa productie door FACS gesorteerde pDC gesorteerde beenmerg pDC werden behandeld met klasse A CpG (ODN1585; 5 uM) gedurende 6 uur in vitro. In de figuur, "y" staat voor jongere, 6 weken oude muizen; "O" staat voor jonge, 16-weken oude muizen. MRL staat voor MRL muizen als gezonde controle muizen; lpr staat voor MRL / pr muizen als lupus-vatbaar muizen. De concentratie van IFNa in het kweeksupernatant werd gemeten met ELISA. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, eenzijdige ANOVA. De gegevens worden getoond als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (n = 3 muizen per groep). Dit cijfer is overgenomen uit onze publicatie in Journal of Immunology met toestemming. 17Pbelasting / 54641 / 54641fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum HyClone SH30396.03
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine  gibco by life technologies 25030-164
Penicillin-Streptomycin gibco by life technologies 15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution  gibco by life technologies 14175-079
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MgCl2 SIGMA M8266
DNase I SIGMA D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer  eBioscience 00-4300-54
Density gradient medium GE Healthcare 17-1440-02 Ficoll-Paque Plus 
anti-mouse CD19-PE BD Pharmingen 553786
anti-mouse CD11c-PE eBioscience 12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7 BD Pharmingen 557657
anti-mouse PDCA-1-FITC eBioscience 11-3172-81
anti-mouse B220-V500  BD Pharmingen 561226
DAPI invitrogen D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi Biotec 130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer  BD Biosciences 643178
BD FACS Diva version 6 BD Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  3. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  4. Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
  5. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  6. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).
  7. Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
  8. Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
  9. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
  10. Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
  11. Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
  12. Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959 (2015).
  13. Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
  14. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
  15. Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
  16. Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
  17. Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724 (2015).

Tags

Immunologie FACS muis beenmerg plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) IFNa lupus
Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liao, X., Makris, M., Luo, X. M.… More

Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow. J. Vis. Exp. (117), e54641, doi:10.3791/54641 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter