Summary
우리는 PDC의 기능 연구를위한 루푸스 발생하기 쉬운 마우스의 골수로부터 고순도 형질 수지상 세포 (PDC)를 분리 정렬 형광 활성화 된 세포를 사용하여 프로토콜을보고합니다.
Protocol
참고 : MRL / MP-의 Fas의 LPR 루푸스 발생하기 쉬운 쥐 사육과 버지니아 공대 (동물 복지 보증 번호에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 요구 사항에 다음과 같은 특정 병원균이없는 시설에서 유지되었다 (MRL / LPR) : A3208-01). 이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 모든 동물 실험은 IACUC 프로토콜 # 12-062 하에서 수행 하였다.
1. 세포 배양 매체 및 정렬 버퍼
- 완전한 세포 배지 (C10)를 10 % 소 태아 혈청, 1 mM 피루브산 나트륨, 1 내지 100 % MEM 비 필수 아미노산, 10 mM의 HEPES, 55 μM 2- 머 캅토 에탄올, 2 mM L- 글루타민 및 보충 된 RPMI 1640을 사용하여 준비 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신.
- 정렬 버퍼를 준비 된 10 mM HEPES가 보충 1X 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)를 사용하여 (가득 HBSS) 2.5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민0.05 밀리미터의 MgCl 2, 0.2 U / ㎖ DNase의 I.
2. 마우스 해부
- 4 ML의 C10를 포함하는 두 개의 6 cm 직경 요리를 준비합니다. 얼음에 요리를 놓습니다.
- CO 2 흡입 마우스를 안락사.
- 비장을 수확하고 얼음에 C10와 함께 접시에 보관합니다.
- 해부 접시에 직면하고있는 배와 마우스를 아래로 핀. 70 % 에탄올을 분무하여 몸을 소독.
- 피부를 잘라 아래 목의 치골에서 복부 정중선을 따라 근육 벽에서 피부를 분리합니다.
- 발목의 첫 번째 절개에서 뒷다리를 따라 피부를 잘라.
- 다시 측면에있는 피부를 핀과 다이어프램하는 최초의 절개 곳에서 측면을 따라 근육 벽을 잘라.
- 헤드의 우측에 근육 벽 위로 고정.
- 소장 하부 위장 옆 마우스의 오른쪽에 비장을 찾아. 일의 한쪽 끝을 픽업전자 비장과 위장에서 분리.
- 대퇴골과 경골을 포함, 모두 뒷다리를 잘라하고, 가능한 한 많은 모든 근육을 제거합니다.
- 혈관을 피하기 위해 노력하고, 날카로운 가위로 발목 골반 / 고관절에서 뒷다리를 따라 근육을 잘라.
- 골수 콘텐츠의 노출없이 골반 / 고관절 발목 / 발 관절 절단하여 뒷다리를 분리한다.
- 반복적 면도날 긁 접합 지점에서 근육을 절단함으로써 뼈 깨끗 나머지 근육.
- 얼음에 4 ML의 C10을 포함하는 6cm 접시에 뼈를 유지합니다. 다음 마우스를 해부를 진행합니다.
3. 비장 격리
- 더 레드 조각을 볼 수 없을 때까지 4 ML의 C10를 포함하는 접시의 상단에 70 μm의 셀 스트레이너에 대한 주사기 플런저 부드럽게 비장을 균질화.
- 스트레이너 관통 접시에 추가 6 ML의 C10 추가ND 후 15ml의 원뿔형 튜브에 총 10 ml의 세포 현탁액을 전송.
- 5 분, 4 °에 C 800 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 2 ㎖의 1 × 적혈구 (RBC) 용해 완충액에서 세포 펠렛을 재현 탁. 5 분 동안 실온에서 인큐베이션.
- 배양 후, 5 분, 4 °에 C 800 XG에서 원뿔 튜브를 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 한 ML C10에서 세포 펠렛을 재현 탁. 어떤 큰 덩어리 (죽은 세포)를 취소하고 나중에 얼음에 튜브를 유지.
주 : 많은 작은 덩어리가있는 경우, 일단 세포 현탁액을 필터링하기 위해 70 μm의 세포 여과기를 사용한다. - 자동 세포 계수기를 사용하여 트리 판 블루로 세포 수를 계산.
4. 골수 세포 분리
- 박격포로 4 ML의 C10과 뼈를 전송하고 총 10 ML의 C10의 볼륨을 만들기 위해 6 ML의 C10을 추가합니다.
- AP를 이용하여 모르타르에서 가볍게 뼈 균열estle.
- C10에 골수를 해제 유봉으로 가볍게 저어.
- 70 μm의 세포 여과기를 통해 얼음에 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 골수를 함유하는 10 ㎖의 C10 전송. 아직 뼈가 포함 된 박격포에 10 ml의 신선한 C10을 추가합니다.
주 : 피펫 붉은 덩어리가 표시하는 경우 여과기를 통과하기 전에 골수 위아래로 수회 함유 용액. - 반복 두 번 4.4-4.2 단계를 반복합니다. 마지막 세척 후, 뼈 흰색 나타납니다.
- 5 분, 4 °에 C 800 XG에 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기. 한편, 실온에서 15 ml의 원추형 원심 분리 튜브에 5 ㎖를 즉시 사용 가능한 밀도 구배 매질을 제조.
- 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 10 ㎖의 C10에서 세포 펠렛을 재현 탁.
- 천천히 두 단계 들간의 인터페이스를 유지하면서 5 ml의 밀도 구배 매체의 상부에 10 ml의 세포 현탁액을 층을 포함한다. 그런 다음 30 분에 대한 1,363g에서 15 ML 원뿔 튜브를 원심 분리0 (또는 브레이크 OFF)로 설정 가속 9로 설정하고 감속와 RT (20 ° C).
- 원심 분리 한 후 조심스럽게 가기 8 mL의 용액을 제거하고 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 인터페이스 (단핵 세포 층)의 2 mL의 버피 코트를 수집한다.
- 골수 단핵 세포, 캡을 포함하는 15 ML 원뿔 관에 12 ml의 차가운 얼음 C10을 추가 한 다음, 잘 혼합 10 분, 4 °에 C 800 XG에서 튜브를 원심 분리기 여러 번 반전.
FACS 5. 세포 표면 염색
- 샘플 염색
- 항 - 마우스 CD16 / 32 항체 용액 (에서 1-100 희석 HBSS - 전체 / ml의 최종 농도 5 μg의)를 준비합니다.
- 단계 4.10의 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고, 단핵 세포상의 Fc 수용체를 차단하기 위해 100 ㎕의 항 - 마우스 CD16 / 32 항체 용액 중에 세포 펠렛을 재현 탁. 10 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
- (개미 형광 - 복합 항체 혼합물을 준비내가 마우스의 CD11c-PE 1시 40분 희석, 항 - 마우스 CD11b를-APC-CY7 1:80 희석, 항 - 마우스 PDCA-1-FITC 1시 40분 희석 및 항 마우스 B220-V500 HBSS-에서 1시 40분 희석 샘플 당 100 ㎕의 최종 부피)의 제조업체에서 권장 전체.
참고 : 사용하기 전에 항체를 적정하는 것이 중요하다. - 단계 5.1.2에서 10 분 배양 한 후, 항 마우스 CD16 / 32 언 바운드 제거하기 위해 5 분, 4 ° C 800 XG에 4 ml의 얼음 차가운 HBSS - 전체와 원심 분리기를 추가합니다.
- 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 100 ㎕의 형광 접합 된 항체 혼합물의 세포 펠렛을 재현 탁. 어둠 속에서 15 분 동안 빙상에서 인큐베이션.
- 15 분 부화 후, 언 바운드 형광 복합 항체를 제거하는 5 분, 4 ° C 800 XG에 4 ml의 얼음 차가운 HBSS - 전체와 원심 분리기를 추가합니다.
- FACS 로딩 솔루션 (HBSS-전체 500 NG / ㎖ DAPI)를 준비합니다.
- 단계 5.1.6에서 원심 분리 후, 상층 액을 대기음 500 μ의 세포 펠렛을 재현 탁; 리터 FACS 로딩 솔루션입니다. 12 X 75mm 둥근 바닥 튜브 (FACS 튜브)에 세포 현탁액을 전송하고 1 시간 내에 정렬 될 때까지 어둠 속에서 얼음에 튜브를 유지.
- 보상 염색
- PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI 또는 염색 등의 레이블 6 FACS 튜브. 1 × 10 6 세포 /를 FACS 튜브에 튜브 및에서 나누어지는 비장 세포는 5 분, 4 °에 C 800 XG에 4 ml의 HBSS - 전체 씻어.
주 : 사용 사균의 생균을 구별하는 형광 염료, DAPI를 DNA 결합. DAPI는 죽은 세포의 세포막 (그러나 살아있는 세포) 및 바인드 염색체 DNA를 통과 할 수 있습니다. - 뜨는을 대기음, 100 μl의 HBSS-전체에서 세포 펠렛을 resuspend.
- 항 - 마우스 CD19-PE 1시 40분 희석, 항 - 마우스 CD11b를-APC-CY7 1:80 희석 항 마우스 PDCA -1- FITC 1시 40분 희석 또는 각각 대응 FACS 튜브 내의 다음 항체 중 하나를 추가 manufa의 권장 방지 마우스 B220-V500 1시 40분 희석cturer. 그대로 5 일 (DAPI)과 6 일 (흠) FACS 튜브를 남겨주세요. 흔들어 잘 혼합하고 15 분 동안 어둠 속에서 얼음에 모든 FACS 튜브를 품어.
- 배양 후, 5 분, 4 ° C 800 XG에서 각 튜브와 원심 분리기에 FACS 튜브를 4 ml의 차가운 얼음 HBSS-전체를 추가합니다.
- 원심 분리 후, 상층 액을 대기음, 500 μl의 얼음에있는 세포 펠렛을 500 ㎕의 FACS로드 용액에 재현 탁 DAPI 표시된 튜브에 펠렛을 제외하고 차가운 HBSS-전체를 재현 탁. 정렬 될 때까지 어둠 속에서 얼음에 모두 6 튜브를 유지.
- PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI 또는 염색 등의 레이블 6 FACS 튜브. 1 × 10 6 세포 /를 FACS 튜브에 튜브 및에서 나누어지는 비장 세포는 5 분, 4 °에 C 800 XG에 4 ml의 HBSS - 전체 씻어.
6. 셀 분류기에 정렬
주 : 사이토와 소프트웨어 절차를 정렬하는 동작은, 회사가 제공하는 구체적인 명령으로 표준화된다. 간단히 말해서, 우리는 20 psi에서 100 미크론 노즐, 5 사이의 설정 대상 셀 농도 사용 - ml의 당 10 만, 70 % 이상으로 효율을 조정 (즉, 충돌 30 아래에 보관%).
- 100 U / ㎖ 페니실린 - 스트렙토 마이신이 포함 된 500 μL의 FBS / 튜브 수집 FACS 튜브를 준비합니다.
- 단계 5.2에서 단일 얼룩 보정 튜브를 이용한 셀 소터의 보정 파라미터를 조정한다.
- 각각의 형광 강도에 대한 부정적인 게이트를 설정 흠 튜브 만 셀을 기록합니다.
- 각각의 형광 강도에 대한 긍정적 인 게이트를 설정하는 다른 단일 얼룩 보상 튜브 만 셀을 기록합니다.
주 : 소프트웨어가 자동으로 보정 파라미터를 계산합니다.
- 3,000 셀을 기록하여 정렬 된 세포 집단의 게이트를 설정하는 단계 5.1에서 하나의 샘플을 사용합니다. 수동 분명히 다른 점에서 분리 점 그룹으로 X 및 Y 축 그래프 게이트 표적 세포 집단의 파라미터 형광 강도 사용.
참고 :이 게이팅 세트는 연구자의 요구 사항에 따라 유연하고 임의이다. 연구자들은 하나 이상의 마커에 기초하여 높은 순도를 기대하는 경우, 게이트 이동높은 대응하는 형광 강도에 따라. - 컬렉션 튜브를로드하고 대상 세포 인구를 정렬 시작합니다.
- 모든 샘플 튜브가 완료 될 때까지 정렬 한 후 얼음에 포집 관을 유지합니다.
- 4 ml의, 모자까지 포집 관에 얼음 감기의 C10을 추가하고 혼합하는 반전.
- 5 분, 4 ° C 800 XG에서 수집 튜브를 원심 분리기, 다음의 손길이 닿지 않은 세포 펠렛으로 약 200 μl를 떠나, 뜨는을 대기음.
- 세포 펠렛을 재현 탁하고, 1.5 ml의 원심 분리 관에 모든 세포 현탁액을 전송하기 위해 1 ml의 얼음 추위에 C10을 추가합니다.
- 원심 분리기의 손길이 닿지 않은 세포 펠렛 100 μl를 떠나는 1.5 ML의 5 분, 4 ° C 800 XG에 튜브와 뜨는을 대기음.
- 사용할 때까지 얼음에 정렬 된 세포 집단을 저장합니다.
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Representative Results
우리는 높은 순도 골수 PDC를 풍부하게하는 것을 목표로하고 IFNα를 생산하는 능력에 대한 PDC의 기능 변화를 연구하는 젊은이와 노인 모두의 MRL / LPR의 루푸스 발생하기 쉬운 마우스에서 다른 세포 유형의 영향없이. 사용 된 첫 번째 정제 전략은 그림 1과 같이 농축 후 만 7.75 % 순도 주도, MCS했다. MCS에 비해 FACS은 96.4 %로 높은 순도의 PDC 농후. 높은 순도를 보장하기 위해, 단계적으로 게이팅 전략을 수행 하였다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 단핵 세포 게이트 전방 산란 (FSC) 및 측면 스 캐터 (SSC) 파라미터에 의해 먼지로부터 분리 하였다. FSC 폭 (FSC-W) FSC 높이 대 (FSC-H) 및 SSC-H 대 SSC-W를 사용하여 단일 세포 집합체에 의해 생성 된 거짓 양성 신호를 방지하기 위해 게이트 하였다. 라이브 하나의 세포가 다음 DAPI로 문이되었다 - 인구 (DAPI + 세포가 죽은 또는 세포 사멸).살아있는 단일 세포에서의 CD11c + CD11b를 - 인구는있는 B220은 + PDCA-1 + 인구가 더 PDC로 게이트 된, 게이트했다. 정렬 된 PDC는 높은 순도뿐만 아니라 기능적으로 정상뿐만 아니라이었다. 이들은도 3 (이전 출판 (17)으로부터 허가 재 인쇄에 도시 된 CpG 자극에 따라 시험 관내에서 IFNα를 생성하는 능력을 가졌다.
그림 1. MCS 및 FACS 방법 PDC의 비율 (중 CD11c + CD11b를 - B220 + PDCA-1 +)를 보여주는 수치 세포 계측법 대표 흐름 중 하나를 통해 PDC 정렬 된의 순도. MCS (위)와 FACS (아래)으로 분류 세포를, 각기. 의 CD11c + CD11b를 - 인구는 B220 + PDCA-1과 총 살아있는 세포 (왼쪽), 다음 PDC에서 게이트했다 + 세포가하는 CD11c + CD11b를 내 문이되었다 -. 인구 (오른쪽) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 게이팅 FACS에 의해 PDC 보충을위한 전략은 다음과 같은 순서로 단계별 게이팅 전략 :. FSC, 하나의 세포에 SSC, DAPI에 하나의 셀에 단핵 세포 - 라이브 세포 중 CD11c + CD11b를에 -, 그리고에 B220 + PDCA-1 + 라이브 PDC로. 총 단일 세포에서 PDC는 2.95 ± 1.42 %이다 정렬 PDC 번호 회수율 50 %의 마우스 당 0.88 ± 0.28 × 105이다. (N = 12 MRL / 마우스 lpr의 데이터가 평균의 평균 ± SD 95 %의 CI로 표시됩니다). 641fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. FACS 분류 된 PDC에 의해 그림 3. IFNα 생산 정렬 된 골수 PDC는 A 급의 CpG 처리 하였다 (ODN1585 5 μM)를 체외에서 6 시간 동안. 그림에서 "Y"는 젊은, 6 주령 생쥐을 나타내며, "오"는 나이, 16 주령의 마우스를 의미합니다. MRL은 MRL 마우스로 건강한 대조군을 나타내며, LPR은 루푸스가 발생하기 쉬운 쥐 같은 MRL / LPR 마우스를 의미합니다. 배양 상청액에서 IFNα의 농도는 ELISA로 측정 하였다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, 일방향 ANOVA. 데이터는 평균 ±에게 평균 (그룹 당 N = 3 마우스)의 표준 오차를 표시됩니다. 이 수치는 권한이있는 면역학 저널에 우리의 출판물에서 재생된다. (17)PLOAD / 54641 / 54641fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30396.03 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| 1x Hank’s Balanced Salt Solution | gibco by life technologies | 14175-079 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Density gradient medium | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| anti-mouse CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| anti-mouse CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| anti-mouse CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| anti-mouse PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| anti-mouse B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I flow cytometer | BD Biosciences | 643178 | |
| BD FACS Diva version 6 | BD Biosciences |
References
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